張海艷，許順鑫，陳秋慧，李政志，嚴(yán) 蕊，胡秀秀，郭愛(ài)珍,3，胡長(zhǎng)敏*,陳 潔

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430208；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；4.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025)

牛無(wú)綠藻(Protothecabovis)是一種不含葉綠素的藻類，普遍存在于環(huán)境和動(dòng)物腸道中[1]。牛無(wú)綠藻乳腺炎在波蘭、韓國(guó)等14個(gè)奶牛養(yǎng)殖業(yè)高度發(fā)達(dá)的國(guó)家(地區(qū))相繼報(bào)道[2-3]。2011年，我國(guó)首次報(bào)道了牛無(wú)綠藻臨床型乳房炎暴發(fā)，Gao J等[4]在牛無(wú)綠藻乳腺炎的病例報(bào)道中，牛無(wú)綠藻分離率為10%～39%。

牛無(wú)綠藻乳腺炎不僅導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，而且使奶品質(zhì)降低。奶牛分泌含有白色薄片的稀水樣牛奶，治療不及時(shí)導(dǎo)致牛乳腺壞死以及奶牛過(guò)早淘汰。據(jù)報(bào)道牛無(wú)綠藻乳腺炎的臨床癥狀通常不明顯，呈亞臨床或慢性經(jīng)過(guò)[2,4-5]。牛無(wú)綠藻屬于藻類，有效抗菌藥物少，治療較為困難。牛無(wú)綠藻可以感染人。病例報(bào)告顯示，它可以感染人的腦部、關(guān)節(jié)，造成慢性腦膜炎、關(guān)節(jié)炎，甚至能導(dǎo)致人的肺炎和發(fā)熱性白細(xì)胞減少癥[6-7]。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外關(guān)于牛無(wú)綠藻的研究較少，論文擬從牛無(wú)綠藻乳腺炎的病原學(xué)、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、診斷及治療等方面對(duì)牛無(wú)綠藻乳腺炎進(jìn)行綜述，為牛無(wú)綠藻的后續(xù)研究提供借鑒。

1 病原學(xué)

牛無(wú)綠藻在顯微鏡下呈橢圓形，有一層細(xì)胞壁，孢子囊直徑約為7 μm～30 μm。它不含葉綠素，營(yíng)寄生生活，通過(guò)形成孢子囊孢子進(jìn)行無(wú)性繁殖，可以分解丙酮酸，利用二羧酸，適宜培養(yǎng)溫度為25 ℃～30 ℃，培養(yǎng)過(guò)程中需要氧氣。牛無(wú)綠藻對(duì)高溫有極強(qiáng)的抵抗力，對(duì)40株牛無(wú)綠藻使用巴氏殺菌法維持20 s后，有13.5%的菌株存活，且進(jìn)入牛的消化系統(tǒng)后仍能存活。根據(jù)文獻(xiàn)資料，牛無(wú)綠藻不僅在干奶期乳房存活，且可與其他微生物共同感染乳腺[5]。

2 流行病學(xué)

牛無(wú)綠藻乳腺炎在夏季多雨高溫時(shí)期多發(fā)，牛舍及牛床為重要的傳染源。在波蘭，它是牛乳腺炎的第三大病原[3]。在波蘭16個(gè)奶牛場(chǎng)中400頭奶牛及其周圍環(huán)境1 211份樣本中發(fā)現(xiàn)牛無(wú)綠藻，是最常見(jiàn)的病原，僅次于鏈球菌和葡萄球菌。另?yè)?jù)報(bào)道，牛無(wú)綠藻乳腺炎的總患病率為8.3%，75.8%的病例具有亞臨床病程[8]，且通常感染分娩后的奶牛。弄清牛無(wú)綠藻乳腺炎的流行病學(xué)情況，有助于指導(dǎo)牛無(wú)綠藻乳腺炎的精準(zhǔn)防控。

3 牛無(wú)綠藻乳腺炎的發(fā)病機(jī)制

3.1 牛無(wú)綠藻感染直接導(dǎo)致乳腺損傷

研究表明牛無(wú)綠藻可侵入乳腺實(shí)質(zhì)，在乳腺中大量復(fù)制，引起奶牛急性和慢性乳腺炎。據(jù)報(bào)道它對(duì)奶牛乳房間質(zhì)和小鼠乳腺腺泡具有破壞作用[9]，過(guò)碘酸雪夫染色和六胺銀染色法檢測(cè)到牛無(wú)綠藻在哺乳期小鼠乳腺中復(fù)制，可觀察到牛無(wú)綠藻和它內(nèi)部的圓形或橢圓形孢子囊。Shahid M[9]研究結(jié)果顯示，牛無(wú)綠藻引起乳腺感染，導(dǎo)致乳腺組織不可逆損傷，特征為巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。另有報(bào)道顯示，它還可誘發(fā)慢性肉芽腫性乳腺炎，致奶牛產(chǎn)奶量明顯減少[10-11]。

3.2 牛無(wú)綠藻感染誘發(fā)炎性細(xì)胞因子

牛無(wú)綠藻感染小鼠后誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中的白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、趨化因子(C-X-C基元)配體1(chemokine (C-X-C motif) ligand 1 protein,Cxcl-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)[9]。牛無(wú)綠藻還可以誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8) 信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)表達(dá)增加，提示IL-8在牛無(wú)綠藻乳腺炎中起重要作用[12]。牛無(wú)綠藻感染乳腺不僅導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8分泌增加，還可以通過(guò)線粒體活性氧(mitochondrial ROS，MtROS)介導(dǎo)核因子(nuclearfactor,NF)-κB、和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain(NOD)-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體通路的激活誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。

3.3 牛無(wú)綠藻感染誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡

研究顯示牛無(wú)綠藻通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞釋放IL-1β和TNF-α介導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡[9]，牛無(wú)綠藻可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡[14-15]。Shahid M等[9]在小鼠乳腺炎模型中亦證明牛無(wú)綠藻的促凋亡作用，包括促凋亡基因Bax和Apaf-1的增加和抑凋亡基因Bcl-2減少。此外，牛無(wú)綠藻通過(guò)氧化防御和抗氧化防御的失衡以及誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，使得bMECs發(fā)生氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[16]，觸發(fā)Bcl-2家族蛋白[17]的促凋亡成分Bax表達(dá)。由于牛無(wú)綠藻入侵導(dǎo)致線粒體損傷，細(xì)胞色素C蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并與Apaf-1結(jié)合，誘發(fā)凋亡小體形成，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase -9，caspase-9)[18-20]。

4 臨床癥狀及病理變化

?；技毙詿o(wú)綠藻乳腺炎時(shí)，體溫升高至40 ℃，感染乳區(qū)明顯增大、疼痛、堅(jiān)硬或水腫。患牛食欲不振且不愿意運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)奶量大幅下降甚至完全停止。慢性牛無(wú)綠藻乳腺炎的特征為乳腺水腫，疼痛輕微，奶牛產(chǎn)奶量下降，奶呈水樣且含有灰色薄片分泌物，部分患牛可見(jiàn)乳腺明顯增大，少部分呈纖維化樣硬化。在單個(gè)乳區(qū)病理組織切面上可見(jiàn)大量米粒狀乳黃色丘疹，直徑約0.5 mm～3 mm，含纖維絲的黏液性不透明黃白色分泌物存在于泌乳竇和乳頭竇中。

5 牛無(wú)綠藻乳腺炎的診斷

牛無(wú)綠藻乳腺炎的臨床癥狀缺乏特異性，在疑似牛無(wú)綠藻乳腺炎時(shí)，還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查確診。

5.1 牛無(wú)綠藻的分離培養(yǎng)鑒定

取100 μL奶樣均勻涂布在無(wú)綠藻分離培養(yǎng)基(Protothecaisolation medium，PIM)上，37 ℃培養(yǎng)48 h～72 h之后，可以看到白色或黃白色，邊緣光滑而暗淡，中心有小突起菌落，使用乳酸酚棉藍(lán)染色，在油鏡下進(jìn)行鏡檢。高倍鏡可觀察到呈球形至橢圓形孢子囊，帶有2個(gè)～6個(gè)孢子囊孢子[21]。

5.2 牛無(wú)綠藻的分子生物學(xué)檢測(cè)

5.2.1 基于真核生物核糖體脫氧核糖核酸的檢測(cè)方法 Jagielski T等[8]2010年開(kāi)發(fā)了無(wú)綠藻屬基于真核生物核糖體脫氧核糖核酸(ribosomal deoxyribo nucleic acid，rDNA)序列的基因型特異性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法，可區(qū)分中型無(wú)綠藻的3種不同基因型。Sara等使用Huss設(shè)計(jì)的保守的真核特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將18S rDNA為模板擴(kuò)增的PCR片段進(jìn)行HaeⅢ酶切，得到RP 1和RP 2兩種不同的片段，成功區(qū)分牛無(wú)綠藻與其他無(wú)綠藻屬的菌株。

5.2.2 基于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的檢測(cè)方法 研究人員采用基因型特異性PCR和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP) 分析方法，對(duì)乳腺炎奶樣中牛無(wú)綠藻分離株與中型無(wú)綠藻基因Ⅰ型 (Protothecaciferrii)進(jìn)行基因分型，使用Kpn21/SmaⅠ限制性內(nèi)切酶將18S rDNA切割成兩個(gè)大小不同的片段，從而對(duì)上述兩種病原進(jìn)行鑒別。Marques S等[22]建立了一種基于核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer，ITS) 序列的方法，成功應(yīng)用于牛乳汁中P.bovis和P.blaschkeae鑒定。

5.2.3 多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) Capra等用無(wú)綠藻屬分離株的線粒體和葉綠體部分序列特異擴(kuò)增的新靶點(diǎn)，建立了兩種多重PCR的方法，可用于同時(shí)檢測(cè)牛無(wú)綠藻、P.blaschkeae和魏氏無(wú)綠藻(Protothecawickerhamii)菌株[23]。Morandi S等[24]采用3條引物(M13、OPA-4、OPA-18)對(duì)牛無(wú)綠藻進(jìn)行多重PCR和單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，后使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA進(jìn)行鑒定。

5.2.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法 Masanobu等設(shè)計(jì)牛無(wú)綠藻的特異性引物18PZF1和18PZR1，以及TaqMan探針PZP1，使用ResoLight染料分析擴(kuò)增產(chǎn)物的熔融曲線可以區(qū)分P.ciferri和P.bovis，建立了用于檢測(cè)和鑒定牛無(wú)綠藻的特異性定量PCR體系，并開(kāi)展28株培養(yǎng)菌株和140株臨床菌株的特異性檢測(cè)[25]。Romana B等[26]研發(fā)了一種多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，可快速和準(zhǔn)確定量無(wú)綠藻屬，并對(duì)P.blashkeae、P.ciferrii及牛無(wú)綠藻進(jìn)行鑒別檢測(cè)。使用快速和高通量的兩步Qpcr/RMA分析工具，可有效地用于鑒定牛無(wú)綠藻、P.wickerhamii及P.blaschkeae。

高分辨率熔解實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，即用18S rDNA引物對(duì)提取牛無(wú)綠藻的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在PCR體系加入ResoLight熒光染料，再將PCR產(chǎn)物直接放入高分辨率熔解分析儀中，根據(jù)不同的熔解曲線對(duì)原18S rDNA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，可以在3 h內(nèi)區(qū)分P.ciferrii和P.bovis，較傳統(tǒng)序列分析極大縮短了時(shí)間[27]。

6 牛無(wú)綠藻乳腺炎的防治

6.1 牛無(wú)綠藻乳腺炎的預(yù)防

6.1.1 環(huán)境消毒 鑒于環(huán)境中牛無(wú)綠藻大量存在，環(huán)境消毒對(duì)預(yù)防牛無(wú)綠藻乳腺炎意義重大。高可溶性聚吡咯(polypyrrole，Ppy) 是已知的抗菌活性分子，用不同濃度的Ppy處理牛無(wú)綠藻菌株，并在掃描電鏡下觀察其形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15.625 μg/mL ～ 62.5 μg/mL的Ppy對(duì)牛無(wú)綠藻菌株有殺滅作用[28]。氯己定和聚維酮碘對(duì)牛無(wú)綠藻也有較好的殺菌效果，氯己定和聚維酮碘對(duì)16株牛無(wú)綠藻的最低殺藻濃度(minimal algaecide concentrations，MAC) 分別為1.56 μg/mL ～3.13 μg/mL和48.83 μg/mL ～390.63 μg/mL[29]。另外有研究表明，牛無(wú)綠藻菌對(duì)低濃度胍敏感，說(shuō)明胍可用作擠奶設(shè)備的消毒劑[30]。此外，藍(lán)光照射也有殺藻效果[31]。

6.1.2 使用中藥 研究顯示，部分中藥具有較好的殺菌抗炎效果，在奶牛泌乳期定期添加部分中藥可提高奶牛免疫力，本實(shí)驗(yàn)室使用中藥制劑治療奶牛無(wú)綠藻乳腺炎取得了顯著成效[32]。中草藥可以有效避免使用抗生素帶來(lái)的藥物殘留，但由于中藥成分復(fù)雜，提取活性成分的過(guò)程較繁瑣，因此現(xiàn)階段牛場(chǎng)使用中藥防治牛無(wú)綠藻乳腺炎的普及率不高，隨著養(yǎng)殖端禁抗政策實(shí)施，應(yīng)用中藥防控奶牛乳腺炎仍有較好前景。

6.1.3 飼養(yǎng)管理 強(qiáng)化飼養(yǎng)管理，保證每日攝入的營(yíng)養(yǎng)均衡，又防止過(guò)度飼喂導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)過(guò)剩。保證飲水安全及飼料新鮮，定期檢查飼料是否霉變，及時(shí)更換清理墊料。定期對(duì)牛舍進(jìn)行消毒，擠奶前使用浸潤(rùn)過(guò)消毒液的毛巾進(jìn)行乳區(qū)消毒，每頭奶牛使用完擠奶設(shè)備后均需消毒一次，并及時(shí)清理牛舍中的糞污和其他污染物。

6.2 牛無(wú)綠藻乳腺炎的治療

早診斷、早治療是高效防控牛無(wú)綠藻乳腺炎的關(guān)鍵，牛無(wú)綠藻對(duì)兩性霉素B和制霉菌素，以及伊曲康唑、泊沙康唑和雷烏康唑敏感[33]。研究人員對(duì)我國(guó)3個(gè)省的620頭奶牛及其周圍環(huán)境中分離出的84株牛無(wú)綠藻進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示牛無(wú)綠藻對(duì)阿米卡星敏感性較高，其次是兩性霉素B和制霉菌素[34]。內(nèi)源性抗菌肽是乳腺天然防御牛無(wú)綠藻的關(guān)鍵，而人抗菌肽LL-37具有殺藻和免疫調(diào)節(jié)功能[35]。

7 展望

牛無(wú)綠藻可以導(dǎo)致牛的急性或慢性乳腺炎，引起牛產(chǎn)奶量減少，給全球奶業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于牛無(wú)綠藻的研究大多集中在分子生物學(xué)檢測(cè)方面，對(duì)于單一牛無(wú)綠藻的感染以及與其他病原菌的共感染機(jī)制均不清楚，且目前尚未開(kāi)發(fā)出應(yīng)用于牛無(wú)綠藻乳腺炎早期現(xiàn)場(chǎng)診斷的方法。因此，探尋牛無(wú)綠藻乳腺炎精準(zhǔn)診斷技術(shù)及高效防控藥物，將助力牛無(wú)綠藻乳腺炎的科學(xué)高效防控。