易開放，張俊鍇，劉佩儀，韓榮嘉，苗青青，潘玉善，趙金鳳，翟亞軍，胡功政

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046)

沙門氏菌(Salmonella)是對人及動物均具有嚴(yán)重致病性的革蘭氏陰性胞內(nèi)菌[1]，能使人、哺乳動物及禽類發(fā)病，出現(xiàn)胃腸炎、腹瀉及敗血癥等癥狀[2]。多西環(huán)素等抗菌藥物是治療沙門氏菌感染的常用藥物，但由于抗菌藥物的不合理使用，使沙門氏菌的耐藥性不斷擴(kuò)散，同時獸藥殘留的問題也日益突出[3-4]。研究表明，外排泵是引起細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要因素，沙門氏菌是主動外排泵系統(tǒng)種類最多的細(xì)菌之一，其中AcrAB-TolC是產(chǎn)生耐藥最重要的外排泵，外排多種抗菌藥物可以使細(xì)菌產(chǎn)生高水平、多重耐藥[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，其有效成分在機(jī)體內(nèi)通過多種途徑的綜合實(shí)現(xiàn)了對細(xì)菌的抑菌作用，其抑菌機(jī)制包括破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，抑制細(xì)菌酶的活性，抑制外排泵，抑制核酸和蛋白的合成與功能等[7]。由于中藥有特殊的逆轉(zhuǎn)耐藥性作用，與抗菌藥物聯(lián)合可表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，故中藥與抗菌藥物聯(lián)用防治細(xì)菌性疾病成為目前研究的熱點(diǎn)[8-9]。粉防己堿(tetrandrine，TET)屬雙芐基異喹啉類生物堿，是傳統(tǒng)中藥粉防己有效成分，已證明具有抗微生物、抗真菌感染、抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等多種生物活性[10-11]。目前尚無關(guān)于粉防己堿與抗菌藥物聯(lián)用對沙門氏菌抑菌作用的報道，本研究旨在觀察粉防己堿與多西環(huán)素對沙門氏菌的體外聯(lián)合抗菌效果，并從外排泵方面探討其聯(lián)合用藥的作用機(jī)制，以期為臨床聯(lián)合用藥控制耐藥性沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株?CVCC 541(命名為JS) ，購自中國獸藥藥品監(jiān)察所；12株沙門氏菌分離株，均為由本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)過鑒定的臨床分離菌株。

1.1.2 藥品與試劑 粉防己堿，成都瑞芬思生物科技有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠(ethidium bromide，EtBr)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；多西環(huán)素，廣州翔博生物科技有限公司產(chǎn)品；普通LB瓊脂、LB肉湯、MHB肉湯、SS瓊脂，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Spapk 10M酶標(biāo)儀，瑞士帝肯(Tecan)公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌復(fù)蘇 取菌種50 μL接種于5 mL新鮮LB肉湯，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。用一次性接種環(huán)蘸取適量菌液接種于SS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h～18 h，置于-20 ℃ 冰箱備用。

1.2.2 粉防己堿和多西環(huán)素的配制 將粉防己堿用1 mol/L的鹽酸溶解后配制成5 120 μg/mL的溶液，調(diào)pH至4；準(zhǔn)確稱取適量的多西環(huán)素，配制成濃度為5 120 μg/mL的母液50 mL。均用0.22 μm的濾膜過濾除菌，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單藥最小抑菌濃度測定方法 參照CLSI規(guī)定的操作方法[12]，采用微量肉湯稀釋法分別測定多西環(huán)素、粉防己堿對沙門氏菌的MIC，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用96孔棋盤法[13]，測定粉防己堿聯(lián)合多西環(huán)素在體外對沙門氏菌的協(xié)同效應(yīng)。藥物相互作用效應(yīng)通過計(jì)算其部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration indices，F(xiàn)ICI)來判斷。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC≤0.5，協(xié)同作用；0.52，拮抗作用。

1.2.5 體外時間-殺菌曲線 根據(jù)棋盤試驗(yàn)的結(jié)果，選擇呈協(xié)同作用的標(biāo)準(zhǔn)菌JS和臨床分離沙門氏菌S290，通過活菌菌落計(jì)數(shù)的方法制作時間-殺菌曲線，進(jìn)一步驗(yàn)證粉防己堿與多西環(huán)素聯(lián)合的動態(tài)殺菌作用。設(shè)置空白組，1/2×MIC DOX、1/2×MIC TET、1/4×MIC TET單藥組，1/2×MIC DOX+1/2×MIC TET、1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET聯(lián)合組。將混勻后不同組合的離心管放置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱，分別在0、2、4、8、12、24 h時間點(diǎn)取樣，10倍系列稀釋后滴在LB瓊脂板上， 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以時間為橫坐標(biāo)，log10(CFU/mL) 為縱坐標(biāo)繪制曲線[14]。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：協(xié)同作用，聯(lián)合組菌液濃度與殺菌效果最優(yōu)的單藥組比較，菌落數(shù)降低≥2 log10(CFU/mL)；相加作用，聯(lián)合組菌液濃度與殺菌效果最優(yōu)的單藥組比較，菌落數(shù)降低1 log10(CFU/mL)～2 log10(CFU/mL)。

1.2.6 溴化乙錠蓄積試驗(yàn) 配制1 mmol/L的熒光探針EtBr和1×PBS(含5 mmol/L葡萄糖)的緩沖液。將沙門氏菌于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至指數(shù)期；以11 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min；用緩沖液1×PBS反復(fù)洗滌2次后，再次懸浮在緩沖液中，配制OD6 00 nm=0.3的菌懸液。在該菌懸液加入EtBr使其終濃度為5 μmol/L。設(shè)置7個試驗(yàn)組：1/2MIC DOX、1/2MIC TET、1/4MIC TET、1/2MIC DOX+1/2MIC TET、1/2MIC TET+1/4MIC TET、CCCP(羰基氰氯苯腙)、1/2MIC DOX+ CCCP，其中CCCP為陽性對照組。另設(shè)不加任何藥物的陰性對照組，混勻后37 ℃孵育1h，用Spark多功能酶標(biāo)儀以激發(fā)波長530 nm，發(fā)射波長600 nm 進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定[15-16]。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26、GraphPad Prism 8等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，差異顯著性檢驗(yàn)用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 單用體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，多西環(huán)素對沙門氏菌的MIC值為4 μg/mL～64 μg/mL，在臨床沙門氏菌中有2株敏感，占16.67%，有10株耐藥，占83.33%。粉防己堿對沙門氏菌的MIC值為320 μg/mL～640 μg/mL，抑菌作用較弱。

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，13株菌中有11株呈協(xié)同作用，占84.62%；2株呈相加作用占15.38%，無拮抗和無關(guān)作用。粉防己堿和多西環(huán)素聯(lián)用對沙門氏菌FICI的平均值為0.47，具有良好的協(xié)同作用。

2.3 時間-殺菌曲線結(jié)果

1/2×MIC的多西環(huán)素在體外對沙門氏菌作用中，對JS在12 h以前有一定的抑菌效果，殺菌曲線呈水平狀態(tài)(圖1)；對S290無殺菌或抑菌效果(圖2)。1/2×MIC、1/4×MIC粉防己堿單藥的殺菌曲線都呈持續(xù)增長的趨勢，也無殺菌或抑菌作用。

1/2×MIC、1/4×MIC粉防己堿與1/2×MIC多西環(huán)素聯(lián)用，在12 h時對JS的殺菌曲線呈現(xiàn)下降的趨勢(圖1)，與1/2×MIC多西環(huán)素單藥組相比，菌液濃度分別下降了4.04、1.88 log10(CFU/mL)，可見1/2×MIC粉防己堿與1/2×MIC多西環(huán)素聯(lián)合在12 h時協(xié)同效果顯著。在24 h時，1/2×MIC、1/4×MIC粉防己堿與1/2×MIC多西環(huán)素聯(lián)用與單藥組相比，菌液濃度分別降低了3.42、2.87 log10(CFU/mL)，說明這兩種聯(lián)合使用具有協(xié)同抑菌效應(yīng)。

1/2×MIC、1/4×MIC粉防己堿與1/2×MIC多西環(huán)素聯(lián)用，在8 h時對S290的殺菌曲線呈現(xiàn)下降的趨勢(圖2)，與1/2×MIC多西環(huán)素單藥作用相比，菌液濃度分別下降了4.65、2.56 log10(CFU/mL)，說明有協(xié)同效應(yīng)。在24 h時，1/2×MIC、1/4×MIC粉防己堿與1/2×MIC多西環(huán)素聯(lián)用與單藥相比，菌液濃度分別降低了2.27、0.23 log10(CFU/mL)?？梢?/2×MIC粉防己堿與1/2×MIC多西環(huán)素聯(lián)合協(xié)同效果在8 h時更顯著，在24 h內(nèi)均有明顯的協(xié)同抑菌作用。

表1 粉防己堿和多西環(huán)素單用及聯(lián)合應(yīng)用藥敏試驗(yàn)

表2 兩藥聯(lián)用對沙門氏菌FIC構(gòu)成比

2.4 粉防己堿和多西環(huán)素單用及聯(lián)合對S290外排泵活性的影響

如圖3所示，陽性對照CCCP組EtBr的熒光強(qiáng)度顯著升高，作為已知的外排泵抑制劑CCCP能抑制細(xì)菌外排泵的作用，使EtBr在胞內(nèi)的蓄積量增加。與陰性對照組相比，當(dāng)加入不同藥物及濃度時，除多西環(huán)素單藥組，其他試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度均極顯著(P<0.01)升高。

與1/2×MIC DOX組比較，單藥1/4×MIC TET、1/2×MIC TET，兩藥1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET、1/2×MIC DOX+1/2×MIC TET組熒光強(qiáng)度均極顯著升高(P<0.01)；與1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET組相比較，單藥1/4×MIC TET組熒光強(qiáng)度極顯著降低(P<0.01)，兩藥1/2×MIC DOX+1/2×MIC TET組熒光強(qiáng)度極顯著(P<0.01)升高。粉防己堿與多西環(huán)素聯(lián)用時，熒光強(qiáng)度均極顯著大于多西環(huán)素單藥組(P<0.01)，EtBr在胞內(nèi)的蓄積量增加，表明粉防己堿對外排泵有明顯的抑制作用，且表現(xiàn)出劑量依賴性。

圖1 粉防己堿和多西環(huán)素單用及聯(lián)合對JS的時間-殺菌曲線

圖2 粉防己堿和多西環(huán)素單用及聯(lián)合對S290的時間-殺菌曲線

**表示與空白對照組相比，P<0.01；##表示與1/2×MIC DOX相比，P<0.01；&&表示與1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET組相比，P<0.01

3 討論

本試驗(yàn)表明，12株分離沙門氏菌體中的10株(83.33%)對多西環(huán)素耐藥，呈現(xiàn)很高的耐藥率，單藥的臨床治療價值已大為降低。粉防己堿自身對沙門氏菌的抑菌作用較弱，但當(dāng)其(亞MIC粉防己堿，40 μg/mL～160 μg/mL)與多西環(huán)素聯(lián)合時，可顯著增強(qiáng)多西環(huán)素對沙門氏菌的抗菌活性，并使50.0%的沙門氏菌(5/10)由耐藥逆轉(zhuǎn)為敏感。時間-殺菌曲線試驗(yàn)結(jié)果也表明，兩藥聯(lián)合對沙門氏菌具有良好的協(xié)同作用或相加作用。沙門氏菌對包括多西環(huán)素在內(nèi)的四環(huán)素類耐藥機(jī)制有多種，主動外排是其重要的耐藥機(jī)制之一[17]。目前研究報道已證實(shí)，粉防己堿是有抑制外排泵作用的天然藥物，外排泵抑制劑不僅可以解決由外排泵介導(dǎo)的耐藥問題，增加細(xì)菌對藥物的敏感性，而且還可以減少或消除細(xì)菌的耐藥[18]。

本試驗(yàn)應(yīng)用熒光染料EtBr作為主動外排泵的作用底物，示蹤外排泵活性。EtBr本身只產(chǎn)生微弱的熒光，當(dāng)其自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)，與胞內(nèi)的DNA結(jié)合而產(chǎn)生強(qiáng)熒光，但細(xì)菌外膜上的外排泵可主動將其泵出胞外，EtBr在胞內(nèi)的蓄積減少，熒光值趨勢降低。外排泵抑制劑CCCP通過抑制外排泵的能量來源抑制外排泵的作用，使EtBr在胞內(nèi)的蓄積量增加，熒光值增長迅速[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)粉防己堿能增強(qiáng)多西環(huán)素對沙門氏菌的抗菌作用，EtBr蓄積試驗(yàn)表明，粉防己堿能使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)EtBr蓄積量增加，熒光強(qiáng)度極顯著升高，顯著抑制外排泵活性，說明兩藥聯(lián)合時，粉防己堿可阻止多西環(huán)素的外排，促進(jìn)多西環(huán)素在細(xì)菌細(xì)胞中的積累，從而提高多西環(huán)素的抗菌活性，粉防己堿與多西環(huán)素聯(lián)合用藥對治療耐藥沙門氏菌感染有重要應(yīng)用價值。