蔣彥，袁景川，耿彩平，宋歌，張旭慧，曹堯南

(石家莊市第四醫(yī)院 河北醫(yī)科大學(xué)石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，石家莊 050011)

作為胚胎實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵指標(biāo)，IVF及ICSI的正常受精率備受關(guān)注[1]。IVF受精率和正常受精率的分母均是IVF加精卵子總數(shù)，而ICSI受精率及正常受精率分母則是注射MⅡ卵子總數(shù)。在IVF/ICSI治療中，卵子成熟度與其受精能力密切相關(guān)。ICSI注射前通過(guò)剝除顆粒細(xì)胞可以直接以MⅡ率作為評(píng)估卵子成熟度的指標(biāo)，可用于預(yù)測(cè)ICSI正常受精率[2]。然而，IVF無(wú)法提前預(yù)知MⅡ率，所以對(duì)IVF正常受精率的預(yù)測(cè)效果較差。如果IVF受精率異常，首先應(yīng)分析IVF后第1天(D1)成熟卵率是否異常[1]。尤其對(duì)獲卵數(shù)少的患者，如果成熟卵率低，即使IVF成熟卵受精正常，也會(huì)造成受精率低的假相。因此我們考慮將IVF受精率分母改為D1成熟卵數(shù)(即IVF加精卵子總數(shù)-D1 MⅠ和GV卵)，能更真實(shí)地反映成熟卵受精情況。本研究對(duì)我中心獲卵數(shù)少患者的IVF及ICSI受精及胚胎情況進(jìn)行分析，探討改良IVF受精率的計(jì)算方式，以期對(duì)今后有關(guān)IVF受精率共識(shí)的制定提供一定參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2015年1月至2022年5月于石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI助孕治療、獲卵少患者的臨床資料。目前獲卵數(shù)少尚無(wú)明確的標(biāo)準(zhǔn)，本研究參照之前文獻(xiàn)[3-4]資料，將行IVF/ICSI助孕時(shí)獲卵數(shù)僅1～3枚的視為獲卵數(shù)少。納入標(biāo)準(zhǔn)：行IVF或ICSI助孕治療；獲卵數(shù)1～3枚；男方留取新鮮精液。排除標(biāo)準(zhǔn)：未行取卵或未取到卵的患者；冷凍精液、供精或供卵的患者。

最終納入1 777個(gè)獲卵少的周期，并根據(jù)授精方式不同分為IVF組(非男性因素不孕、行IVF授精，1 192個(gè)周期)和ICSI組(行ICSI授精，585個(gè)周期)，其中ICSI組中包含49個(gè)擬行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)的周期。比較兩組患者的MⅡ卵率、正常受精率、改良正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和可用胚胎率等。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用短方案、拮抗劑方案、微刺激方案、黃體期促排方案、自然周期及高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS)等進(jìn)行促排卵。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，根據(jù)雌激素水平選擇肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U或艾澤(默克雪蘭諾，意大利)250 μg扳機(jī)，34～36 h后B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。

2.精液處理：男方精液密度、活動(dòng)率基本正常者，采用密度梯度離心法處理；男方為嚴(yán)重的少、弱、畸形精子癥者，采用微量梯度離心法或洗滌法處理精液。精液處理的實(shí)驗(yàn)室操作均由專(zhuān)職技術(shù)人員完成。

3.IVF/ICSI：取卵后2～4 h視精液情況行IVF或ICSI授精。IVF：在加有卵子的雙井皿(Falcon，美國(guó))中加入處理后的精子，1 ml培養(yǎng)液內(nèi)加入精子15～30萬(wàn)條。IVF過(guò)夜受精后，采用機(jī)械吹打法去除卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞并觀察成熟卵數(shù)及受精情況。ICSI：用80 U/ml透明質(zhì)酸酶(H3757，Sigma，美國(guó))消化卵冠丘復(fù)合物30 s，用吸管吹吸去除顆粒細(xì)胞后按照常規(guī)操作行ICSI授精。

4.胚胎培養(yǎng)及評(píng)價(jià)：用Vitrolife序貫培養(yǎng)試劑(瑞利芙，瑞典)進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，使用日本Astec APM30D培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為6.0%CO2、5%O2、37℃。受精后18～20 h(D1)進(jìn)行受精評(píng)估，觀察到2個(gè)原核(2PN)和2個(gè)極體(2PB)為正常受精。根據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)[5]，于采卵后48 h及72 h進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。D3細(xì)胞數(shù)7～9個(gè)，卵裂球大小均勻，碎片<20%的1～2級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎；細(xì)胞數(shù)≥4個(gè)，3級(jí)以上胚胎為可用卵裂期胚胎。囊胚培養(yǎng)至D6形成3BC/3CB及以上級(jí)別囊胚為可用囊胚[6]。

5.觀察指標(biāo)：MⅡ卵率=MⅡ卵數(shù)/獲卵數(shù)；IVF正常受精率=正常受精卵子數(shù)/IVF加精卵子總數(shù)×100%；ICSI正常受精率=正常受精卵子數(shù)/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%；IVF改良正常受精率=正常受精卵子數(shù)/D1成熟卵數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精數(shù)×100%；可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/正常受精數(shù)×100%；可用囊胚形成率=可用囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，組間率(%)的比較采用χ2檢驗(yàn)，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2015—2022年獲卵數(shù)少周期的分布情況

2015年1月至2022年5月在我中心行輔助生殖治療的患者中獲卵數(shù)少(獲卵1～3枚)的周期共1 777個(gè)周期，占所有取到卵周期的比例為15.8%(1 777/11 231)；每年獲卵少周期數(shù)占全年取到卵周期數(shù)的比例范圍為13.1%～19.3%。1 777個(gè)周期中，675個(gè)周期獲得1枚卵，占38.0%；594個(gè)周期獲2枚卵，占33.4%；508個(gè)周期獲3枚卵，占28.6%。助孕治療的促排卵方案以拮抗劑方案和微刺激方案為主，分別占53.3%和20.6%；近3年隨著PPOS方案的出現(xiàn)和應(yīng)用增多，其比例有增多趨勢(shì)。具體情況見(jiàn)表1。

表1 各年獲卵少周期的分布情況(n，%)

二、獲卵少周期IVF/ICSI受精及胚胎發(fā)育情況

1 777個(gè)獲卵少的周期中，行IVF授精的1 192個(gè)周期(IVF組)，行ICSI授精的585個(gè)周期(ICSI組，其中擬行PGT 49個(gè)周期)。兩組患者的一般資料比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)；585個(gè)ICSI周期中有37個(gè)周期(6.3%)剝除顆粒細(xì)胞后因卵子因素(處于MⅠ、GV期或空透明帶)未行授精，其中獲1枚卵的未行授精周期高達(dá)15.4%(32/208)。

表2 兩組患者一般資料比較(-±s)

IVF組的MⅡ卵率(89.9% vs. 81.4%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(51.0% vs. 43.1%)和可用胚胎率(84.6% vs. 74.8%)均顯著高于ICSI組(P<0.05)，正常受精率顯著低于ICSI組(75.1% vs. 86.3，P<0.05)；而采用改良公式計(jì)算后，IVF組的改良正常受精率為83.6%，與ICSI組(86.3%)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 IVF組和ICSI組受精及胚胎發(fā)育情況比較(%)

ICSI組中有49個(gè)周期擬行PGT，15個(gè)周期獲1枚卵、13個(gè)周期獲2枚卵、21個(gè)周期獲3枚卵；其中有5個(gè)植入前非整倍體篩查(PGT-A)周期中途放棄囊胚培養(yǎng)，改行D3移植(3個(gè)周期)或冷凍(2個(gè)周期)。其余周期囊胚培養(yǎng)未獲得囊胚，最終僅17個(gè)周期(34.7%)行囊胚活檢。為觀察該49個(gè)周期的胚胎發(fā)育情況，將其具體數(shù)據(jù)單獨(dú)列出，詳見(jiàn)表4。

表4 擬行PGT周期的相關(guān)數(shù)據(jù)(%)

討 論

2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)(CSRM)的資料表明IVF和ICSI正常受精率的平均值分別為66.00%和73.83%[1]。2017年維也納共識(shí)[7]建議IVF正常受精率的能力值≥60%，ICSI正常受精率的能力值≥65%。即ICSI的正常受精率均略高于IVF正常受精率，造成這種差異的原因可能是因?yàn)樵谟?jì)算IVF受精率時(shí)，采用加精卵子總數(shù)即獲卵數(shù)(包括未成熟卵)作為分母，導(dǎo)致了分母比實(shí)際數(shù)值偏大；而ICSI計(jì)算受精率時(shí)分母僅為MⅡ卵數(shù)，與實(shí)際相符。

我中心數(shù)據(jù)顯示IVF周期正常受精率顯著低于ICSI周期(75.1% vs.86.3，P<0.05)，而改良后IVF正常受精率的分母改為D1 MⅡ卵數(shù)，最后數(shù)據(jù)僅稍低于ICSI周期(83.6% vs. 86.3%，P>0.05)；這可能是由于D1 MⅡ卵包含部分未成熟卵過(guò)夜后發(fā)育成為MⅡ卵。我中心數(shù)據(jù)顯示IVF MⅡ卵率顯著高于ICSI(89.9% vs. 81.4%，P<0.05)，說(shuō)明有約8.5%的未成熟卵過(guò)夜培養(yǎng)后發(fā)育成MⅡ卵。這與我們通過(guò)短時(shí)受精觀察到授精當(dāng)日(D0)未成熟的卵母細(xì)胞，D1可能發(fā)育成MⅡ卵的現(xiàn)象相似。

本研究中，IVF組的MⅡ卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率均顯著高于ICSI組(P<0.05)，正常受精率顯著低于ICSI組(P<0.05)，而IVF改良后正常受精率與ICSI組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。ICSI組中有6.3%的周期未行授精，IVF組則沒(méi)有，提示獲卵少且非男性因素不育的患者行輔助生殖治療時(shí)可以首選IVF授精。

有研究報(bào)道在僅獲得1枚卵母細(xì)胞的治療周期中，ICSI授精并不能提高臨床妊娠率、改善妊娠結(jié)局，而IVF授精在安全有效、節(jié)約費(fèi)用的同時(shí)能盡快獲得更好的妊娠結(jié)局[8]。另有研究報(bào)道，對(duì)于獲卵數(shù)<5枚的高齡患者，雖然IVF組的正常受精率顯著低于ICSI組(61.56% vs. 76.00%，P<0.001)，但I(xiàn)VF組和ICSI組的臨床妊娠率(21.59% vs. 13.25%)、活產(chǎn)率(12.16% vs. 6.02%)和流產(chǎn)率(43.68% vs. 54.55%)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；且IVF組的胚胎植入率(15.11% vs. 7.75%)和累積活產(chǎn)率(14.59% vs. 5.56%)顯著高于ICSI組(P<0.05)，提示對(duì)于非男性因素不育、獲卵數(shù)<5枚的高齡患者，傳統(tǒng)的IVF授精方式優(yōu)于ICSI[9]。

過(guò)多或過(guò)少的獲卵數(shù)均會(huì)導(dǎo)致正常受精率降低、異常受精率增加，可移植胚胎率與優(yōu)質(zhì)胚胎率下降，臨床妊娠率、胚胎種植率與活產(chǎn)率的下降[10]。當(dāng)獲卵數(shù)達(dá)到19枚時(shí)，累積活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)，不再增加[11]。而獲卵數(shù)≤5枚時(shí)，選擇卵裂期胚胎移植對(duì)患者更有益[12]。對(duì)于高齡患者，在進(jìn)行3個(gè)周期的IVF助孕后，累積活產(chǎn)率并不隨著IVF周期數(shù)的增加而明顯提高[13]。

本研究中，49個(gè)獲卵少的擬行PGT的周期中有5個(gè)PGT-A周期中途放棄囊胚培養(yǎng)，行D3移植或冷凍，最終僅有34.7%(17/49)的周期行囊胚活檢。提示對(duì)于獲卵數(shù)少的患者行PGT前應(yīng)充分權(quán)衡，以避免囊胚培養(yǎng)失敗導(dǎo)致的無(wú)胚胎可移植。在PGT助孕周期中，當(dāng)每周期獲卵數(shù)≥10枚時(shí)，患者的累積活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)[14]。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展及生育政策的調(diào)整，女性的生育年齡后移，在年齡因素、卵巢儲(chǔ)備能力下降、促排卵方案多樣性(長(zhǎng)方案、拮抗劑方案、微刺激方案、黃體期促排方案、自然周期等)多方面因素影響下，近年來(lái)獲卵少周期數(shù)逐漸增加[15]。

自2015年1月至2022年5月我中心獲卵數(shù)少(1～3枚)周期共1 777個(gè)，占取到卵周期總數(shù)的比例為15.8%(各年的比例為13.1%～19.3%)，未取卵、未取到卵、供精或供卵等周期未納入。取卵術(shù)前B超提示卵泡數(shù)少的患者取卵時(shí)普遍采用雙腔穿刺針，為保證回卵率，盡可能多的穿刺卵泡，反復(fù)沖洗，導(dǎo)致部分中小卵泡中未成熟卵被取出，未成熟卵率偏高。對(duì)于取卵術(shù)前B超提示卵泡數(shù)正常的患者，一般采用單腔穿刺針取卵，未成熟卵被取出的比例不高，因此傳統(tǒng)IVF正常受精率分母采用加精卵子總數(shù)產(chǎn)生的偏倚不大。但對(duì)獲卵少的患者，因其未成熟卵比例相對(duì)高，傳統(tǒng)的IVF正常受精率公式人為地增大了分母的數(shù)值，導(dǎo)致正常受精率數(shù)值降低。即使有的患者IVF全部成熟卵子均受精，但因其未成熟卵比例較高，仍會(huì)導(dǎo)致IVF受精率偏低。這部分患者如因男方因素行ICSI，受精率分母為成熟MⅡ卵數(shù)，對(duì)其計(jì)算無(wú)明顯影響。但臨床中大部分不孕不育患者是非男性因素，采用IVF授精，故出現(xiàn)IVF受精率偏低。

D1觀察到的成熟卵數(shù)還包括部分過(guò)夜后培養(yǎng)成熟的卵，這也是為什么只有ICSI才統(tǒng)計(jì)MⅡ卵率的原因；與獲卵數(shù)或加精卵子總數(shù)相比，MⅡ卵更能真實(shí)反映受精情況。IVF正常受精率是胚胎實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵指標(biāo)，所以我們建議將IVF正常受精率分母改為D1觀察到的成熟卵數(shù)(即IVF加精卵子總數(shù)-D1 MⅠ和GV卵)，這樣可以減少因?yàn)橛?jì)算方法導(dǎo)致的IVF受精率明顯低于ICSI而引起的歧義，尤其對(duì)非專(zhuān)業(yè)人士或患者，容易僅看數(shù)字誤認(rèn)為ICSI授精方式優(yōu)于IVF。之前張瑤佳等[16]在比較不明原因不孕患者行IVF、ICSI授精結(jié)局時(shí)，IVF組2PN受精率分母亦使用了MⅡ卵數(shù)。本研究改良IVF正常受精率計(jì)算方法與之相同；但I(xiàn)VF其他受精率(總受精率、多精受精率等)是否也可以采用同樣的改良計(jì)算方法，還需更多數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。

獲卵數(shù)少的患者不適宜通過(guò)短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI來(lái)避免全部受精失敗。有meta分析結(jié)果顯示非男性因素不孕患者行IVF的妊娠結(jié)局優(yōu)于ICSI[17]；但當(dāng)正常受精率數(shù)據(jù)出現(xiàn)差異時(shí)，在相似的助孕指征下，可能會(huì)導(dǎo)致生殖領(lǐng)域醫(yī)生和患者在選擇助孕方式時(shí)有所傾斜。如果使用改良IVF正常受精率，其與ICSI正常受精率的差異減小，對(duì)非男性因素不孕患者來(lái)說(shuō)更易于接受，且IVF授精后經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)，成熟卵子數(shù)比D0增加，提高了卵子利用率。另外，IVF周期中1PN來(lái)源胚胎是可用的，而ICSI周期中1PN來(lái)源胚胎往往是丟棄的[18]；并且有研究報(bào)道，ICSI周期中1PN率明顯高于IVF周期[19]，故在合適條件下采用IVF授精還可能提高胚胎利用率。因此，在臨床工作中，受精方式的選擇應(yīng)綜合考慮患者及配偶基礎(chǔ)情況、醫(yī)學(xué)指征，根據(jù)現(xiàn)有共識(shí)/指南等充分權(quán)衡后做出決定。

綜上，雖然改良IVF正常受精率的計(jì)算公式不會(huì)對(duì)后續(xù)妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響，但其能更好地反映成熟卵受精情況；且對(duì)于患者和非專(zhuān)業(yè)人士來(lái)說(shuō)，更便于理解和溝通。在臨床工作中，對(duì)獲卵少、非男性因素不孕的患者可以選擇IVF授精，其費(fèi)用較低、操作簡(jiǎn)單、體外暴露時(shí)間短、對(duì)卵子損傷小，正常受精率并不亞于ICSI，且胚胎發(fā)育情況明顯優(yōu)于ICSI。