趙若楠，趙世剛

1 布魯氏菌及布魯氏菌病

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性球狀桿菌，可感染哺乳動物并引起布魯氏菌病。布魯氏菌病是危害最大的人獸共患傳染病之一，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重危害。目前，基于細(xì)菌學(xué)、致病性和宿主偏好，結(jié)合分子分型與全基因組測序，世界各地發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌共鑒定出12個生物種，包括6種“經(jīng)典”和6種“新發(fā)現(xiàn)”布魯氏菌[1]。在已知的布魯氏菌生物種中，對人類最具致病性的包括羊種、牛種、豬種和犬種布魯氏菌。該菌通過直接或間接接觸受感染動物、食用生肉和未經(jīng)煮沸或巴氏滅菌法處理的乳制品傳播給人類。主要傳播途徑是消化道、皮膚、黏膜、呼吸道與血液和氣溶膠之間的接觸。布魯氏菌的人際傳播極為罕見。農(nóng)民、牧民、屠宰場工人和獸醫(yī)等畜牧業(yè)相關(guān)工作者感染率較高，呈現(xiàn)出職業(yè)相關(guān)性[2]。自21世紀(jì)以來，人類布魯氏菌病發(fā)病率呈現(xiàn)急劇上升趨勢。

布魯氏菌病是一種多系統(tǒng)多臟器損傷性疾病，臨床表現(xiàn)常不典型且比較復(fù)雜。主要癥狀為發(fā)熱、乏力、多汗、食欲不振、體重減輕、肝脾及淋巴結(jié)腫大、肌肉疼痛、骨關(guān)節(jié)炎等器質(zhì)性病變,其中發(fā)熱和關(guān)節(jié)痛最為常見。該病的并發(fā)癥也較多,常見的有神經(jīng)血管、肌肉、骨關(guān)節(jié)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等病變，還可伴發(fā)一些罕見并發(fā)癥，比如合并心內(nèi)膜炎致腦栓塞、急性心肌梗死、熱性驚厥、甲狀腺危象及腦梗死，或者骨髓損傷、運動功能障礙等，嚴(yán)重影響了患者的身心健康和生活質(zhì)量[3]。

人類布魯氏菌病的發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚無確切定論，多數(shù)學(xué)者將其歸咎于自身免疫、免疫抑制、變態(tài)反應(yīng)、內(nèi)分泌紊亂以及免疫耐受等多因素的共同作用。目前已有的研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌首先侵入吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等[4]，當(dāng)細(xì)菌在淋巴結(jié)中繁殖生長，形成感染灶時，增殖到一定數(shù)量便會突破淋巴結(jié)屏障進入血液循環(huán)，人體將出現(xiàn)以發(fā)熱為主要表現(xiàn)的菌血癥、毒血癥等[5]。研究表明，該菌能逃脫吞噬細(xì)胞的吞噬、殺傷功能，也可以抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞免疫機制，如果它在吞噬細(xì)胞中存活并生長繁殖，將會導(dǎo)致長期的慢性感染[6]。

2 固有免疫

哺乳動物的免疫由固有免疫和適應(yīng)性免疫兩種主要的免疫系統(tǒng)控制，這兩種免疫系統(tǒng)是對抗病原體入侵和維持宿主穩(wěn)態(tài)的必要條件。布魯氏菌入侵機體時，在宿主中首先激活固有免疫，產(chǎn)生多種炎癥因子以清除細(xì)菌并控制感染，這在人體免疫防御中起到重要作用。固有免疫首先會利用一種受體來激活，這些受體可以識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)[7]，最常見的PAMPs是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、細(xì)菌脂蛋白、鞭毛蛋白和來自病毒、細(xì)菌、真菌和哺乳動物的核酸。宿主固有免疫系統(tǒng)可以通過多種病原模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)與這些PAMPs相互作用。目前，在布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)的PRR包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、維甲酸誘導(dǎo)基因1樣受體(RIG-I-like receptors ，RLRs)、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)和DNA受體[8]，DNA受體又包括黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2，AIM2)和干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)[9]。一個完整的微生物病原體顯示一組PAMPs，激活宿主細(xì)胞中的多個PRR。這被認(rèn)為是激活多個細(xì)胞內(nèi)信號通路的第一步。因此，PAMPs與特定PRR相互作用后啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通常介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的激活。被激活的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，最終導(dǎo)致炎癥因子、I型干擾素(Interferon ，IFN)、趨化因子和其他化合物的表達，從而產(chǎn)生對抗感染的有效作用[10]。

在本文中，我們討論布魯氏菌感染的固有免疫機制中STING模式識別受體、傳感通路、信號級聯(lián)的調(diào)節(jié)及受體所發(fā)揮的作用，將有助于理解宿主對病原體感染中STING參與的固有免疫應(yīng)答機制，為進一步探索布魯氏菌感染的免疫機制及治療布魯氏菌病提供基礎(chǔ)。

3 干擾素基因刺激因子

干擾素基因刺激因子(STING)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留的跨膜蛋白，它調(diào)節(jié)I型干擾素(Interferon，IFN)依賴的固有免疫反應(yīng)，當(dāng)它暴露于細(xì)胞質(zhì)DNA時，會易位到某些核周位點，進而促進炎癥因子的表達[11]。它在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和選擇性成纖維細(xì)胞中表達[12]。STING作為一個二聚體，包含4個跨膜螺旋和一個突出到細(xì)胞質(zhì)中的球狀羧基末端結(jié)構(gòu)域(Carboxyl-Terminal Domain，CTD)，該區(qū)域的C端尾(very C-terminal tail,CTT)使STING處于自抑制狀態(tài)[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)在布魯氏菌感染后，STING參與固有免疫的激活及調(diào)節(jié)機制如下。

3.1 DNA釋放 在布魯氏菌感染后固有免疫應(yīng)答過程中，細(xì)菌dsDNA必須進入細(xì)胞質(zhì)以激活STING，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌激活STING需要分解細(xì)菌、脫離BCV并隨后將細(xì)菌DNA釋放到胞質(zhì)中。第二信使環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate ，c-di-GMP)是一種重要的細(xì)菌代謝調(diào)節(jié)劑，它可以根據(jù)環(huán)境信號(如磷酸鹽、氧和一氧化氮水平以及光照)改變細(xì)菌代謝和毒性。它在使布魯氏菌成功感染細(xì)胞過程中發(fā)揮了重要作用[14]。布魯氏菌c-di-GMP誘導(dǎo)接頭分子STING的激活，觸發(fā)I型IFN和重組人干擾素調(diào)節(jié)因子1(Interferon Regulatory Factor 1，IRF-1)，導(dǎo)致鳥苷酸結(jié)合蛋白(Guanylate Binding Protein，GBPs)的表達[15]。I型IFN信號通路在細(xì)菌感染期間促進細(xì)菌裂解，細(xì)胞釋放的I型IFN也可以自分泌或旁分泌的方式結(jié)合I型IFN受體亞單位IFNAR1和IFNAR2，通過IFN刺激基因因子3(Interferon Regulatory Factor 3，IRF3)促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，上調(diào)數(shù)百個IFN誘導(dǎo)基因的產(chǎn)生。在這些基因家族中，編碼GBP成員GBP2、GBP5和免疫相關(guān)GTP酶(immunity-related gtpase，IRG)成員IRGB10的基因通過I型IFN通路的轉(zhuǎn)錄因子IRF1上調(diào)[16]。GBPs與含有布魯氏菌的囊泡相互作用，它的溶菌作用導(dǎo)致囊泡的裂解和細(xì)菌及其成分逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，并被細(xì)胞質(zhì)傳感器識別。最近，其他研究表明GBPs的機制中IRGB10直接靶向細(xì)胞質(zhì)細(xì)菌，破壞了細(xì)菌結(jié)構(gòu)的完整性，并介導(dǎo)了配體的胞質(zhì)釋放，以STING識別[17]。

3.2 STING激活 布魯氏菌DNA釋放到胞質(zhì)后，STING不僅作為一種受體直接參與DNA傳感，還可以作為一種適配器。因此，STING的激活可以通過兩種不同的機制完成。首先，STING可以直接識別細(xì)菌DNA，從而作為主要的模式識別受體[18]。另外，通過環(huán)GMP-AMP合成酶(cGAS)的DNA傳感觸發(fā)cGAMP的合成，然后讓STING作為二級受體參與[19]。cGAS包含2個主要的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1個核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。在DNA缺失時，cGAS以自抑制狀態(tài)存在。布魯氏菌感染后胞質(zhì)DNA與cGAS結(jié)合后觸發(fā)STING激活，產(chǎn)生第二信使環(huán)GMP-AMP (cGAMP)。cGAMP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的STING結(jié)合，誘導(dǎo)分子的構(gòu)象改變，導(dǎo)致STING和TANK 結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)重新定位到細(xì)胞的核周區(qū)域，從而激活[17]。在激活后，STING由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位到高爾基體，招募胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TBK1進而磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3 (Interferon Regulatory Factor 3，IRF3)，磷酸化的IRF3二聚，然后進入細(xì)胞核。STING還激活 IkB激酶(Inhibitor of kappa B kinase ，IKK)，使轉(zhuǎn)錄因子NF-kB16的抑制劑IkB家族磷酸化。磷酸化的IkB蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解，核因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-kB)進入細(xì)胞核，與IRF3和其他轉(zhuǎn)錄因子一起作用，誘導(dǎo)干擾素IFN和炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1b和IL-6的表達。見圖1。

圖1 gGAS-STING信號通路[20]Fig.1 The gGAS-STING pathway[20]

3.3 通路調(diào)節(jié)

3.3.1 RNA pol III RNA聚合酶III(RNA polymerase III，RNA pol III)檢測到布魯氏菌DNA的某些片段并轉(zhuǎn)錄為RNA配體，可能通過RIG-I途徑誘導(dǎo)IFN-b。抑制RNA pol III的酶活性可消除部分布魯氏菌DNA誘導(dǎo)的IFN-b的表達。這些結(jié)果表明，RNA pol III在檢測布魯氏菌感染期間的細(xì)菌DNA中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)菌DNA可被RNA聚合酶III和STING途徑感知，以協(xié)調(diào)I型IFN的產(chǎn)生[21]，但兩種途徑相互協(xié)調(diào)關(guān)系及具體作用尚不明確。

3.3.2 MAVS STING也被報道是一種與線粒體抗病毒信號受體(mitochondria antiviral signaling protein，MAVS)相互作用的蛋白[22]，雖然STING針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但它與轉(zhuǎn)體MAVS相互作用，進而可能激活TRAF3/TBK1/IKKi和IRF3/IRF7，導(dǎo)致I型IFN的表達，并導(dǎo)致NF-kB通路的激活。MAVS通過RNA聚合酶III (RNA pol III)活性，通過RIG-I途徑參與DNA傳感，它作用于RIG-I的下游，IkB和IRF3的磷酸化的上游[23]。MAVS最初被描述為一種參與病毒雙鏈RNA傳感的細(xì)胞內(nèi)分子。研究者研究了該分子在不同病毒感染中的作用[24]。然而，但關(guān)于其在細(xì)菌核酸識別中的作用鮮有報道，結(jié)果存在爭議。Campos等研究結(jié)果表明，在布魯氏菌的核酸識別中存在適配分子MAVS[23]。然而，需要進一步的研究來確定布魯氏菌感染期間MAVS的功能。

3.3.3 UPR 有研究表明布魯氏菌增殖導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)破壞和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)啟動[25]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過加工和折疊分泌蛋白和膜蛋白，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。錯誤折疊蛋白的積累可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活保守內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞，稱為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。在哺乳動物細(xì)胞中，可通過一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜應(yīng)激傳感器控制UPR，保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在布魯氏菌感染的背景下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在誘發(fā)炎癥反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用[26]。布魯氏菌誘導(dǎo)的UPR是由細(xì)菌c-di-GMP以STING依賴的方式觸發(fā)的，這種響應(yīng)支持細(xì)菌復(fù)制。布魯氏菌DNA與STING結(jié)合后可動員內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，UPR調(diào)控幾種促炎介質(zhì)的誘導(dǎo)，包括IL-6、IL-1b和 GBPs。UPR的誘導(dǎo)同樣直接刺激IFN-b的表達[27]。

3.3.4 Omp25 Li等的研究首次描述布魯氏菌外膜蛋白(Outer membrane protein 25，Omp25)通過靶向cGAS降解抑制IFN-β的表達。Omp25通過泛素蛋白酶體促進cGAS的降解，抑制了STING和IRF3的磷酸化，以及磷酸化IRF3在人巨噬細(xì)胞中的核易位，因此干擾cGAS/STING信號通路的激活，最終抑制IFN-β的產(chǎn)生，使表達Omp25的細(xì)胞更容易被其他病原體感染[28]。這揭示了Omp25在調(diào)節(jié)IFN-β產(chǎn)生中的作用，這可能為布魯氏菌病的預(yù)防提供了新的見解。

3.3.5 HIF-1α 穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1α((hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是細(xì)胞代謝和固有免疫細(xì)胞功能的全局調(diào)節(jié)器，穩(wěn)定的HIF-1α可促進caspase-1的激活和IL-1β的釋放，驅(qū)動病原體清除[29]。STING激活驅(qū)動線粒體活性氧(mROS)的產(chǎn)生，這有助于HIF-1α的穩(wěn)定。因此，STING通過激活HIF-1α途徑可能有助于控制布魯氏菌感染[30]。

3.4 STING的作用 布魯氏菌DNA是誘導(dǎo)I型IFN和IL-1b的主要細(xì)菌成分，STING在其中發(fā)揮了重要作用。STING是外源性DNA配體誘導(dǎo)IFN-b的必要條件，也是各種DNA病原體在感染后誘導(dǎo)IFN-b的必要條件[23]。STING缺失對依賴NF-kB的細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6的產(chǎn)生有部分影響[31]。

STING和cGAS對參與I型IFN通路很重要，但只有STING才能誘導(dǎo)IL-1b分泌、caspase-1激活以及GBP2和GBP3表達。并且，在巨噬細(xì)胞和體內(nèi)，STING而不是cGAS在控制細(xì)菌感染中發(fā)揮主要作用，缺乏cGAS仍可觀察到與布魯氏菌保護性免疫相關(guān)的先天免疫效應(yīng)機制的激活。此外，STING激活導(dǎo)致GBPs表達和炎癥小體激活，GBPs在AIM2激活、誘導(dǎo)炎性小體激活和IL-1b分泌中也起關(guān)鍵作用。并且，GBP蛋白在控制布魯氏菌過程中發(fā)揮協(xié)同作用，GBPs對宿主保護比GBP2更重要[17]。

雖然STING可以保護細(xì)胞不受布魯氏菌感染，但感染早期，布魯氏菌下調(diào)了STING mRNA和蛋白的表達，這種顯著抑制表明，布魯氏菌會主動破壞這種固有免疫傳感器，從而在巨噬細(xì)胞內(nèi)得以存活。通過上調(diào)miR-24的STING抑制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，并且miR-24的誘導(dǎo)和STING的抑制需要活菌，而完全抑制則需要VirB操縱子編碼的IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)，這表明這是一個活躍的細(xì)菌驅(qū)動過程，而不是簡單的宿主對布魯氏菌PAMPs的反應(yīng)?？傊?，細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌通過miR-24介導(dǎo)的STING表達抑制在感染期間逃避了完全的STING激活[32]。這里闡明了布魯氏菌免疫逃逸的一個關(guān)鍵機制，布魯氏菌通過主動破壞固有免疫傳感器STING的細(xì)胞質(zhì)監(jiān)測來建立其細(xì)胞內(nèi)生態(tài)位。

4 STING信號通路與布魯氏菌病相關(guān)癥狀

目前對布魯氏菌感染中與STING信號通路相關(guān)的免疫機制與臨床表現(xiàn)的研究有限，以下推測以炎癥因子作為連接免疫機制與臨床表現(xiàn)的橋梁，根據(jù)信號通路所激活的炎癥因子及布魯氏菌病的主要癥狀做出相關(guān)推斷，但炎癥因子可通過多種途徑產(chǎn)生，與STING信號通路之間并不存在特異性，所以STING受體的激活與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性仍處于推測階段，其是否具有相關(guān)性及其密切程度仍有復(fù)雜的作用機制需要進一步探索。

4.1 中樞型神經(jīng)布魯氏菌病 如上文所述，布魯氏菌誘導(dǎo)STING的激活，觸發(fā)I型IFN和IRF-1導(dǎo)致GBPs表達。GBPs與含有布魯氏菌的囊泡相互作用，導(dǎo)致囊泡的裂解并將其內(nèi)DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)并激活A(yù)IM2[33]。此外，細(xì)菌誘導(dǎo)的線粒體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)激活。NLRP3和AIM2活化觸發(fā)含有ASC和半胱天冬酶-1的炎癥小體的組裝，導(dǎo)致IL-1β加工和成熟IL-1β的分泌[34]。同時，STING受體激活后信號通路的一系列作用也可產(chǎn)生IL-1β。IL-1β可以激活血腦屏障的微血管內(nèi)皮，并導(dǎo)致白細(xì)胞募集到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這在神經(jīng)布魯氏菌病發(fā)病機制中起到重要作用[35]。

4.2 布魯氏菌病關(guān)節(jié)炎 布魯氏菌感染引起的骨損傷的機制尚不完全清楚。骨損傷可歸因于細(xì)菌的直接作用或由先天免疫引發(fā)的炎癥所致的免疫病理學(xué)過程。感染布魯氏菌后，巨噬細(xì)胞可引起 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎癥因子的釋放，這些炎癥因子能夠誘導(dǎo)未分化的骨髓細(xì)胞形成破骨細(xì)胞。TNF-α是骨吸收的有效誘導(dǎo)劑，它是通過激活成熟破骨細(xì)胞參與病理改變的主要促炎因子[36]。STING信號通路激活后可通過一系列反應(yīng)釋放上述相關(guān)炎癥因子，再次推測STING信號通路可能參與了布魯氏菌病關(guān)節(jié)炎的免疫機制。

4.3 早期感染控制 IL-6是STING受體激活后產(chǎn)生的重要的炎癥因子之一，研究表明IL-6是感染布魯氏菌病后免疫過程中的重要調(diào)節(jié)因子，一般被認(rèn)為是急性期炎癥反應(yīng)的激活劑，并且是控制感染早期體內(nèi)布魯氏菌復(fù)制所必需的，有助于宿主抵抗感染[37]。因此，IL-6可能成為一個有希望的治療靶點。

5 意義及展望

在感染初期或急性期，機體能否及時控制布魯氏菌的復(fù)制并成功消滅感染，固有免疫是關(guān)鍵所在。細(xì)胞內(nèi)DNA傳感器在誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)對抗病原體感染的潛在機制正在被廣大學(xué)者研究。然而，其在布魯氏菌病中的作用機制并不十分明確，還有待進一步研究，比如布魯氏菌DNA在胞質(zhì)中與DNA受體的識別途徑以及各信號級聯(lián)如何調(diào)控、布魯氏菌DNA的識別過程中GBP的靶向是如何調(diào)節(jié)的等等。此外，在布魯氏菌感染過程中，多種受體同時參與了固有免疫激活，各種受體傳感器之間是否存在相互影響、是否互相調(diào)節(jié)尚不明確。目前，STING作為腫瘤治療相關(guān)靶點的研究較多，是否可作為布魯氏菌病等感染型疾病的治療靶點以及在疫苗中的應(yīng)用還有待繼續(xù)探索。STING在布魯氏菌對固有免疫機制調(diào)控方面仍有很多環(huán)節(jié)尚不明了，因此有待我們做更深入的研究和探討，以期對布魯氏菌病的預(yù)防和早期治療提供有用的線索。

利益沖突：無