顏 偉 王雅琦 陳潭琇

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的三分之一，每年約有150萬女性被確證為乳腺癌，具有高度侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[1]。我國乳腺癌發(fā)病率相對(duì)較低，但近年來發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，尤其是在上海、北京、天津及其他大城市[2]。據(jù)估計(jì)，乳腺癌在未來幾十年將成為我國女性發(fā)病率最高，對(duì)女性健康威脅最大的惡性腫瘤。因此，我們亟待尋找治療乳腺癌更為有效的方法[3]。近年來，隨著中藥應(yīng)用的不斷推廣，眾多研究人員將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)向抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長的中藥研究，在研究工作當(dāng)中人們發(fā)現(xiàn)康艾注射液是一種抗腫瘤中藥制劑，其副作用較小，可作為輔助藥物治療多種腫瘤，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4]。本研究以乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞為研究對(duì)象，研究康艾注射液在體外對(duì)其凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

乳腺癌細(xì)胞系 MCF7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶以及EDTA均購自美國 Gibco公司；FITC-Annexin V/PI試劑盒購自聯(lián)科生物公司；Caspase 3 抗體(1∶1000；#9661；Cell Signaling Technology，Inc.)PARP抗體(1∶1000； #9542；Cell Signaling Technology，Inc.)；β-actin抗體(1∶4000，A5316，Sigma)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分3組，分別用0 mM、20 mM、40 mM康艾注射液處理48 h。

1.3.2 Annexin-V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集經(jīng)康艾注射液處理過的細(xì)胞，3000×g室溫離心5 min。棄上清，加入500 μl 1× binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl FITC標(biāo)記Annexin V和10 μl PI室溫避光孵育5 min。樣品用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 Western Blot 用細(xì)胞裂解液(1% Triton X-100；10 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl； 0.25% sodium desoxycholate；5 mM EDTA，PH 7.4)裂解細(xì)胞，獲總蛋白。各組取15 μg總蛋白，采用10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜(Millipore，Bedford)，封閉液封閉1 h后，用一抗4 ℃過于孵育過夜，TBS-T清洗3次，用HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯影成像(Pierce，Rockford，IL，USA)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，兩組之間計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 康艾注射液促進(jìn)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡

采用Annexin-V/PI法檢測(cè)康艾注射液對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的影響。乳腺癌MCF7細(xì)胞經(jīng)康艾注射液干預(yù)48 h后，細(xì)胞凋亡率明顯增高，且40 mM康艾注射液處理組凋亡率高于20 mM康艾注射液處理組凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此提示康艾注射液可促進(jìn)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡，見圖1。

圖1 康艾注射液對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的影響

2.2 康艾注射液通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)凋亡

采用Western Blot檢測(cè)了康艾注射液對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase和PARP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，MCF7細(xì)胞經(jīng)康艾注射液處理后cl-Caspase和cl-PARP表達(dá)水平增高，且40 mM康艾注射液處理組的表達(dá)水平高于20 mM康艾注射液處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 康艾注射液對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的增長和生活水平的提高，我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)。目前，臨床上乳腺癌的治療主要采用手術(shù)、化療、激素治療以及放療等方式，這些治療方式對(duì)乳腺癌具有較好療效，但也存在一些副作用，比如白細(xì)胞降低、嘔吐、劇烈疼痛等。我們知道部分傳統(tǒng)中藥具有抗腫瘤作用且副作用小，另外，傳統(tǒng)中藥抗腫瘤作用方式不是通過作用于單一靶點(diǎn)發(fā)揮功能，它們可能兼具增強(qiáng)免疫功能、下調(diào)VEGF表達(dá)、調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)、逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生藥物耐受或者直接殺傷腫瘤的功能[5]。傳統(tǒng)中藥制劑康艾注射液，其主要成分為人參、黃芪和苦參素，臨床上作為化療輔助用藥應(yīng)用較廣，目前已有研究報(bào)道康艾注射液在抗腫瘤、促進(jìn)骨髓造血、提高機(jī)體免疫力及改善患者生存質(zhì)量等方面具有確切的作用。陳日等人用康艾注射液處理肝癌細(xì)胞后，肝癌細(xì)胞的增殖能力減弱，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞均減少，凋亡率增加，并且這種效應(yīng)隨康艾注射液濃度的升高而增強(qiáng)[6]。體外研究表明康艾注射液能夠抑制人類乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制克隆形成，誘導(dǎo)凋亡，Western Blot結(jié)果顯示其可能是通過影響AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[7]。蔣益蘭等報(bào)道康艾注射液可有效改善老年晚期消化系統(tǒng)腫瘤患者的臨床癥狀、提高生活質(zhì)量且具有較高的安全性[8]。另外，康艾注射液被報(bào)道還能夠用于治療結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌及淋巴瘤化療引起的白細(xì)胞減少癥。有報(bào)道顯示脾氣虧虛型老年結(jié)直腸癌術(shù)后xelox方案輔助化療患者在應(yīng)用康艾注射液后，患者主觀及客觀生活質(zhì)量有所提高(KPS評(píng)分和QLQ-C30評(píng)分較對(duì)照組提高)，具有促白細(xì)胞和血紅蛋白的作用，同時(shí)可減輕化療所致骨髓抑制、消化道反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)[9]。

本研究以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，旨在探討康艾注射液對(duì)乳腺癌MCF細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，康艾注射液處理后的MCF細(xì)胞凋亡率明顯升高，且40 mM劑量組細(xì)胞凋亡率高于20 mM劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比，MCF細(xì)胞在經(jīng)過康艾注射液處理后cl-Caspase3 和cl-PARP表達(dá)水平明顯升高，且40 mM劑量組細(xì)胞凋亡率高于20 mM劑量組(P<0.05)。綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)顯示康艾注射液具有誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡的功能，其主要通過促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白cl-Caspase3 和cl-PARP的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果說明康艾注射液在乳腺癌治療方面具有一定的效果，為乳腺癌臨床治療方案選擇提供一定的指導(dǎo)意義。