馮談林，楊秦玉，韓淑雅，侯 晟，賀 瑩

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033000）

苦菜為菊科一年生或多年生草本植物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等調(diào)節(jié)人體機(jī)能（鄧麗紅等，2017）的作用和極強(qiáng)的繁殖能力。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對苦菜藥用價(jià)值的研究更加深入（高治國等，2017）。通過研究表明，苦菜提取液其抑制強(qiáng)弱順序?yàn)榧?xì)菌、霉菌、酵母菌，對不同菌種均有明顯的抑制作用（侯金麗等，2015）。苦菜根、莖、葉的乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用（郭愛華等，2016）。石磊等（2018）通過研究闡述了不同提取方法對苦菜浸提液可溶性固形物含量的影響。而苦菜中所含有的硒也是人體所必需的微量元素，其形成了許多活性蛋白質(zhì)，可以保護(hù)機(jī)體不受由自由基引起的氧化性損傷。近年來，硒在不同食物來源的生物利用度己經(jīng)通過使用各種體外腸消化過程的生物可接近性進(jìn)行了評估（王曉雅，2006）。梁潘霞（2016）對植被硒蛋白不同提取方法進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，之后又通過試驗(yàn)優(yōu)化工藝使硒蛋白提取率得到提高（梁潘霞等，2017）。目前有研究發(fā)現(xiàn)，恩施碎米薺的堿溶蛋白質(zhì)中硒結(jié)合蛋白含量最高（曹斌等，2016）。對茶葉硒蛋白的研究表明，不同溶劑提取的茶葉硒蛋白均具有較強(qiáng)的抗氧化活性（程利增，2017）。而作為全球最大的飼料生產(chǎn)國，我國飼料行業(yè)快速發(fā)展，已由以量為主轉(zhuǎn)變?yōu)楦哔|(zhì)量發(fā)展階段，因此研究苦菜硒蛋白的飼料添加劑有著舉足輕重的作用。

本試驗(yàn)通過參考國內(nèi)外富硒飼料添加劑的研究，利用超聲波輔助提取技術(shù)對苦菜中硒蛋白的提取工藝進(jìn)行研究，分析各單因素對其提取工藝的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)驗(yàn)，再由Design-Expert 8.0軟件確定提取硒蛋白的最佳工藝，將提取得到的硒蛋白從DPPH自由基清除能力和還原力這兩方面分析其抗氧化性，以期為苦菜硒蛋白飼料添加劑在動物養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 苦菜，產(chǎn)于福建南平的野生苦菜；考馬斯亮藍(lán)，天津光復(fù)試劑有限公司；NaOH，天津風(fēng)船化學(xué)試劑廠；無水乙醇，天津凱通化學(xué)試劑廠；DPPH溶液，福州飛凈生物科技有限公司；維生素C，山東科德化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器 UV-3100PC紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇新瑞儀器廠；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；F-020SF-020S超聲波清洗，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 苦菜硒蛋白制備的工藝流程 原料選擇→預(yù)處理→稱樣品→粉碎→過篩→超聲波輔助提取→過濾→測定；操作要點(diǎn)：挑選新鮮苦菜洗凈，于87℃烘干至恒重，粉碎后過80目篩，得樣品苦菜粗粉。稱取1 g樣品，加入0.3 mol/L NaOH溶液，在超聲波時(shí)間16 min，料液比1∶30 g/mL，超聲波功率78 W的條件下超聲波輔助提取苦菜硒蛋白，過濾，吸取樣液1 mL，稀釋30倍，吸取稀釋后的樣液0.05 mL，加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)，混勻后于分光光度計(jì)595 nm處測吸光度（郝滌非等，2018）。

1.4 苦菜硒蛋白提取的單因素試驗(yàn)

1.4.1 NaOH濃度對硒蛋白提取量的影響 分別選擇NaOH濃度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L，在超聲波時(shí)間16 min，料液比1∶30 g/mL，超聲波功率78 W的條件下提取苦菜硒蛋白。過濾，稀釋樣液30倍，取0.05 mL的樣液，加入考馬斯亮藍(lán)5 mL，混勻，待測。

1.4.2 超聲波時(shí)間對硒蛋白提取量的影響 超聲波時(shí)間分別取10、12、14、16、18 min和20 min，在料液比1∶30 g/mL，NaOH濃度0.3 mol/L，超聲波功率78 W條件下提取苦菜硒蛋白。過濾，稀釋樣液30倍，取0.05 mL的樣液，加入考馬斯亮藍(lán)5 mL，混勻，待測。

1.4.3 料液比對硒蛋白提取量的影響 料液比分別取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL和1∶35 g/mL，在超聲波時(shí)間16 min，超聲波功率78 W，NaOH濃度0.3 mol/L條件下提取苦菜硒蛋白。過濾，稀釋樣液30倍，取0.05 mL的樣液，加入考馬斯亮藍(lán)5 mL，混勻，待測。

1.4.4 超聲波功率對硒蛋白提取量的影響 超聲波功率分別取58、68、78、88 W和98 W，在超聲波時(shí)間16 min，NaOH濃度0.3 mol/L，料液比1∶30 g/mL條件下提取苦菜硒蛋白。過濾，稀釋樣液30倍，取0.05 mL的樣液，加入考馬斯亮藍(lán)5 mL，混勻，待測。

1.5 苦菜硒蛋白提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素提取苦菜硒蛋白試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對其中四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化苦菜硒蛋白提取量，通過Design-Expert 8.0軟件，分析苦菜硒蛋白提取量的最佳工藝方案，然后將得到的最佳試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行試驗(yàn)檢驗(yàn)（郭愛華等，2020；劉楠，2016）。響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 苦菜硒蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平

1.6 苦菜硒蛋白的抗氧化性分析

1.6.1 DPPH自由基清除能力 將提取得到的苦菜硒蛋白和維生素C配成系列濃度為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的樣品溶液，取各濃度樣品溶液2 mL分別置于試管中，加入0.1 mol/L無水乙醇配制的DPPH溶液2 mL，輕微振蕩混勻，室溫下暗處靜置30 min后在517 nm波長處測吸光值。A空白組為2 mL樣品液加入2 mL無水乙醇，A對照組為2 mL蒸餾水加入2 mL DPPH溶液（鄭翠萍等，2016；謝三都等，2015）。根據(jù)下列公式計(jì)算自由基清除率。

1.6.2 還原力的測定 將提取得到的苦菜硒蛋白和維生素C配成系列濃度為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的樣品溶液，取各濃度樣品溶液1 mL分別加入試管中，然后依次加入1 mL 0.2 mol/L、pH 6.0的PBS、1 mL 1%鐵氰化鉀，在50℃下水浴20 min，迅速冷卻后，加入1 mL濃度為10%的三氯乙酸，0.2 mL 0.1%氯化鐵,輕微振蕩混勻10 min后在700 nm波長處測吸光值。吸光值越大,說明總還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦菜硒蛋白提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 NaOH濃度對苦菜硒蛋白提取量的影響由圖1可知，當(dāng)NaOH濃度為0.1～0.2 mol/L時(shí)，硒蛋白的提取量隨著NaOH濃度的增加而上升；當(dāng)NaOH濃度為0.20～0.3 mol/L時(shí)，硒蛋白的提取量隨著NaOH濃度的增加而下降；當(dāng)NaOH濃度為0.20 mol/L時(shí)，苦菜硒蛋白的提取達(dá)到最佳值。因此，選取NaOH濃度為0.2 mol/L。

圖1 NaOH濃度對苦菜硒蛋白提取量的影響

2.1.2 超聲波時(shí)間對苦菜硒蛋白提取量的影響由圖2可知，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為10～14 min時(shí)，硒蛋白的提取量隨著超聲波時(shí)間的增加而上升；當(dāng)超聲波提取時(shí)間為14～18 min時(shí)，硒蛋白的提取量隨著超聲波提取時(shí)間的增加而下降；當(dāng)超聲波提取時(shí)間為14 min時(shí)，苦菜硒蛋白的提取量達(dá)到最佳值。因此，選取超聲波提取時(shí)間為14 min。

圖2 超聲提取時(shí)間對苦菜硒蛋白質(zhì)提取量的影響

2.1.3 料液比對苦菜硒蛋白提取量的影響 由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶15～1∶25 g/mL時(shí)，硒蛋白提取量隨著料液比的增加而上升；當(dāng)料液比為1∶25～1∶35 g/mL時(shí)，硒蛋白提取量隨著料液比的增加而下降；當(dāng)料液比為1∶25 g/mL時(shí)，苦菜硒蛋白提取量達(dá)到最佳值。因此，選取料液比為1∶25 g/mL。

圖3 料液比對苦菜硒蛋白提取量的影響

2.1.4 超聲波功率對苦菜硒蛋白提取量的影響由圖4可知，當(dāng)超聲波功率為58～78 W時(shí)，硒蛋白提取量隨著超聲波功率的增加而上升；當(dāng)超聲波功率為78～98 W時(shí)，硒蛋白提取量隨著超聲波功率的增加而下降；當(dāng)超聲波功率為78 W時(shí)，苦菜硒蛋白提取量達(dá)到最佳值。因此，選取超聲波功率為78 W。

圖4 超聲提取功率對苦菜硒蛋白提取量的影響

2.2 苦菜硒蛋白提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1苦菜硒蛋白提取試驗(yàn)結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取NaOH濃度、料液比、超聲波功率及超聲波時(shí)間為考察因素，根據(jù)響應(yīng)面分析法中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，苦菜硒蛋白提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 苦菜硒蛋白提取試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的建立 利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到苦菜硒蛋白提取量與NaOH濃度A、料液比B、超聲波功率C、超聲波時(shí)間D的二次回歸模型為：Y=2.51+7.333E-003A+0.017B-0.018C-0.070D+2.000E-003AB-0.015AC+0.032AD-4.750E-003BC-0.10BD+0.060CD-0.39A2-0.30B2-0.32C2-0.25D2。

對回歸模型進(jìn)行方差分析（表3），可以看出模型P＜0.0001，具有極顯著性，失擬項(xiàng)P=0.1694（P＞0.05），即方程模型失擬項(xiàng)不顯著，R2=0.9973說明回歸模型與預(yù)測值之間具有良好的擬合度，R2adj=0.9947，表明模型擬合度較好，可用于預(yù)測苦菜硒蛋白提取量的最佳情況，NaOH濃度、料液比、超聲波功率、超聲時(shí)間與苦菜硒蛋白提取量之間的線性關(guān)系顯著。因此可以用此模型對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。由表3可以看出看出，在試驗(yàn)所選各因素水平范圍內(nèi)B、C、D的P值均小于0.01，對模型影響極其顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2、和D2的P值均小于0.0001，對模型影響極其顯著；交互項(xiàng)AB、AC、BC的P值均大于0.05，說明它們的影響不顯著；交互項(xiàng)AD、BD、CD的P值均小于0.01，說明它們的影響極其顯著。所以由以上分析得出對苦菜硒蛋白提取量影響的主要順序?yàn)椋撼暡〞r(shí)間＞超聲波功率＞料液比＞NaOH濃度。

表3 苦菜硒蛋白回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.2.3 響應(yīng)面曲面分析 苦菜硒蛋白提取量影響的大小程度取決于響應(yīng)面曲面的坡度。等高線圖的形狀表明變量間的交互作用是否顯著，橢圓等高線表明變量間的交互作用顯著，圓形等高線表明交互作用不顯著。

由圖5可知，當(dāng)NaOH濃度為0.20 mol/L、料液比為125.26 g/mL時(shí)苦菜硒蛋白提取量最高。NaOH濃度相對于料液比來說對苦菜硒蛋白提取量的影響不太顯著。由等高線分析可知當(dāng)NaOH濃度不變時(shí)，沿著料液比變化的方向看料液比與NaOH濃度等高線呈圓形。說明NaOH濃度與料液比的交互作用對苦菜硒蛋白提取量的影響不顯著。

圖5 NaOH濃度與料液比的響應(yīng)面與等高線

由圖6可知，當(dāng)NaOH濃度為0.20 mol/L、超聲波功率為77.16 W時(shí)苦菜硒蛋白提取量最高。NaOH濃度相對于超聲波功率來說對苦菜硒蛋白提取量的影響不太顯著。由等高線分析可知當(dāng)NaOH濃度不變時(shí)，沿著料液比變化的方向看超聲波功率與NaOH濃度等高線呈圓形。說明NaOH濃度與超聲波功率的交互作用對苦菜硒蛋白提取量的影響不顯著。

圖6 NaOH濃度與超聲波功率的響應(yīng)面與等高線

由圖7可知，當(dāng)NaOH濃度為0.20 mol/L、超聲波時(shí)間為13.37 min時(shí)苦菜硒蛋白提取量最高。NaOH濃度相對于超聲波時(shí)間來說對苦菜硒蛋白提取量的影響不太顯著。由等高線分析可知當(dāng)NaOH濃度不變時(shí)，沿著超聲波時(shí)間變化的方向看超聲波時(shí)間等高線密集。說明超聲波時(shí)間對苦菜硒蛋白提取量的影響顯著。

圖7 NaOH濃度與超聲波時(shí)間的響應(yīng)面與等高線

由圖8可知，當(dāng)料液比為1∶25.26 g/mL、超聲波功率為77.16 W時(shí)苦菜硒蛋白提取量最高。料液比相對于超聲波功率來說對苦菜硒蛋白提取量的影響不太顯著。由等高線分析可知當(dāng)料液比不變時(shí)，沿著超聲波功率變化的方向看超聲波功率與料液比等高線呈圓形。說明超聲波功率與料液比的交互作用對苦菜硒蛋白提取量的影響不顯著。

圖8 料液比與超聲波功率的響應(yīng)面與等高線

由圖9可知，當(dāng)料液比為1∶25.26 g/mL、超聲波時(shí)間為13.37 min時(shí)苦菜硒蛋白提取量最高。料液比相對于超聲波時(shí)間來說對苦菜硒蛋白提取量的影響不太顯著。由等高線分析可知當(dāng)料液比不變時(shí)，沿著超聲波時(shí)間變化的方向看超聲波時(shí)間等高線密集。說明超聲波時(shí)間對苦菜硒蛋白提取量的影響顯著。

圖9 料液比與超聲波時(shí)間的響應(yīng)面與等高線

由圖10可知，當(dāng)超聲波功率為77.16 W、超聲波時(shí)間為13.37 min時(shí)苦菜硒蛋白提取量最高。超聲波功率相對于超聲波時(shí)間來說對苦菜硒蛋白提取量的影響不太顯著。由等高線分析可知超聲波功率不變時(shí)，沿著超聲波時(shí)間變化的方向看超聲波時(shí)間等高線密集。說明超聲波時(shí)間對苦菜硒蛋白提取量的影響顯著。

圖10 超聲波功率與超聲波時(shí)間的響應(yīng)面與等高線

2.2.4 最佳苦菜硒蛋白提取結(jié)果驗(yàn)證 由響應(yīng)面軟件對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分析得苦菜硒蛋白提取量的最佳試驗(yàn)條件為：NaOH濃度0.20 mol/L，料液比1∶25.26 g/mL，超聲波功率77.16 W，超聲波時(shí)間13.37 min，在此條件下的提取量為2.519 mg/g。根據(jù)優(yōu)化提取條件的試驗(yàn)結(jié)果，為了之后的方便操作，將苦菜硒蛋白的提取工藝條件調(diào)整為：NaOH濃度0.2 mol/L，料液比1∶25 g/mL，超聲波功率78 W，超聲波時(shí)間14 min。在根據(jù)優(yōu)化提取后的條件下，進(jìn)行3次的平行實(shí)驗(yàn)，得到苦菜硒蛋白的提取量為2.595 mg/g，與預(yù)測值相接近。

2.3 苦菜硒蛋白的抗氧化性分析

2.3.1 總還原力的檢測 由圖11可知，苦菜硒蛋白總還原能力，能夠表明抗氧化物供電子的能力，試驗(yàn)中配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，5個(gè)梯度的苦菜硒蛋白，并且評價(jià)其總還原力。從圖11中可知，苦菜硒蛋白在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)和維生素C一樣隨著濃度的升高總還原能力增強(qiáng)，但是始終低于維生素C的總還原能力。當(dāng)苦菜硒蛋白濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，總還原能力基本趨于穩(wěn)定。

圖11 苦菜硒蛋白的總還原力

2.3.2 對DPPH的清除作用 由圖12可知，與維生素C相比較，苦菜硒蛋白對DPPH的清除作用較強(qiáng)，隨著苦菜硒蛋白濃度的增加清除作用不斷增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL時(shí),其DPPH的清除率可達(dá)到63.2%，說明苦菜硒蛋白對DPPH有很好的清除作用。

圖12 苦菜硒蛋白不同濃度下的DPPH清除試驗(yàn)

3 結(jié)論

在超聲波提取苦菜硒蛋白的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化NaOH濃度、料液比、超聲波功率、超聲波時(shí)間這四個(gè)因素，得到提取硒蛋白的最佳工藝條件為：NaOH濃度0.2 mol/L，料液比1∶25 g/mL，超聲波功率78 W，超聲波時(shí)間14 min，得到苦菜硒蛋白提取量為2.595 mg/g。通過對苦菜硒蛋白抗氧化性分析得知，在濃度為0.1 mg/mL時(shí)，苦菜硒蛋白對DPPH的清除率可達(dá)到63.2%；而苦菜硒蛋白的總還原能力的結(jié)果表明，苦菜硒蛋白的總還原能力隨著濃度的增加而增加。超聲波輔助提取法具有提取率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，有效地提高了苦菜硒蛋白的提取量和提取產(chǎn)物的抗氧化能力，有良好的發(fā)展前景。