廖一漠，敖曉琳*，康海燕，何甜，楊林

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)2(西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝，860000)

我國古代就有將發(fā)霉的谷物作引子來發(fā)酵熟谷物使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫频挠涊d，形成早期的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。與工業(yè)生產(chǎn)所用的直投式發(fā)酵劑不同，傳統(tǒng)發(fā)酵食品所用的發(fā)酵劑菌種更豐富且來源更廣泛，這使得傳統(tǒng)發(fā)酵食品具有更加獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)成分，因此很多企業(yè)希望將其進行規(guī)模化生產(chǎn)，但目前效果不夠理想，主要原因是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中復(fù)雜且數(shù)量龐大的微生物群體使得發(fā)酵過程難以控制，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定并存在一定安全風(fēng)險。為了擴大傳統(tǒng)發(fā)酵食品的市場，應(yīng)對其微生物種群、發(fā)酵過程以及微生物間的相互作用進行更深入的研究。多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中都含有乳酸菌和酵母菌，兩者在發(fā)酵食品中占據(jù)極為重要的地位，對兩者的研究能夠解決目前傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)展所遇到的一些問題。

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)乳酸的無芽胞革蘭氏陽性菌，也是食品中公認(rèn)的益生微生物，具有促進消化吸收、維持腸道菌群平衡、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]，而酵母菌是一類典型的單細(xì)胞微生物，能將糖發(fā)酵成酒精和CO2，在有氧和無氧環(huán)境下都能生存，屬于兼性厭氧菌[4]。兩者共同參與發(fā)酵制得的產(chǎn)品主要有酸馬奶酒、酸面團、乳酪等，其相互作用機制較為復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)兩者間存在的互作機制可分為以下3類：(1)代謝產(chǎn)物互補；(2)群體感應(yīng)現(xiàn)象；(3)影響細(xì)胞生長，其中代謝產(chǎn)物間的互補是發(fā)現(xiàn)較早也是最為常見的。

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品及其菌種

傳統(tǒng)發(fā)酵食品在生產(chǎn)過程中所涉及到的微生物種類繁多，大多包含了十幾種到幾十種微生物，這些微生物的共同作用賦予了傳統(tǒng)發(fā)酵食品獨特的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地。如表1所示，多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中都含有乳酸菌和酵母菌，且往往不以單一菌種的形式存在。已有報道證實多菌種的復(fù)雜發(fā)酵體系是傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味的重要來源[5]。其中對產(chǎn)品風(fēng)味影響較突出的是乳酸菌和酵母菌2類。因此，在對多種復(fù)雜微生物菌群間互作關(guān)系研究較為困難的情況下，探究乳酸菌和酵母菌二者間存在的互作關(guān)系，能夠在一定程度上解析發(fā)酵微生物與食品品質(zhì)的相關(guān)性，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的工業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

2 乳酸菌與酵母菌互作機制研究方法

乳酸菌與酵母菌間存在的互作關(guān)系多為協(xié)同作用，包括互相利用代謝產(chǎn)物、互相修復(fù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)生長狀態(tài)、提升抗熱能力等，但也有研究表明二者在一些條件下還存在拮抗作用，DA SILVA等[14]發(fā)現(xiàn)希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)會顯著抑制酵母菌生長，LVAREZ-MARTN等[15]也發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)在與酵母菌共培養(yǎng)中生長被抑制。這說明乳酸菌與酵母菌間的互作關(guān)系并不是單純的協(xié)同或拮抗，而有著更加復(fù)雜的互作機制，隨著研究的深入，對二者互作機制的研究方法也在逐步改進，可歸納為傳統(tǒng)方法和新興的代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等。

2.1 傳統(tǒng)方法在互作機制中的應(yīng)用

傳統(tǒng)方法通常是將二者混合發(fā)酵的部分代謝產(chǎn)物、生長狀態(tài)等指標(biāo)作為分析目標(biāo)，間接地推測乳酸菌和酵母菌間存在的互作機制。王美霞[16]將篩選得到存在代謝互補的乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)后，分離出能夠促進乳酸菌生長的酵母菌代謝產(chǎn)物，以此來分析2株菌間的互作原理，經(jīng)鑒定認(rèn)為該促進物質(zhì)是蛋白或肽類物質(zhì)的混合物。賀銀鳳等[17]則將乳酸菌和酵母菌的無菌代謝產(chǎn)物交叉培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)乳酸菌的無菌發(fā)酵液能夠?qū)湍妇纳L起到促進作用，而酵母菌的無菌發(fā)酵液能夠顯著增強乳酸菌的產(chǎn)酸能力。通過分析乳酸菌和酵母菌共同培養(yǎng)時的代謝產(chǎn)物和生長狀態(tài)能夠分離并鑒定出影響兩者生長代謝的物質(zhì)，以此推測二者間的互作機制，這類方法在早期研究中應(yīng)用廣泛且效果良好，但微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物數(shù)量龐大，通過逐個分離鑒定的方式工作量較大且不系統(tǒng)，解析微生物的相互作用機制需要大量數(shù)據(jù)作為支撐，代謝組學(xué)技術(shù)可以達到這一目的。

2.2 代謝組學(xué)在互作機制中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)是對微生物發(fā)酵過程中全部的小分子代謝產(chǎn)物進行鑒定，并利用生物信息數(shù)據(jù)庫分析出發(fā)酵過程中所涉及到的代謝通路，進而解析微生物間的互作機制，為精準(zhǔn)調(diào)節(jié)傳統(tǒng)食品的發(fā)酵作用提供依據(jù)。代謝組學(xué)是研究某一細(xì)胞、組織、器官或生物體中所有小分子代謝組分集合的科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)，前者是對某一類代謝產(chǎn)物進行分析而后者范圍更寬泛，目標(biāo)是從生物樣本中同時分析盡可能多的代謝物[18]，能夠?qū)Πl(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)物變化進行更全面的研究。

孫哲航[19]利用代謝組學(xué)比較了干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,M2-L2)和單孢釀酒酵母(Kazachstaniaunispora,M4-Y2)單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物變化情況，發(fā)現(xiàn)相較于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵產(chǎn)生了更多的長鏈脂肪酸，這解釋了混菌發(fā)酵產(chǎn)酸速率更快的現(xiàn)象。而混菌發(fā)酵體系中更多的甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和精氨酸，證明氨基酸可能是促進乳酸菌增殖的重要因子。BLASCHE等[20]通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)馬乳酒乳桿菌(Lactobacilluskefiranofaciens)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)共培養(yǎng)時，腸膜明串珠菌乳酸產(chǎn)量增加并消耗了更多的氨基酸，同樣證實了兩者間存在氨基酸代謝互補機制。KADYAN等[21]利用非靶向代謝組學(xué)確定植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵時的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，其中混菌體系中糖類含量更低，推測是混菌發(fā)酵提升了糖類的利用率。

代謝產(chǎn)物是微生物代謝過程的最后環(huán)節(jié)，代謝物質(zhì)的變化是由于微生物自身調(diào)控引起還是其他因素對物質(zhì)本身的影響需要結(jié)合基因?qū)用婀餐治觥?/p>

2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在互作機制中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是針對功能基因的一種研究方法，通過篩選混菌發(fā)酵過程中表達差異顯著的相關(guān)基因，利用功能注釋和通路分析等手段解析微生物之間的互作機制。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究目的不僅是針對轉(zhuǎn)錄組樣本中每個基因的表達水平的變化，也包括轉(zhuǎn)錄組的定位和注釋及每個基因的功能和結(jié)構(gòu)測定[22]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過對微生物總mRNA進行提取分析，可以了解到微生物在發(fā)酵過程中代謝、生長、結(jié)構(gòu)等方面的變化，以此反應(yīng)發(fā)酵中微生物間的互作機制。

如表2所示，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在解析各類發(fā)酵食品的微生物互作現(xiàn)象中已有應(yīng)用，通過篩選出發(fā)酵前后表達差異性顯著的基因，再利用生物信息數(shù)據(jù)庫得到相關(guān)通路，來挖掘二者的互作機制。其中楊浣漪[23]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對比釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)單菌發(fā)酵和與舊金山乳桿菌(LactobacillusSanfranciscensis)混菌發(fā)酵面團的差異基因，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母共有625個基因上調(diào)，571個基因下調(diào)，其中編碼甘油-3-磷酸酶的基因HOR2明顯上調(diào)，說明混菌發(fā)酵能夠增加甘油合成。而編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因PCK1表達明顯下調(diào)，解釋了混菌發(fā)酵可增加有機酸合成。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)以樣品中全部微生物RNA為研究對象，能夠從整體上分析樣本中優(yōu)勢微生物和基因表達情況，張國華等[24]采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析酸面團不同發(fā)酵時期菌種的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞過程、發(fā)展過程、代謝過程轉(zhuǎn)運活性方面的基因豐度超過10%，說明乳酸菌和酵母菌之間存在代謝產(chǎn)物互補機制。研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵所影響的相關(guān)通路主要包括氨基酸代謝、丙酮酸代謝等，其中氨基酸代謝在較多實驗中都有發(fā)現(xiàn)，說明乳酸菌和酵母菌的互作與氨基酸的合成和利用具有一定相關(guān)性。但轉(zhuǎn)錄組學(xué)只能體現(xiàn)微生物將要進行的生理活動，而這些生理活動是否發(fā)生還需要結(jié)合相關(guān)代謝產(chǎn)物進行驗證。

表2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在解析微生物互作機制中的應(yīng)用Table 2 Application of transcriptomics in the analysis of microbial interaction mechanism

3 乳酸菌與酵母菌的互作機制

乳酸菌和酵母菌間復(fù)雜的相互作用關(guān)系使得二者相較于單獨生長時，在生長狀態(tài)、代謝產(chǎn)物、菌群結(jié)構(gòu)等方面存在諸多差異。范維等[30]發(fā)現(xiàn)在乳酸菌發(fā)酵牛乳的過程中添加馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxiamus)能夠促進乳酸菌的生長，并使保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)提前進入對數(shù)期，且酵母菌的存在還可以延遲嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的衰亡。較多乳酸菌和酵母菌間的相互作用效果都向著對生長代謝有利的方向進行，而如何進一步加以利用則需要更加深入地研究二者間的相互作用機制。

3.1 代謝產(chǎn)物互補

代謝互補機制是在乳酸菌和酵母菌間廣泛存在的一類相互作用機制，較常見的是乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳糖酶分解乳糖為半乳糖，為非乳糖代謝型酵母提供碳源，而酵母菌代謝產(chǎn)生的氨基酸等物質(zhì)又能被乳酸菌作為營養(yǎng)物質(zhì)利用[31]。因此，在以乳糖為碳源時，乳酸菌和酵母菌間更容易發(fā)生互惠作用，常見的代謝互補等現(xiàn)象多發(fā)生于乳制品中。如表3所示，各類發(fā)酵食品中存在已發(fā)現(xiàn)的代謝互補機制，這類機制存在的主要原因是不同微生物所具備的酶系不同，由于乳酸菌和酵母菌各自缺乏分解某種碳源所需要的特異性酶，因此需要利用對方所代謝的酶解產(chǎn)物進一步反應(yīng)。如圖1所示，當(dāng)以乳糖為唯一碳源時，由于多數(shù)酵母菌不具有乳糖酶，無法直接利用乳糖，因此需要乳酸菌所具備的α-半乳糖苷酶將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可作為碳源直接進入EMP途徑被大多數(shù)乳酸菌和酵母菌利用，但乳酸菌缺乏足夠的半乳糖激酶，無法進一步利用半乳糖。馬克斯克魯維酵母的參與能夠?qū)肴樘寝D(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖進入EMP途徑，最終形成丙酮酸，在乳酸脫氫酶的作用下產(chǎn)生乳酸，這一機制也解釋了乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵能夠產(chǎn)生更多乳酸這一現(xiàn)象。

表3 部分發(fā)酵食品中代謝互補機制Table 3 Metabolic complementation mechanism in partially fermented foods

圖1 乳酸菌和酵母菌共同利用乳糖Fig.1 Lactic acid bacteria and yeasts use lactose together

乳酸菌的生長對營養(yǎng)物質(zhì)需求較苛刻，除糖類外還需要氨基酸、維生素等，酵母菌生長所需物質(zhì)條件則較為簡單。因此在發(fā)酵過程中，酵母菌還扮演著為乳酸菌提供生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的角色，如圖2所示，在富含氮源的生長環(huán)境中，酵母菌的TORC1信號通路受到刺激，調(diào)節(jié)產(chǎn)生氨基酸，為乳酸菌提供必備的生長因子，而乳酸菌分解乳糖所產(chǎn)生的葡萄糖同時可被酵母菌利用。這一代謝互補機制使得乳酸菌在酵母菌的參與下即使處于營養(yǎng)物質(zhì)較匱乏的發(fā)酵環(huán)境中仍然能夠生長。

圖2 乳酸菌和酵母菌對氮的代謝互補[27]Fig.2 Lactic acid bacteria and yeast complement the metabolism of nitrogen

3.2 影響細(xì)胞生長

乳酸菌和酵母菌在共同培養(yǎng)下，其生長情況相較于單獨培養(yǎng)有著顯著差異，王小標(biāo)等[35]發(fā)現(xiàn)馬克斯克魯維酵母可以顯著促進干酪乳桿菌的生長，而乳酸乳球菌可以顯著促進馬克斯克魯維酵母的生長。洪家麗等[36]則發(fā)現(xiàn)在紅曲黃酒釀造過程中，不同種類的乳酸菌對酵母菌細(xì)胞的生長情況影響不同，其中干酪乳桿菌會顯著抑制釀酒酵母的生長。這樣的現(xiàn)象主要由乳酸菌和酵母菌通過直接或間接途徑影響彼此細(xì)胞生長所造成，其作用途徑包括競爭作用和分泌影響細(xì)胞生長的代謝產(chǎn)物等。

競爭是微生物間常見的一種互作關(guān)系，MENDES等[28]發(fā)現(xiàn)乳酸菌和酵母菌間存在對脂肪酸的競爭關(guān)系，以此影響細(xì)胞生長。而在青貯飼料中，乳酸菌與酵母菌的營養(yǎng)競爭現(xiàn)象同樣存在，在發(fā)酵前期，乳酸菌作為優(yōu)勢菌種與酵母菌進行營養(yǎng)競爭使得酵母菌生長緩慢[37]。

代謝產(chǎn)物對細(xì)胞生長的影響在發(fā)酵過程中更為普遍，乳酸菌代謝產(chǎn)生大量乳酸，過度積累將導(dǎo)致環(huán)境pH降低從而抑制酵母細(xì)胞生長，而酵母菌所分泌的乙醇也會影響乳酸菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，乙醇與乳酸還能進行酯化反應(yīng)，在一定程度上降低對二者自身細(xì)胞的損傷。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌代謝產(chǎn)生的CO2、維生素B6等物質(zhì)均能夠刺激乳酸菌生長，而乳酸菌產(chǎn)生的乳酸對陽離子具有螯合作用，能夠減輕陽離子對酵母菌細(xì)胞的影響[38-40]。張文娟等[41]則發(fā)現(xiàn)，酵母菌產(chǎn)生乙醇可以與乳酸菌代謝的乳酸進行酯化反應(yīng)，以防止乳酸堆積造成乳酸菌自身生長減緩。

3.3 群體感應(yīng)現(xiàn)象

早期群體感應(yīng)定義為細(xì)菌隨著菌體密度的增大和生長周期的變化分泌出一種或幾種化學(xué)信號分子，從而導(dǎo)致其生理和生化特性的變化，顯示出少量菌體或單個菌體所不具備的特征[42]，但進一步研究發(fā)現(xiàn)真菌和昆蟲群體中也存在這類感應(yīng)現(xiàn)象，其中食源性微生物的群體感應(yīng)調(diào)控性狀包括生物膜形成、耐酸脅迫、細(xì)菌素代謝和定向生長等[43]。乳酸菌作為革蘭氏陽性菌具有的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)如圖3所示，包括種間群體感應(yīng)系統(tǒng)和G+群體感應(yīng)系統(tǒng)，其信號分子主要為呋喃硼酸二酯(AI-2)以及寡肽類(AIPs)2種，種間群體感應(yīng)系統(tǒng)由LuxS基因和Pfs基因調(diào)控，G+群體感應(yīng)系統(tǒng)主要包括ABC(ATP-binding cassette transporter)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和雙組分系統(tǒng)(two component signaling system，TCS)2個部分，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)負(fù)責(zé)將寡肽類信號分子轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，雙組分系統(tǒng)則負(fù)責(zé)檢測細(xì)胞外的信號分子濃度，并加以調(diào)控。酵母菌中所檢測出的信號分子包括色氨酸以及一些醇類、酸類物質(zhì)，如苯乙醇等，已有報道指出，乙酸可被作為信號分子調(diào)控釀酒酵母W141產(chǎn)生2,3-丁二醇[44]，但部分酵母菌無法產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子，而是利用其代謝產(chǎn)物影響乳酸菌分泌信號分子，以達到影響乳酸菌生長代謝的效果。

圖3 種間群體感應(yīng)系統(tǒng)及革蘭氏陽性群體感應(yīng)系統(tǒng)Fig.3 Interspecies quorum sensing system and Gram-positive quorum sensing system

廉雪花[45]將4株酵母菌與2株乳酸菌分別進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中一株酵母菌能夠促進乳酸菌分泌AI-2信號分子，而其余3株酵母菌均抑制AI-2信號分子的產(chǎn)生，但4株酵母菌的代謝產(chǎn)物均能促進乳酸菌分泌AI-2信號分子。PROUST等[46]將酵母菌的代謝產(chǎn)物添加到嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)環(huán)境中，檢測到shCDS顯著表達，推測是酵母菌代謝產(chǎn)物中的部分多肽物質(zhì)刺激了乳酸菌的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)機制，顧悅[47]也發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的無菌代謝產(chǎn)物能夠刺激屎腸球菌8-3產(chǎn)生AI-2信號分子，進一步研究發(fā)現(xiàn)其中部分代謝產(chǎn)物具有抑制LuxS基因轉(zhuǎn)錄，促進Pfs基因轉(zhuǎn)錄的作用。

4 總結(jié)與展望

乳酸菌和酵母菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的微生物，二者的互作機制一直是研究熱點。近年來組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為解析微生物互作機制提供了新的思路，從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)到蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)，針對微生物生長代謝的每個階段都有較為全面的研究手段，但各種組學(xué)技術(shù)都存在自身的局限性，無法對微生物從基因?qū)用娴椒置诖x物的整個過程進行分析，因此便需要多種組學(xué)技術(shù)共同使用，在技術(shù)上互補可使對互作機制的解析更加系統(tǒng)。隨著組學(xué)技術(shù)的成熟，將多組學(xué)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)方法對關(guān)鍵代謝產(chǎn)物和微生物生長狀態(tài)的分析將會成為解析微生物間的相互作用機制的有效手段。

解析乳酸菌和酵母菌的互作機制目的在于掌握并調(diào)節(jié)二者的混菌發(fā)酵過程，工業(yè)生產(chǎn)上一般通過優(yōu)化發(fā)酵底物和控制發(fā)酵條件來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程，而解析出二者互作機制作為理論依據(jù)后便可進行更加精準(zhǔn)的調(diào)控，如針對傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味難以控制的問題，可以通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)以達到精準(zhǔn)調(diào)節(jié)發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的目的。這樣的調(diào)控方式更易操作，目的性也更強，可以作為解決傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化問題的一種思路。