范立民，王 慶，陳 曦，裘麗萍，孟順龍，宋 超，蘇永騰，胡庚東，陳家長

（1中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081；2南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇無錫 214081；3無錫中糧工程科技有限公司，江蘇無錫 214062；4江蘇溢薈生物技術(shù)有限公司，南京 211225）

0 引言

浮床空心菜種植對水質(zhì)的凈化能力已經(jīng)被很多的研究證明[1-3]，并且和水芹、水龍、生菜等多種其他的植物相比，浮床空心菜還具有相對更好的凈化效果[4]。浮床空心菜種植在羅非魚[5-7]、鯉魚[8-9]、中華絨螯蟹[10]、甲魚[11]、鯽魚[12]、草魚[13]養(yǎng)殖池塘中均表現(xiàn)出了較好的凈化效果。除此以外，浮床空心菜在高原地區(qū)的種植[14]、和其他水生植物的輪作[15]，甚至在尾水凈化實驗中[16-17]均得到了較好的應用。空心菜可以通過從水中吸收氮、磷和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)的方式對水質(zhì)進行凈化；空心菜浮床對水面的遮擋降低了水體的光能量攝入，與營養(yǎng)競爭作用一起會在一定程度上抑制藻類的生長；浮床空心菜對藻類生長的影響和空心菜夜晚的呼吸耗氧會造成水體溶解氧的下降；空心菜盡管可以一定程度上降低水中藻類對空氣中二氧化碳的固定，但是其自身的光合作用所固定的二氧化碳也會經(jīng)新陳代謝后完成向水中的遷移。這些都是浮床空心菜種植在理論上能夠影響水體理化指標的因素，對于影響程度會受到多種因素的影響，包括空心菜生長狀況、種植面積、池塘養(yǎng)殖過程中人為的物質(zhì)和能量輸入輸出狀況等。而具體在什么情況下是以哪種作用為主，目前為止尚缺乏系統(tǒng)性的報道。但是已有的一些研究證明，這些作用都是存在的，都是浮床空心菜影響池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要方式。

另一方面，浮床栽培空心菜對養(yǎng)殖池塘水體微生物狀況影響的也引起了學者們的重視，已有的一些研究表明，浮床栽培空心菜可以一定程度上對系統(tǒng)微生物群落造成影響。已有的一些對空心菜對水中細菌群落多樣性的研究結(jié)果略有不同，有的研究表明空心菜栽培對水中細菌的群落多樣性沒有影響[18]，另一些研究認為其能在一定程度上對池塘細菌多樣性造成影響，但未見其差異顯著性分析結(jié)果[19-20]，筆者以為，這些研究結(jié)果是不矛盾的，差別是由浮床空心菜的覆蓋率和養(yǎng)殖水體自身營養(yǎng)物質(zhì)水平差異等因素造成的。另外，即使在分類多樣性層面或一些細菌分類學水平上未造成顯著性的差異，以功能進行區(qū)分的一些微生物群落的相對豐度或多樣性可能已經(jīng)在發(fā)生一些變化了。因為作為養(yǎng)殖池塘物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要驅(qū)動力，微生物功能多樣性的變化是水體理化狀況變化的重要生物學基礎。有研究表明，水中栽培空心菜可以增加水體微生物的數(shù)量，促進水體氮循環(huán)[21]。不僅如此，浮床空心菜還有利于促進水中脫氮細菌直接的穩(wěn)定生長[22]，包括改變不同種類氮循環(huán)細菌在生態(tài)系統(tǒng)中的分布狀況[23]。與此同時，作為一種生物附著基，空心菜根系在養(yǎng)殖池塘水體總同樣會附著一些根際微生物群落，形成生物膜來發(fā)揮作用。因此，即使其沒有對所在水體微生物組成造成顯著影響，但是通過增加單位面積水體功能性微生物的相對豐度，空心菜根系同樣會發(fā)揮除直接吸收營養(yǎng)物質(zhì)之外的功能。已有研究表明，浮床空心菜根際微生物在不同富營養(yǎng)程度水體中會發(fā)揮不同程度的營養(yǎng)物質(zhì)分解凈化的功能[24]，但是其他促進營養(yǎng)物質(zhì)向水體中轉(zhuǎn)移的能力是否也同時有變化還未見報道。另外，總體而言，浮床空心菜對養(yǎng)殖水體微生物群落的影響相對還較少，還需要從不同角度積累更多的報道，從而更加系統(tǒng)化和精細化完善浮床空心菜、乃至其他浮床生物在水質(zhì)凈化中的基礎數(shù)據(jù)。

本研究擬從浮床空心菜根際細菌群落和水中細菌群落之間相互作用的角度來分析其對水中細菌群落的影響，從浮床空心菜對單位面積養(yǎng)殖水體固氮酶基因豐度增加量的角度來分析其是否在發(fā)揮氮移出的同時可能會促進空氣中氮素向養(yǎng)殖水體的輸入，進而來綜合分析浮床栽培空心菜對養(yǎng)殖池塘水體微生態(tài)環(huán)境的影響，為有關研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集的6口養(yǎng)殖池塘位于中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭養(yǎng)殖基地。每口面積約為1330 m2，初期水深約0.7 m，7月上旬加水至約2 m。養(yǎng)殖所用吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)魚苗由養(yǎng)殖基地自己繁殖（5月上中上旬），2015年5月20日放苗，放養(yǎng)密度為2.6尾/m2。其中3口試驗塘為對照塘，只進行羅非魚養(yǎng)殖.在另3口試驗塘中浮床種植空心菜(Ipomoea aquatica)，浮床投放時間為2015年6月上旬。浮床制作選用PVC管材料(φ=50 mm)，規(guī)格為2 m×2 m。在浮床上用尼龍繩系住網(wǎng)孔直徑為30 mm的網(wǎng)片，用于插播空心菜。插種時，將空心菜菜秧去葉，剪成10 cm左右且?guī)в幸秆炕蝽斞康男《危瑢?個這樣的小段植入一個網(wǎng)孔中按株行距20 cm×20 cm進行扦插。將浮床用尼龍繩連接固定。種養(yǎng)面積占池塘總面積10%左右。養(yǎng)殖期間對照組塘和試驗組塘的日常管理一致，期間不換水。

分別于2015年7月和8月下旬進行樣品的采集。水樣采集自水面下深度0.01 m處（約與空心菜根系長出后同一深度范圍），沿池塘矩形長邊方向中線均勻設點，對照塘和處理塘采樣點布設見圖1。將相同池塘三個點水樣等比例均勻混勻后，作為該池塘該次樣品，100 mL混合水樣經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，濾膜放置2 mL滅菌離心管后浸于液氮罐中短暫處理，然后放于-80℃超低溫冰箱中備用。3口對照塘7月得到的3個濾膜樣品命名為W11、W12、W13，8月份得到的樣品分別命名為W21、W22、W23。與之對應的3口處理塘得到的濾膜樣品分別命名為RW11、RW12、RW13、RW21、RW22、RW23。采集1 g空心菜根部樣品，放入100 mL滅菌重蒸水中，置于搖床上500 rpm震蕩10 min，將100ml震蕩過的水同樣用0.22 μm孔徑的水相微孔濾膜過濾，將過濾完的濾膜放于滅菌離心管中后，置于-80℃超低溫冰箱中備用。3口處理塘兩次得到的根系濾膜樣品分別命名為R11、R12、R13、R21、R22、R23。

圖1 池塘采樣點布設示意圖

1.2 水質(zhì)分析

采用分光光度法測定水中氨氮(NH3-N)和亞硝酸鹽氮(NO2-N)濃度；采用有機碳分析儀(GE SieversInnovOx Laboratory TOC Analyzer)測定水中總有機碳(TOC)、總碳(TC)、無機碳(IC)濃度；采用過硫酸鉀氧化法測定水中總磷(TP)和總氮(TN)濃度；采用酸性高錳酸鉀氧化法測定水中高錳酸鹽指數(shù)COD mn。

1.3 樣品DNA的提取和純化

采用PowerWater DNA Isolation Kit（MO BIO，美國）進行水樣總DNA的提取，采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO，美國）進行根系總DNA的提取；采用Mobio PowerClean DNA Clean-Up Kit進行提取到的DNA的純化；采用瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測純化后的DNA樣品。

1.4 細菌16S rRNA基因的擴增及高通量分析

采用帶有barcode（標簽）的特異引物（引物序列為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），擴 增 細 菌 16S rRNA基因V3～V5可變區(qū)；擴增體系包括（終體積20 μL）：10 ng模板DNA，2 μL 2.5 mM dNTPs，4 μL 5×FastPfu buffer（TransGen Biotech，中 國 ），0.4 μL FastPfu polymerase（TransGen Biotech，中國）和正反引物各0.8 μL(5 μM)；采用ABI GeneAmp? 9700型基因擴增儀進行PCR擴增，擴增程序參照文獻[25]。采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）回收擴增產(chǎn)物，采用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行定量。采用Illumina MiSeq PE300平臺對產(chǎn)物進行高通量測序（由上海美吉生物有限公司完成）。

1.5 數(shù)據(jù)優(yōu)化

參照文獻[26]的標準進行數(shù)據(jù)優(yōu)化和質(zhì)控。

1.6 生物信息學分析

采用Usearch(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)軟件序列進行可操作性分類單元OTU(operational taxonomic unit)的聚類分析（97%相似度水平）；采用Qiime(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)軟件、RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析（silva數(shù)據(jù)庫、97%相似度水平）。

1.7 nifH基因的熒光定量分析

采用ABI 7500熒光定量PCR儀（美國），使用SYBRGreen Real-Time PCR試劑盒(ABI Power SybrGreen qPCR Master Mix(2X))，采用 SYBRGreen Ⅰ法熒光定量分析細菌nifH基因拷貝數(shù)。引物序列為 nifH-1F：5'-AAAGGCGGAATCGGCAAGTC-3'和nifH-2R：5'-TTGTTCGCGGCGTACATG-3'。

為了計算空心菜根系對單位體積水體中固氮酶nifH基因拷貝數(shù)的貢獻量，在2次采樣時同時隨機采集并測量浮床下50根空心菜根系的長度和重量，計算根系的平均長度和平均重量，然后根據(jù)每個浮床所種植的空心菜的數(shù)量估算空心菜根系在采樣時對其所占據(jù)水體單位體積貢獻的固氮酶nifH基因拷貝數(shù)。計算見公式(1)。

其中RnifH：空心菜根系對所占據(jù)單位體積水體固氮酶nifH基因拷貝數(shù)，單位Copies/mL；Q：1 g空心菜根系所得到濾膜樣品固氮酶nifH基因拷貝數(shù)，單位Copies/g；Ga：每株空心菜根系的平均重量，單位g：空心菜的平均長度，單位m。

2 結(jié)果與分析

2.1 浮床空心菜種植對“門”水平細菌群落在羅非魚養(yǎng)殖池塘水體中分布的影響

通過對包括水樣和根系樣品在內(nèi)的18個樣品的高通量測序及分析，本次試驗共得到554700條有效序列，序列平均長度為438.88 bp。這些序列可以歸納為1741個OTUs(Operational Taxonomic Units（)圖2(a)），其中空心菜根系(R)中1440個OTUs，空心菜栽培池塘水(RW)中 1264 個 OTUs，對照塘水(W)中 1205 個OTUs。

采用Venn圖2(a)分析對照塘水、空心菜栽培池塘水和空心菜根系OTUs數(shù)量的關系，結(jié)果表明，空心菜根系中獨有的OTUs有385個，占總OTUs的22.11%，空心菜栽培塘水和對照塘水中獨有的OTUs均只有10個，分別占總OTUs的0.57%，表明空心菜根系上附著的細菌組成與其所在的塘水間具有明顯的區(qū)別。對基質(zhì)間共有OTUs的分析表明，3種基質(zhì)間兩兩共有OTUs占總OTUs的百分比分別為64.04%(RW/W)，61.74%(R/RW)和58.36%(R/W)，單因素方差分析表明空心菜根系中的OTUs顯著多于塘水中(p＜0.05)，但空心菜栽培并沒有對池塘水體中細菌的OTUs數(shù)量造成影響(p＞0.05)。

測序得到的這些OTUs則可以歸納為37個門(phyla)或 組(groups)。 圖 2(b)顯 示 ，變 形 菌 門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)在空心菜根系及空心菜栽培塘和對照塘水中均具有相對較高的豐度。對這5個門在這3種基質(zhì)中的的相對豐度進行對比表明，硬壁菌門(Firmicutes)的相對豐度在3種基質(zhì)中的相對豐度無顯著差異(p＞0.05（)根系：12.55%±16.13%，浮床栽培塘水：14.49%±7.72%，對照塘水：8.61%±5.44%，變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度均表現(xiàn)為根系中與2種塘水中的差異顯著(p＜0.05)，而對照塘和處理塘水間的差異不顯著(p＞0.05)。其中變形菌門(Proteobacteria)（根系：47.00%±6.21%，浮床栽培塘水：25.53%±7.53%），對照塘水：20.89%±4.67%）和擬桿菌門(Bacteroidetes)（根系：13.73%±4.41%，浮床栽培塘水：8.35%±1.29%），對照塘水：8.18%±1.41%）在根系中具有較高的相對豐度，藍細菌門(Cyanobacteria)（根系：13.66%±7.00%，浮床栽培塘水：25.08%±10.28%），對照塘水：30.19%±10.04%）和放線菌門(Actinobacteria)（根系：1.50%±0.52%，浮床栽培塘水：11.69%±1.72%），對照塘水：12.35%±2.18%）在水中具有較高的相對豐度。

以上結(jié)果表明空心菜根系具有明顯的細菌群落選擇性，但試驗條件下其沒有對水中主要的細菌群落組成在門水平造成顯著的影響。

2.2 空心菜根系和水中細菌群落及關系

2.1 的分析表明，無論是OTU數(shù)量還是“門”水平的群落組成，在空心菜根系和所在池塘水中之間均存在著顯著差別。我們希望進一步分析這些差別。圖2(c)顯示了“綱”水平的空心菜根系獨有的細菌群落組成，獨有OTU平均相對豐度占總平均相對豐度的10.25%，這些“綱”水平細菌群落組成主要包括Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria、Alphaproteobact eria、Betaproteobacteria、Cytophagia、Gammaproteobact eria和 Flavobacteriia等 ，其 中 Sphingobacteriia、Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria是優(yōu)勢菌群。對空心菜根系和所在池塘水中共有細菌群落分析表明，有140個OTU的相對豐度在空心菜根系上顯著上調(diào)（占共有OTU豐度的30.5%），有149個OTU的相對豐度在空心菜根系上顯著下調(diào)（占共有OTU豐度的3.3%）（圖2(d)），表明空心菜根系對水中的相當一部分浮游細菌存在著較強的選擇性富集作用。同樣，在“綱”水平對這些共有菌群進行分析，結(jié)果表明（圖2(e)），空心菜根系對Betaproteobacteria的富集能力相對較強，而對Actinobacteria的相對豐度顯示出“下調(diào)”作用。藍細菌綱在水中具有最高的相對豐度，在空心菜根系相對豐度出現(xiàn)明顯的下降，但是仍然是其主要細菌組分之一。

圖2 水和空心菜根系細菌OTU及群落組成情況

2.3 空心菜種植對池塘水體浮游細菌群落α多樣性的影響

對來自3中基質(zhì)的細菌群落Ace（圖3(a)）豐富度指數(shù)及多樣性指數(shù)Shannon（圖3(b)）進行分析表明，空心菜根系、空心菜種植塘水中和對照塘水中細菌群落豐富度指數(shù)Ace平均分別為1195.33、947.83和914，多樣性指數(shù)Shannon平均分別為5.25、4.89和4.94。空心菜根系細菌豐富度指數(shù)Ace的值顯著高于空心菜所在塘水和對照塘水(p＜0.05)，但空心菜種植塘水和對照塘水間細菌豐富度指數(shù)Ace差異不顯著(p＞0.05)；空心菜根系細菌多樣性指數(shù)Shannon的值雖然略高于空心菜所在塘水和對照塘水，三者之間細菌豐富度指數(shù)Ace差異均不顯著(p＞0.05)。

圖3 不同基質(zhì)的豐富度和多樣性指數(shù)

2.4 空心菜種植對池塘水體浮游細菌群落β多樣性的影響

對所有樣品測序所得到的OTUs進行NMDS分析（圖4），結(jié)果表明空心菜根系樣品中的細菌群落和池塘水中細菌群落具有較大差異；無論是空心菜根系中的細菌群落還是池塘水中的細菌群落均隨著時間的變化有產(chǎn)生變化的趨勢。為了進一步驗證這些差異的顯著性水平，筆者分別對不同分組樣品進行ANOSIM分析，結(jié)果顯示空心菜種植池塘的細菌群落和對照塘的細菌群落之間差異不顯著(R=0.628，P=0.47)，空心菜根際細菌群落與空心菜種植塘以及與對照塘細菌群落之間均差異顯著（均為R=0.628，P=0.002）；池塘水中細菌群落（包括空心菜種植塘和對照塘）在不同采樣時間間差異顯著(R=0.999，P=0.002)，但空心菜根際細菌群落在兩次不同采樣時間見的差異不顯著(R=0.999，P=0.10)。綜合以上結(jié)果，本研究認為，盡管空心菜根系附著的細菌群落明顯不同于其所在水中的細菌群落，但在種植面積10%的情況下，池塘浮床種植空心菜不會對水中浮游細菌的群落結(jié)構(gòu)造成顯著影響；水中的細菌群落會隨著時間的變化而變化，空心菜根際細菌群落可能也有隨著時間變化而發(fā)生變化的趨勢。

圖4 池塘系統(tǒng)中細菌群落的NMDS排序分析

為了了解空心菜種植池塘以及對照池塘水中浮游細菌群落和水環(huán)境質(zhì)量狀況之間的關系，首先采用Mantel檢驗對水中浮游細菌群落和環(huán)境變量進行相關性分析，結(jié)果表明，環(huán)境變量能夠解釋水中浮游細菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性狀況(p=0.002，r=0.538)；在此基礎上，采用enfit函數(shù)來檢驗不同環(huán)境變量解釋水中浮游細菌群落排序(NMDS)的顯著程度，結(jié)果如表1所示，表1表明無機碳、氨氮和亞硝態(tài)氮與水中浮游細菌的群落結(jié)構(gòu)間具有顯著的相關關系(p＜0.05)；采用Bioenv函數(shù)來分析篩選與水中浮游細菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著相關關系的環(huán)境變量組合，結(jié)果表明環(huán)境變量中只有無機碳一個變量入選(r=0.839)。

表1 水中細菌群落與環(huán)境因子之間的關系

2.5 空心菜種植對池塘水質(zhì)的影響

如前所述，羅非魚養(yǎng)殖池塘水中浮游細菌群落和水質(zhì)無機碳、氨氮和亞硝氮間具有顯著的相關性，特別是無機碳。除此以外，筆者還希望了解空心菜種植是否對池塘水質(zhì)產(chǎn)生了顯著的影響。通過對空心菜種植塘和對照塘環(huán)境因子的分析，可以發(fā)現(xiàn)空心菜種植可以使得池塘中總氮、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、總有機碳和總碳顯著降低(p＜0.05)（圖5(c)、(d)、(e)、(f)、(g)），和對照組相比分別平均下降7.98%、20.56%、40.29%、27.7%和11.5%。但是這樣的影響和與水中浮游細菌密切相關的理化因子組合并不相同，這可能是造成空心菜種植沒有對池塘水中浮游細菌群落產(chǎn)生顯著影響的原因。

圖5 空心菜種植對池塘水質(zhì)的影響

2.6 空心菜種植對單位體積水中固氮酶nifH基因豐度的影響

前已述及，實驗條件下空心菜浮床種植對池塘水中細菌群落結(jié)構(gòu)影響不顯著，筆者還希望了解空心菜種植對池塘水中和氮素代謝密切相關的固氮菌豐度的影響。圖6可見，空心菜種植塘和對照塘水體中固氮酶基因nifH拷貝數(shù)之間沒有顯著差異(p＞0.05)，但是經(jīng)過換算的空心菜根系附著的細菌為其所占據(jù)的單位體積水體所貢獻的nifH基因拷貝數(shù)顯著高于其所在的水中的拷貝數(shù)(p＜0.05)，換句話說，即使不考慮空心菜根系所在池塘水體中已有的固氮酶nifH基因，空心菜根系為其所占據(jù)的單位體積水體貢獻的nifH基因拷貝數(shù)也遠遠大于池塘水體單位體積中的拷貝數(shù)。由此可見，池塘種植空心菜并不是簡單的植株生長吸收水體中的氮素那么簡單，還存在著促進空氣中氮氣的固定作用這樣的過程。

圖6 空心菜種植對單位體積池塘水固氮酶nifH基因拷貝數(shù)的影響

3 討論

3.1 浮床空心菜種植對池塘生態(tài)系統(tǒng)細菌群落的影響分析

本研究表明，以10%的覆蓋面積浮床種植空心菜對池塘浮游細菌群落并沒有顯著的影響，無論是“門”水平的群落組成，還是群落多樣性均未發(fā)生顯著變化。這與李建柱等[19]在草魚養(yǎng)殖池塘中的研究類似。李建柱等采用3.5%的浮床空心菜覆蓋率研究其對池塘中微生物群落的影響，結(jié)果表明，在“門”水平上浮床空心菜沒有對水中的浮游細菌群落造成顯著影響。然而，兩者之間亦有不同之處，3.5%的浮床空心菜覆蓋率一定程度上提高了水體浮游細菌豐富度指數(shù)、降低了其多樣性指數(shù)。和本研究相比，其無論是養(yǎng)殖品種、浮床面積還是水質(zhì)營養(yǎng)狀況都存在著不同，這些都可能是原因，但是筆者認為其中水質(zhì)營養(yǎng)負荷可能是最主要的原因，兩者在水質(zhì)總氮、氨氮等水平都存在非常顯著的差別，本研究中的羅非魚養(yǎng)殖池塘中總氮和氨氮的濃度均接近于2倍于草魚養(yǎng)殖池塘。有研究表明，以營養(yǎng)物質(zhì)濃度為代表的環(huán)境因子對浮游細菌群落的影響甚至能夠大于6000 km空間距離對其的影響[27]，一些其他的影響因素往往最終也是通過改變環(huán)境因子的濃度來對浮游細菌群落造成影響。因此，對于養(yǎng)殖池塘來講，營養(yǎng)負荷越高，包括浮床種植在內(nèi)的外源性干預對浮游細菌群落結(jié)構(gòu)的影響可能也就會越小。盡管如此，浮床種植空心菜在還未明顯改變水中浮游細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的情況下，一些細微的變化可能已經(jīng)在發(fā)生，例如通過某種機制影響到水中細菌及氮循環(huán)細菌的數(shù)量。吳偉等[21]的研究就表明，在異育銀鯽為主養(yǎng)品種的池塘中分別以10%和20%的覆蓋率，浮床空心菜種植40天后能夠促進水中細菌總數(shù)及氮循環(huán)細菌數(shù)量的增加；并且隨著浮床覆蓋率的增加，其影響也越顯著，王珊珊等[22]的研究表明，空心菜浮床面積占總面積25%以上時能夠促進水中脫氮細菌的穩(wěn)定生長。

浮床空心菜種植對池塘微生態(tài)環(huán)境的影響不光是直接對于其接觸的浮游細菌群落結(jié)構(gòu)，空心菜根系作為基質(zhì)為水中微生物提供了附著場所，并且隨著根系的不斷生長，基質(zhì)表面積也不斷增加。本研究表明，空心菜根系獨有OTU占總數(shù)的22.11%，這些OTU可能是由空心菜幼苗栽培時帶入的，隨著空心菜的不斷生長，其可能也經(jīng)歷了自然選擇的過程，并在系統(tǒng)中發(fā)揮著作用；與此同時，根系作為基質(zhì)對占總數(shù)30.5%的OTU發(fā)揮了富集作用，使得占總數(shù)3.3%的OTU表現(xiàn)為下調(diào)作用。這樣以富集為主的選擇性富集作用和空心菜幼苗帶入的獨有菌群一起在池塘生態(tài)系統(tǒng)中形成了特異性的生物膜，盡管對水中浮游細菌群落的直接影響不顯著，但是水中的生物膜同樣是池塘微生態(tài)環(huán)境中重要的組成部分，同樣在池塘生態(tài)系統(tǒng)包括氮循環(huán)在內(nèi)物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，相較于水中，亞硝化細菌和硝化細菌在空心菜根系具有更多的數(shù)量分布[29]，因此空心菜根系生物膜為池塘水體的硝化反應的發(fā)生提供了生物學基礎。而本研究首次對空心菜根系表面的固氮菌進行了定量研究，經(jīng)換算后其顯著增加了空心菜所在區(qū)域單位水體固氮菌的數(shù)量，因此空心菜根系在促進氮素硝化轉(zhuǎn)化的過程中，也可能在一定程度上促進了空氣中氮素向池塘水體的轉(zhuǎn)移。

3.2 浮床空心菜種植對水質(zhì)影響及原因分析

本研究表明，在吉富羅非魚養(yǎng)殖池塘中以10%的空心菜浮床覆蓋率使得水質(zhì)指標總氮、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、總有機碳和總碳均顯著下降，和對照塘相比下降平均幅度分別達到7.98%、20.56%、40.29%、27.7%和11.5%。目前為止，已經(jīng)報道了在多個養(yǎng)殖品種池塘中采用浮床空心菜來凈化水質(zhì)的研究。本實驗室先前在以異育銀鯽為主的養(yǎng)殖池塘中以10%和20%的覆蓋率來浮床種植空心菜的研究，和對照組相比，水中總磷、總氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、葉綠素a和高錳酸鹽指數(shù)等多個指標均顯著下降，并且20%覆蓋率下降幅度更大；李文祥等[3]在異育銀鯽為主養(yǎng)品種的池塘中同樣以10%的空心菜覆蓋率，使得水質(zhì)總磷、總氮和高錳酸鹽指數(shù)的值在9至11月份間顯著低于對照池塘，這與本研究基本吻合；Li等[29]采用10%的覆蓋率在中華鱉養(yǎng)殖池塘中種植浮床空心菜對水質(zhì)進行凈化，結(jié)果表明氨氮、總氮、總磷、葉綠素a和濁度在7月份以后顯著低于對照塘。在羅非魚養(yǎng)殖池塘中也有學者進行過浮床空心菜凈化水質(zhì)的研究，郭中寶等[5]和宋超等[30]在羅非魚養(yǎng)殖池塘中應用浮床空心菜來控制氮磷的實驗表明，其對水質(zhì)總氮、總磷、氨氮、亞硝酸鹽氮等也都起到了明顯的凈化效果。和本研究相比，空心菜種植使得水質(zhì)氨氮、亞硝氮均顯著下降。總體而言，池塘中浮床種植空心菜的研究表明均會對水體總氮、總磷到凈化作用。這2個指標均包含了幾個更具體的指標，例如總氮包括有機氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮等，總磷包括有機態(tài)磷、可溶性磷酸鹽等，這些具體指標的值在不同的養(yǎng)殖池塘中可能會受到不同的具體條件的影響而呈現(xiàn)出更為多樣性的變化，因此浮床空心菜對其的影響也就可能會有所不同，這可能是造成不同的這些研究中這些指標有的顯著降低了，而另一些沒有顯著降低的原因。

對于這些具體的水質(zhì)指標，有的指標能夠直接被空心菜所利用，而其他的主要是通過微生物的轉(zhuǎn)化后而濃度降低的。Zhang等[31]的研究認為，空心菜對水質(zhì)磷的凈化作用主要通過直接吸收，而氨氮和硝酸鹽的凈化作用主要是基于微生物的作用。本研究中除了總磷和總氮外，和對照組相比空心菜種植塘高錳酸鹽指數(shù)和總有機碳濃度也顯著下降，其顯然不會被空心菜直接利用了，而是基于微生物的作用。即使是總氮，由于處理塘氨氮、亞硝氮等無機氮沒有明顯下降，推測其有機氮部分應該通過微生物的轉(zhuǎn)化使得其濃度降低了，與此同時，相當多的無機氮也會被移出到系統(tǒng)之外，只不過增加和降低的聯(lián)合作用結(jié)果是氨氮和亞硝氮濃度沒有顯著降低。而發(fā)揮作用的微生物一部分來自水中的浮游微生物，其群落結(jié)構(gòu)盡管沒有被顯著改變，但是根據(jù)先前的一些研究，浮床空心菜可以通過某種機制促使水中的細菌總數(shù)和氮循環(huán)細菌總數(shù)增加，從而間接發(fā)揮水質(zhì)凈化的作用，至于水中微生物群落和水質(zhì)無機碳、氨氮和亞硝態(tài)氮間的相關關系可能是因為剛好兩者最終的結(jié)果是都沒有因浮床空心菜的種植發(fā)生顯著的改變。另外一部分發(fā)揮作用的微生物就來自空心菜根系形成的選擇性生物膜。生物膜和根系本身構(gòu)成了一個復雜的系統(tǒng)，可以同時發(fā)生直接吸收營養(yǎng)物質(zhì)和生物膜中微生物對水質(zhì)的凈化作用，空心菜浮床比仿生植物具有更好的去除效果凈化效果可以在一定程度上證明這一點[16]。而生物膜對氮素轉(zhuǎn)化同樣包含了促進空氣中氮氣的固定和促進水體氮素轉(zhuǎn)化雙重的效應。從另一方面來說，任何影響到空心菜生長發(fā)育的因素均可能影響到其物質(zhì)吸收和生物膜形成及轉(zhuǎn)化作用，也就會影響到浮床空心菜對水質(zhì)的凈化效果，例如水中的營養(yǎng)狀態(tài)、酸堿度等均會對空心菜的生長造成影響，也就會對水質(zhì)凈化效果造成影響，這也是不同養(yǎng)殖池塘中使用浮床空心菜來凈化水質(zhì)效果會產(chǎn)生差異的重要原因。酸堿度水體對其中水培的空心菜產(chǎn)量造成影響

4 結(jié)論

（1）羅非魚養(yǎng)殖池塘中，以10%的覆蓋率浮床種植空心菜對水體浮游細菌群落結(jié)構(gòu)影響不大；

（2）空心菜根系生物膜細菌的組成包括外源性的獨有菌群和來自水中的菌群，其中生物膜對水中菌群的附著大部分相對豐度未顯著變化，除此以外的部分基本上都進行了富集（上調(diào)）。

（3）生物膜對水質(zhì)的作用可能包含促進水中氮素的轉(zhuǎn)化的一面，還包含促進對空氣中氮氣向水中轉(zhuǎn)移的一面。