武艷群 ，劉淑琴 ，孟俊龍 ，2，常明昌 ，2，王術(shù)榮 ，2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西 太谷 030801）

從地理上講，華北地區(qū)一般指秦嶺—淮河線以北、長(zhǎng)城以南的地區(qū)。華北地區(qū)氣候主要是以夏季高溫、多雨，冬季寒冷、干燥的溫帶季風(fēng)氣候?yàn)橹?，年平均氣溫?8～13 ℃，年降水量在 400～1 000 mm[1]。華北地區(qū)自然植被主要是以遼東棟、洋槐和柏樹等植物為代表形成的森林以及酸棗、荊條和茅草等為代表的灌木草原為主[2]。山西省位于華北地區(qū)西部的黃土高原上，黃河中游的東岸。山西省境內(nèi)多山，有東部太行山，西部呂梁山，北部恒山、五臺(tái)山，南部中條山和中部的太岳山等[3]山脈。山西植被主要有溫帶草原和暖溫帶夏綠闊葉林2個(gè)植被地帶[4]。在我國(guó)華北地區(qū)獨(dú)特而優(yōu)厚的自然環(huán)境中，大型真菌的種類和資源極其豐富，在大型真菌資源的利用上蘊(yùn)藏著很大的潛力。

近些年來，在山西省發(fā)現(xiàn)報(bào)道了一批大型真菌的我國(guó)新記錄種和山西省新記錄種。2018年劉虹等[5]鑒定并分析了山西呂梁山脈的一種著名野生食用蘑菇，確定了其為山西省新記錄種，并將其命名為紅銀盤漏斗傘（Infundibulicybe hongyinpanL. Fan &H. Liu）；2019年8月，劉虹等[6]在研究考察山西毒蘑菇資源時(shí)，在中條山地區(qū)櫟樹林內(nèi)地上采到一些黃色的鵝膏屬物種標(biāo)本，經(jīng)鑒定其為黃蓋鵝膏菌，并將其報(bào)道為山西省新記錄種。2020年，劉洋等[7]在歷山發(fā)現(xiàn)了山西省新記錄物種堿紫漏斗杯傘（Infundibulicybe alkaliviolascens（Bellù） Bellù）。2020年，王術(shù)榮等[8]在呂梁市龐泉溝自然保護(hù)區(qū)內(nèi)采集到一個(gè)白鱗傘屬的物種，經(jīng)鑒定該物種為華美白鱗傘（Leucopholiota decorosa（Peck） O.K. Mill.，T. J. Volk &Bessette），并報(bào)道為我國(guó)白鱗傘屬的一個(gè)新記錄種。

筆者在對(duì)2017—2020年采自歷山和呂梁山脈的大型真菌進(jìn)行詳細(xì)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，通過詳細(xì)的形態(tài)學(xué)描述和分子系統(tǒng)發(fā)育分析再次證明該地區(qū)大型真菌物種豐富度極高，旨在為后續(xù)的馴化等研究提供科學(xué)資料，對(duì)華北地區(qū)大型真菌物種資源的補(bǔ)充具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

3份供試材料分別是采集于山西省呂梁山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)和歷山的大型真菌標(biāo)本（標(biāo)本號(hào)分別為HMSAU15012、HMSAU15014和 HMSAU15015）。目前，標(biāo)本被儲(chǔ)存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)的菌物標(biāo)本館（HMSAU）。

1.2 設(shè)備與試劑

冷凍高速離心機(jī)（Thermo賽默飛世爾，ST16 ST16R）；生物安全柜（上海力康，HFsafe-1200LC）；超微量高精度紫外可見光分光光度計(jì)（Thermo賽默飛世爾，ND-ONE-W（A30221））；基礎(chǔ)電泳儀（北京君意東方，JY300HE）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)伯樂，Universal Hood II）；光學(xué)顯微鏡（日本，Nikon Eclipse Ni-U）；電恒溫鼓風(fēng)干燥箱（博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，GZX-9240MBE型）。

DNA提取試劑盒（美國(guó)OMEGA公司，F(xiàn)orensic DNA Kit D3591-02）；焦磷酸鈉（MACKLIN，7553-56-2）；2×EasyTaq PCR Super Mix（全式金生物，AS111-11）；Trans2K DNA Marker（全式金生物，BM101）；瓊脂糖（上海創(chuàng)賽科技有限公司，CB005-100G）；50×TAE（北京索萊寶科技有限公司，T1060）；DNA回收純化試劑盒（Omega Bio-Tek公司，Cycle-Pure Kit D6491-01*）；5% KOH（m/V）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)采集到的新鮮大型真菌標(biāo)本進(jìn)行觀察，拍照并且詳細(xì)地記錄其在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況，包括其菌蓋表面顏色、大小、形狀以及菌褶顏色和菌柄長(zhǎng)度等特征。觀察結(jié)束后用報(bào)紙小心仔細(xì)地包裹，并將其帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用50 ℃烘干機(jī)烘干過夜，裝入袋內(nèi)，再放于標(biāo)本盒內(nèi)保存。觀察時(shí)將干標(biāo)本切片，使其在5%的KOH溶液中復(fù)水，用NikonEclipse Ni-U 光學(xué)顯微鏡對(duì)大型真菌的切片進(jìn)行觀察，分別選擇不少于20個(gè)完整的擔(dān)子和孢子等顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)量并記錄，計(jì)算孢子的長(zhǎng)與寬的比值即Q值（Q值反映孢子的形狀）并計(jì)算其平均值Qavg[9]。

1.3.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

1.3.2.1 DNA提取 取5 mg干燥后的子實(shí)體標(biāo)本 ，使 用 E.Z.N.A.?Forensic DNA Kit試 劑 盒（Omega），按照說明書步驟操作，提取DNA。用超微量高精度紫外可見光分光光度計(jì)對(duì)所提取的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，之后于-20 ℃條件下儲(chǔ)存，以便為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增 將所提取的DNA進(jìn)行濃度稀釋，稀釋到合適濃度的DNA作為模板，用引物對(duì)ITS8-F（5” -AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG GTG-3” ）/LR3（5” -CCGTGTTTCAAGACGGG-3” ）分別作為上游引物和下游引物對(duì)ITS區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：引物濃度為5 μmol/L的上、下游引物各 1 μL；DNA模板 2 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 11 μL，ddH2O為 10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；94 ℃，0.5 min，55 ℃，0.5 min，72 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，4 ℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，電泳程序?yàn)?00 V，45 min。

1.3.2.3 PCR產(chǎn)物純化和DNA測(cè)序 將電泳檢測(cè)結(jié)果合格后的PCR產(chǎn)物用E.Z.N.A?Cycle-Pure Kit試劑盒（Omega）進(jìn)行純化，純化后的DNA做好標(biāo)記，后將其送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行正向和反向測(cè)序[10]。

1.3.2.4 ITS序列處理 用Chromas軟件查看測(cè)序結(jié)果文件，確認(rèn)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，后將標(biāo)本的ITS序列在MEGA X[11-12]軟件中進(jìn)行復(fù)檢，經(jīng)人工修正，排除程序誤讀，舍棄不理想的序列數(shù)據(jù)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具，對(duì)所得序列進(jìn)行同源性比對(duì)，確定其所在屬，并且從GenBank中得到該屬部分物種的基因組序列，同時(shí)選擇合適的其他屬物種的序列作為外類群，用MEGA X軟件中Clustal W程序?qū)ο螺d的序列進(jìn)行校對(duì)和序列長(zhǎng)度處理。然后進(jìn)行模型選擇，選擇最佳模型，最后采用最大似然法[13]（Maximum Likelihood Method，ML），自舉值1 000次重建ML系統(tǒng)發(fā)育樹。用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析的序列信息如表1所示。

表1 用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析的序列信息Tab.1 Information of sequences used in the molecular phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 灰小包腳菇 Volvariella murinella(Quél.) M.M. Moser ex Dennis，P.D. Orton & Hora

標(biāo)本號(hào)：HMSAU15013、HMSAU15014；采集人：王術(shù)榮、何軼榕；采集時(shí)間：2020年8月31日；采集地點(diǎn)：山西省中陽(yáng)縣上頂山；經(jīng)緯度：北緯39°7′35″，東經(jīng) 113°32′46″；海拔：2 050 m。

2.1.1 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 通過人工復(fù)檢得到的堿基序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，這 2份 標(biāo) 本（HMSAU15013、HMSAU15014）的ITS 區(qū)序列與Volvariella murinella（OM214459）的序列相似度為97.2%。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載部分該屬Volvariella的其他物種的基因序列，選用Cantharocybe gruberi（JN006422）作外類群[20]，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明，本研究的2份標(biāo)本HMSAU15013、HMSAU15014與其他灰小包腳菇Volvariella murinella（OM214459、MK412361）聚集于同一分支，且支持率為91%，說明標(biāo)本HMSAU15013、HMSAU15014為灰小包腳菇（Volvariella murinella）。

圖1 基于ITS基因的最大似然分析（ML）獲得的灰小包腳菇與其相關(guān)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of Volvariella murinella and related species obtained by maximum likelihood analysis of ITS gene region

2.1.2 形態(tài)學(xué)分析 宏觀特征（圖2）：子實(shí)體偏小。菌蓋直徑2.2～3.5 cm，呈鈍圓錐狀，菌蓋中部稍微突出，不黏，表面具有輻射狀灰色纖毛，白色至灰白色，中央米黃色至淡棕色，邊緣完整。菌肉薄，白色，氣味和味道不特殊。菌褶離生，稀疏，不等長(zhǎng)，淡粉色，邊緣完整或略有鋸齒狀。菌柄中生，2.1～3.2 cm×0.3～0.4 cm，近圓柱形，基部近棒狀，白色，表面光潔或具有縱向纖毛，實(shí)心，較脆。菌托膜質(zhì)，白色至淡灰色，不易脫落，開裂成2～3瓣。

圖2 灰小包腳菇子實(shí)體的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Volvariella murinella fruiting body

微觀特征（圖 3）：擔(dān)孢子 6.1～7.9 μm×4.2～4.9 μm，Q 值為 1.3～1.8，Qavg為 1.5，不規(guī)則橢圓形或卵圓形，淡黃褐色，孢子壁光滑，較厚。擔(dān)子18.9～36.3 μm×6.8～10.4 μm，Q值為 1.9～3.9，Qavg為 2.6，棍棒狀，光滑，透明。側(cè)生囊狀體42.2～57.9 μm×16.3～18.1 μm，近棒狀或近紡錘形，壁薄，無色。褶緣囊狀體 22.5～39.5 μm×11.3～13.2 μm，形狀多樣，棒狀、寬棒狀至近紡錘形，壁薄，無色。無鎖狀聯(lián)合。

圖3 灰小包腳菇的微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microscopic structure of Volvariella murinella

生境：夏秋季單生或群生于闊葉林的枯枝、落葉上。分布：亞洲（中國(guó)山東）；歐洲（德國(guó)）[21]。

該種主要識(shí)別特征為擔(dān)子果小型至中型；菌蓋表面具輻射狀細(xì)微纖毛，白色，中央淡米黃色；菌柄色同蓋，光潔或具有縱向纖毛。在宏觀形態(tài)上，研究標(biāo)本與模式標(biāo)本相比較，除菌蓋直徑較模式標(biāo)本（2.0～5.0 cm）略短外，其他宏觀特征均相似。在微觀形態(tài)上，研究標(biāo)本和模式標(biāo)本孢子的顏色和形狀極為接近，研究標(biāo)本的擔(dān)子比模式標(biāo)本的擔(dān)子（大小為 20.0～28.0 μm×6.0～10.0 μm）較長(zhǎng)，這可能與測(cè)量誤差或環(huán)境因子有關(guān)。通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定其為華北地區(qū)的新記錄種灰小包腳菇（Volvariella murinella）。在生境上，本研究標(biāo)本采自闊葉樹的枯枝落枝，模式種采自林中或林緣的草叢、枯枝落葉層[22]。此物種味道辛辣至略苦[23]，食用價(jià)值尚不明胡。

2.2 東方球果傘Strobilurus orientalis Zhu L.Yang & J. Qin

標(biāo)本號(hào)：HMSAU15012；采集人：王術(shù)榮、原淵；采集時(shí)間：2018年7月24日；采集地點(diǎn)：山西省晉城市沁水縣中村鎮(zhèn)下川村；經(jīng)緯度：北緯35°26′32.96″，東經(jīng) 112°01′10.67″；海拔：1 578 m。2.2.1 分子系統(tǒng)發(fā)育分析 將得到的堿基序列進(jìn)行人工復(fù)檢后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)該標(biāo)本（HMSAU15012）的ITS區(qū)序列與Strobilurus orientalis（MF063170）的序列相似度為100%。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載該屬Strobilurus的其他8條基因序列，選用Xerula strigosa（LK932286）作外類群[9,11]，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明，標(biāo)本HMSAU15012與其他東方球果傘（MF063170、MF063157）聚集于同一分支，且支持率為95%，說明標(biāo)本HMSAU15012為東方球果傘（Strobilurus orientalis）。

圖4 基于ITS基因的最大似然分析（ML）獲得的東方球果傘與其相關(guān)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of Strobilurus orientalis and related species obtained by maximum likelihood analysis of ITS gene region

2.2.2 形態(tài)學(xué)分析 宏觀特征(圖5)：菌蓋直徑為1.5～3.5 cm，錐形或傘形，淺褐色。菌褶直生近離生，不等長(zhǎng)，灰白色，較密。菌肉薄。菌柄長(zhǎng)3.0～5.5 cm，粗0.1～0.4 cm，圓柱狀，顏色不均勻，近菌蓋處為白色，向下為黃褐色。

圖5 東方球果傘子實(shí)體的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of Strobilurus orientalis fruiting body

微觀特征（圖 6）：孢子 6.7～8.9 μm×5.3～6.8 μm，Q 值為 1.3～1.7，Qavg為 1.42，窄橢圓形，黃褐色，光滑。擔(dān)子37.5～43.9 μm×8.2～10.9 μm，Q值為3.4～5.6，Qavg為4.5，棒狀，透明，光滑；壁薄，有2～4個(gè)擔(dān)子小梗。側(cè)生囊狀體16.2～37.8 μm×6.9～10.8 μm，紡錘形，壁薄或者略厚，透明。褶緣囊狀體 14.5～36.2 μm×7.2～12.3 μm，紡錘形，形狀類似于側(cè)囊體，通常壁較薄，偶然厚。無鎖狀聯(lián)合。

圖6 東方球果傘的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microscopic structure of Strobilurus orientalis

生境：夏季和秋季單生于云杉林中。分布：中國(guó)的云南、四川等地。

該種的主要特征為子實(shí)體較小，擔(dān)孢子也較小。在宏觀形態(tài)上，研究標(biāo)本菌柄較模式標(biāo)本（2.0～7.0 cm）略短，其他宏觀特征均相似，僅有極小的差異。在微觀形態(tài)上，研究標(biāo)本和模式標(biāo)本極為接近，研究標(biāo)本的孢子比模式標(biāo)本的孢子（大小為3.5～6.0 μm×2.0～4.0 μm）較大，這可能與測(cè)量誤差或環(huán)境因子有關(guān)。通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定其為華北地區(qū)的新記錄種東方球果傘（Strobilurus orientalis）。在生境上，本研究標(biāo)本采自云杉林中的落葉落枝上，模式種采自華山松的松果下[14]。此物種味道溫和[14]，食藥用價(jià)值尚不明確。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對(duì)采集到的3份標(biāo)本分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和建立系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定出其物種名稱分別為灰小包腳菇（Volvariella murinella）和東方球果傘（Strobilurus orientalis）。

灰小包腳菇（Volvariella murinella）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agariciomycetes）傘菌目（Agaricales）小包腳菇屬（Volvariella）。王建瑞等[24]在山東省魯中南山地丘陵麻櫟林、落葉闊葉雜木林、油松和側(cè)柏疏林植被類型區(qū)采集到該物種；冶曉燕[25]在甘肅文縣某林中及邊緣落葉、草地上采集到該物種并將其報(bào)道為甘肅省新記錄種；本研究在呂梁山自然保護(hù)區(qū)采集的灰小包腳菇生長(zhǎng)在闊葉林的落枝上，此后我國(guó)尚未有該物種的其他報(bào)道，需要更多研究來對(duì)該物種的分布及生境做補(bǔ)充。

東方球果傘（Strobilurus orientalis）的主要特征為擔(dān)孢子小，光滑，橢圓形，側(cè)生囊狀體壁厚。QIN等[14]在四川和昆明的云杉林中發(fā)現(xiàn)過此物種，此后未見有其他報(bào)道。本研究在歷山自然保護(hù)區(qū)采集到的東方球果傘也生長(zhǎng)在云杉林中。目前該物種僅在我國(guó)西南地區(qū)的四川、云南和華北地區(qū)的山西省被發(fā)現(xiàn)，該物種其他分布地的發(fā)現(xiàn)尚需更多研究。

本研究報(bào)道的2種大型真菌均首次在華北地區(qū)的山西省被發(fā)現(xiàn)，屬于華北地區(qū)新記錄種。由此可見，該地區(qū)大型真菌物種豐富度極高，在大型真菌資源利用方面蘊(yùn)藏著很大的潛力。本研究對(duì)華北地區(qū)大型真菌資源物種作了重要補(bǔ)充，為后續(xù)的馴化等研究提供了科學(xué)資料。