李雅雪 盤耀亮 彭光粉 田江 陸星 梁翠月

摘要： 【目的】低磷和鋁毒脅迫是酸性土壤中限制作物生產(chǎn)的重要因素。植物NTL 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種環(huán)境脅迫（包括鋁毒脅迫） 的適應(yīng)性機(jī)制，本文探究GmNTLs 調(diào)控大豆Glycine max 根系響應(yīng)低磷脅迫的功能。【方法】通過RT-qPCR 分析大豆15 個(gè)GmNTLs 基因在根系響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式，進(jìn)一步構(gòu)建了GmNTL1/4/7/8/10/12 共6 個(gè)GmNTLs 基因的擬南芥超量表達(dá)材料，探究GmNTL 成員在擬南芥根系中響應(yīng)低磷脅迫的功能?！窘Y(jié)果】系統(tǒng)進(jìn)化樹及組織表達(dá)模式分析結(jié)果表明，GmNTLs 家族分3 個(gè)亞族，各亞族成員在大豆中組織表達(dá)模式不同。RT-qPCR 結(jié)果表明，低磷處理12 d 顯著提高了GmNTL1/4/7/8/10/12 在大豆根系中的表達(dá)。在擬南芥中超量表達(dá)不同GmNTL 基因?qū)Φ土椎捻憫?yīng)不同。高磷處理下，超量表達(dá)GmNTL4/10/12 擬南芥的鮮質(zhì)量顯著增加；低磷處理時(shí)，超量表達(dá)GmNTL4顯著提高擬南芥鮮質(zhì)量，而超量表達(dá)GmNTL1/12 擬南芥的鮮質(zhì)量顯著降低。同時(shí)，僅超量表達(dá)GmNTL12擬南芥的主根長(zhǎng)顯著縮短，而超量表達(dá)其他基因?qū)M南芥植株的主根長(zhǎng)無明顯影響。【結(jié)論】GmNTLs 參與大豆根系對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)，該結(jié)果可為培育磷高效型大豆品種提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞： 大豆；根系；低磷脅迫；GmNTLs；NTL 轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)： Q945.78；S529文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1001-411X（2023）02-0221-09

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2） 是與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫相關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子[1]。NTL（NACwith transmembrane motif like） 則是蛋白C 端帶有跨膜結(jié)構(gòu)域的一類NAC 轉(zhuǎn)錄因子[ 2 ]。研究顯示，NTL 家族成員在調(diào)控生物、非生物脅迫應(yīng)答和植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[3]。目前多個(gè)NTL 的功能被報(bào)道，例如，超量表達(dá)擬南芥ANAC017/AtNTL7增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的耐受性[4]；在擬南芥中超量表達(dá)ANAC005 抑制了與木質(zhì)素、形成層、初生壁等生物合成相關(guān)的基因的表達(dá)，造成植株矮化[ 5 ]；在擬南芥中異源表達(dá)玉米ZmNTL1、ZmNTL2 和ZmNTL5，可以降低轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)H2O2 的敏感性[6]；超量表達(dá)AtNTL6 增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱能力[7]；AtNTL8 在鹽脅迫下調(diào)控赤霉素（GA） 途徑促使種子萌發(fā)，同時(shí)調(diào)控?cái)M南芥的開花時(shí)間[8]；AtNTL6 受冷脅迫，誘導(dǎo)PR1、PR2 和PR5 等相關(guān)抗病基因的表達(dá)[9]。

我國(guó)南方地區(qū)土壤多呈酸性。低磷和鋁毒是酸性土壤中長(zhǎng)期共存的營(yíng)養(yǎng)逆境因子，植物為了適應(yīng)酸性土壤的缺磷和鋁毒脅迫，進(jìn)化出各種協(xié)同調(diào)控和應(yīng)答機(jī)制，如分泌有機(jī)酸、改變根系形態(tài)構(gòu)型等[10-14]。大豆Glycine max 是重要的糧油兼用作物，我國(guó)大豆產(chǎn)量不足以滿足國(guó)內(nèi)需求，需依賴進(jìn)口[15]。南方酸性土壤中存在低磷、鋁毒脅迫從而限制了大豆的生產(chǎn)[ 1 6 ]。在大豆基因組中鑒定到1 5 個(gè)GmNTL 同源基因并對(duì)其進(jìn)行了功能分析，結(jié)果表明，超量表達(dá)GmNTL1、GmNTL7 等顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽害和干旱的耐受能力[17-19]。前期研究結(jié)果表明，GmNTLs 參與了大豆耐鋁毒脅迫，超量表達(dá)GmNTL4 可能通過調(diào)控外排有機(jī)酸或細(xì)胞壁修飾相關(guān)基因來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鋁的耐受性[ 2 0 ]。進(jìn)一步比較分析野生型（WT） 和超量表達(dá)GmNTL4 轉(zhuǎn)基因擬南芥根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一些與根系生長(zhǎng)相關(guān)的基因，包括RGF2、Extensin、Auxin-responsive protein 等，均受GmNTL4 調(diào)控，而一些磷平衡相關(guān)基因，包括紫色酸性磷酸酶基因P A P 2 0 （ A t 3 g 5 2 7 8 0 ）、酸性磷酸酶基因V S P 1（At5g24780） 和VSP2 （At5g24770） 等，也受GmNTL4調(diào)控，但未發(fā)現(xiàn)磷轉(zhuǎn)運(yùn)子相關(guān)基因受GmNTL4 調(diào)控[20]。據(jù)此，我們猜測(cè)GmNTLs 可能參與了大豆生長(zhǎng)對(duì)低磷的適應(yīng)性機(jī)制。因此，本研究首先對(duì)大豆基因組中15 個(gè)GmNTL 成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹和組織部位表達(dá)模式分析，然后利用RT-qPCR 測(cè)定該家族成員響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式，進(jìn)一步構(gòu)建GmNTLs 超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，對(duì)其鮮質(zhì)量和總根長(zhǎng)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)采用的大豆材料為磷高效品種‘粵春03-3（YC03-3）；擬南芥材料為哥倫比亞野生型（Col-0）。1.2 大豆GmNTLs 基因家族進(jìn)化及表達(dá)模式預(yù)測(cè)分析在Phytozome 網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html） 利用BLAST 搜索引擎查找G m N T L s 家族氨基酸序列。使用軟件M E G A 7（http：//http//www.mega software.net） 以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。利用S o y B a s e 數(shù)據(jù)庫(kù)（ h t t p s ： / / w w w .soybase.org/soyseq/） 獲得大豆GmNTLs 家族基因的組織表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.3 大豆不同磷濃度處理

大豆磷處理試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)研究中心的溫室大棚中進(jìn)行。用砂培萌發(fā)種子3～4 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)均一的大豆幼苗轉(zhuǎn)移至Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行磷處理：250 μmol·L?1 KH2PO4（高磷） 和5 μmol·L?1 KH2PO4（低磷）。每個(gè)處理4 次重復(fù)，每次重復(fù)4 株苗。收取處理6、12 d 的大豆生理樣品，測(cè)量主根長(zhǎng)，稱取鮮質(zhì)量，同時(shí)收取根系樣品用液氮速凍后保存在?80 ℃ 冰箱備用。設(shè)置5、50 和250 μmol·L?1 KH2PO4 3 個(gè)磷濃度，處理12 d，分析不同磷濃度下大豆G m N T L s 家族基因的表達(dá)模式。

1.4 植物RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR

用TRIzol（Omega，美國(guó)） 法提取大豆根系RNA；使用HiScript?1st Strand cDNA SynthesisKit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，北京），將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA 單鏈。在NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 設(shè)計(jì)GmNTLs 基因及大豆看家基因GmEF1a 的定量PCR 引物（GmNTL1 的正向引物為GTCGTCGAGTGTTACCCACA，反向引物為CGTAGCTCGGTTCAACCTGT；GmNTL4 的正向引物為GCCGTTAGGGTTCCGTTTC，反向引物為GCTCCTTCAAAGTGGGACGATA；GmNTL7 的正向引物為CCCAAGTGCATCAGAAGGCT，反向引物為GCAGTGTCTTTACCTGCTGC；GmNTL8 的正向引物為CAATATGTGCGGAGGAAG，反向引物為G T G A T G A T G A G T A G T T G G A T T ；G m N T L 1 0 的正向引物為T T C T G C C C T A CCGATGAGGA，反向引物為TTTCGCTCTTTGC C A G T T G C ； G m N T L 1 2 的正向引物為CATGGATATTTGCTCACCCTGC，反向引物為AGGCTTGTGCCATTTTCAGC；GmEF1a 的正向引物為TGCAAAGGAGGCTGCTAACT，反向引物為CAGCATCACCGTTCTTCAAA），用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，美國(guó)） 測(cè)定，相對(duì)表達(dá)量為目的基因表達(dá)量與看家基因表達(dá)量的比值。

1.5 大豆GmNTLs 家族基因克隆及重組載體構(gòu)建

從Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得大豆GmNTLs 家族中GmNTL1、GmNTL4、GmNTL7、GmNTL8、GmNTL10 和GmNTL12 基因的C DS 序列，在NCBI 網(wǎng)站設(shè)計(jì)其正反向引物，按照一步克隆法連接華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)研究中心保存的3 5 S ： p T F 1 0 1S 載體。測(cè)序正確后，利用試劑盒Hipure Fungal DNA Mini Kit （Magen，廣州） 抽取質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 超量表達(dá)GmNTLs 轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)化與篩選

將“1.5”獲取的6 個(gè)GmNTLs 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（唯地，上海），使用花序侵染法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化。獲得T0 代擬南芥轉(zhuǎn)基因種子后，取種子用5% （φ） 次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒，均勻種植在含0.025% （φ） 除草劑的擬南芥MS 固體萌發(fā)培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)條件為日長(zhǎng)12 h、光照4 000 lx、溫度23 ℃、相對(duì)濕度75%，黑暗12 h、溫度21 ℃、相對(duì)濕度75% 的人工氣候箱（萊福儀器，寧波） 中生長(zhǎng)14 d 左右。將正常存活且長(zhǎng)出4 片葉子的T1 代存活幼苗移植到蛭石、基質(zhì)質(zhì)量比為1∶3 的混合基質(zhì)中，在12 h 光照/12 h 黑暗條件下生長(zhǎng)，待植株葉片較大時(shí)取樣進(jìn)行PCR 檢測(cè)來篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。分株收取陽(yáng)性T1 代種子重復(fù)上述的篩選步驟，獲得存活幼苗為T2 代，選取T2 代種子于平板篩選陽(yáng)性和陰性植株分離比為3∶1 的株系進(jìn)行T3 代純合體的篩選。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥低磷脅迫處理

將T3 代轉(zhuǎn)基因植株種子和野生型擬南芥種子消毒后播種在MS 固體萌發(fā)培養(yǎng)基上，待根長(zhǎng)至1 cm左右，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至1 250 μmol·L? 1KH2PO4 的高磷處理、12.5 μmol·L?1 KH2PO4 的低磷處理MS 培養(yǎng)基上，在“1.6”人工氣候箱中處理12 d，收樣，測(cè)定植株鮮質(zhì)量和主根長(zhǎng)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過M i c r o s o f t E x c e l2019（Microsoft，美國(guó)） 和IBM SPSS StatisticsV26.0（IBM SPSS，美國(guó)） 進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)分析。用TBtools 軟件（http：//www.tbtools.com/） 繪制表達(dá)模式熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNTLs 蛋白家族進(jìn)化樹及組織表達(dá)模式分析

對(duì)15 個(gè)GmNTLs 家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，GmNTLs 家族分為I、II 和III 3 個(gè)亞家族，7 個(gè)復(fù)制對(duì)。其中GmNTL2/12 和GmNTL8/13 2 個(gè)復(fù)制對(duì)屬于第I 亞族；GmNTL6/15 和GmNTL7/142 個(gè)復(fù)制對(duì)屬于第I I 亞族， G m N T L 1 / 1 1 、G m N T L 3 / 4 和G m N T L 9 / 1 0 3 個(gè)復(fù)制對(duì)及GmNTL5 屬于第III 亞族（圖1）。

利用SoyBase 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GmNTLs 基因在不同組織部位的表達(dá)水平構(gòu)建表達(dá)模式熱圖，（其中GmNTL5、GmNTL6 和GmNTL9 這3 個(gè)基因未被收錄），結(jié)果如圖1 所示。第I 亞家族成員在各組織部位中幾乎不表達(dá)。第I I 亞族中G m N T L 7 和G m N T L 1 4 在各組織部位表達(dá)量都很低；GmNTL15 主要在根和根瘤中表達(dá)。第III 亞族中GmNTL1 在根中有較低表達(dá)量；GmNTL3 在新葉、根瘤、花后14 d 的莢中表達(dá)量較高；GmNTL4 主要在根瘤和花后14 d 的莢中表達(dá)，其中在根瘤中的表達(dá)量最高。

2.2 不同磷處理時(shí)間對(duì)大豆生長(zhǎng)及GmNTLs 基因家族表達(dá)模式的調(diào)控

使用水培體系對(duì)大豆YC03-3 幼苗進(jìn)行高磷（ 2 5 0 μ m o l · L ? 1 K H 2 P O 4 ） 和低磷（ 5 μ m o l · L ? 1KH2PO4） 處理6、12 d 后分別收樣。結(jié)果顯示，高、低磷處理6、12 d 后，高磷處理大豆的地上部生物量要明顯高于低磷處理的；而低磷處理大豆的根系要比高磷處理的發(fā)達(dá)（圖2、3）。具體表現(xiàn)為，處理6、12 d 后，與高磷處理相比，低磷處理的地上部干質(zhì)量顯著減少3.6% 和43%（圖3A）；同時(shí)，處理12 d后，低磷處理的根系干質(zhì)量和總長(zhǎng)度分別顯著增加5.5% 和39%（圖3B、3C）。以上結(jié)果表明，低磷處理顯著促進(jìn)大豆根系的生長(zhǎng)，植物可以通過根系生長(zhǎng)的變化來適應(yīng)低磷脅迫。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果，從GmNTLs 家族的6 個(gè)復(fù)制對(duì)中各挑取1 個(gè)基因包括G m N T L 1 、G m N T L 4 、G m N T L 7 、G m N T L 8 、G m N T L 1 0 和GmNTL12，分析不同磷有效性和磷處理時(shí)間對(duì)大豆GmNTLs 在根系表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，GmNTLs 家族基因的表達(dá)量均在6 或12 d 受低磷脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)（圖4）。在磷處理6 d 后，低磷條件下， G m N T L 1 、G m N T L 4 、G m N T L 8 和GmNTL12 的表達(dá)水平分別比高磷的高1.8、1.8、2.1 和2.1 倍（圖4A、4B、4D、4F），GmNTL7/10 與高磷條件下無明顯差異（圖4C、4E）。磷處理12 d 后，低磷條件下G m N T L 1 、G m N T L 4 、G m N T L 7 、GmNTL8、GmNTL10 和GmNTL12 的表達(dá)水平分別比高磷條件下高3.5、5.5、1.5、3.5、1.9 和3.2 倍（圖4），這些結(jié)果表明GmNTLs 參與了大豆根系適應(yīng)低磷脅迫過程。

2.3 不同磷處理濃度對(duì)大豆根系中GmNTLs 表達(dá)模式的影響

從“2.2”結(jié)果可知，當(dāng)磷處理12 d 后，大豆根系中GmNTLs 的表達(dá)模式受低磷誘導(dǎo)上調(diào)較為顯著，因此進(jìn)一步探究了不同磷濃度（5、50 和250μmol·L?1 KH2PO4） 處理12 d 對(duì)大豆根系GmNTLs表達(dá)模式的影響。結(jié)果表明：隨著磷處理濃度的降低，GmNTLs 基因的表達(dá)量整體顯著上調(diào)（圖5）。當(dāng)磷濃度從250 μmol·L?1 下降到50 μmol·L?1 時(shí)，除GmNTL10 基因的表達(dá)量無明顯變化外，其他基因的表達(dá)量均隨磷濃度降低而顯著上調(diào)，上調(diào)比例介于22.1%～142.6%；而當(dāng)磷濃度從50 μmol·L?1 進(jìn)一步下降到5 μmol·L?1 時(shí)，6 個(gè)GmNTLs 的表達(dá)量均顯著上調(diào)，上調(diào)比例介于20.3%～129.7%。以上結(jié)果進(jìn)一步表明GmNTLs 基因參與了大豆根系響應(yīng)低磷脅迫的過程，但各成員響應(yīng)程度有差異。

2.4 低磷脅迫對(duì)超量表達(dá)GmNTLs 擬南芥生長(zhǎng)的影響

野生型和超量表達(dá)GmNTLs 的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗在高、低磷MS 固體培養(yǎng)基處理12 d 后，分析植株鮮質(zhì)量和主根長(zhǎng)。結(jié)果（圖6、7、8） 顯示，與野生型（WT） 相比，高磷條件下，超量表達(dá)GmNTL4、GmNTL10 和GmNTL12 促進(jìn)了擬南芥植株的生長(zhǎng)，其鮮質(zhì)量分別顯著增加11.0%、12.4%， 13.0%、14.4% 和22.2%、16.2%（圖7B、7E、7F）；低磷條件下，超量表達(dá)GmNTL4 擬南芥鮮質(zhì)量顯著增加8.3%、15.9%（圖7B），而超量表達(dá)GmNTL1 和GmNTL12 擬南芥鮮質(zhì)量顯著減少11.4%、13.3%和17.8%、17.5%（圖7A、7F）。與鮮質(zhì)量相似，在高磷條件下，超量表達(dá)GmNTL4 和GmNTL12 植株的主根長(zhǎng)顯著增加4.7%、3.8% 和7.0%（圖8B、8F）；在低磷條件下，超量表達(dá)GmNTL12 植株的主根長(zhǎng)顯著減少7 . 7 % 、6 . 8 % （ 圖8 F ） 。超量表達(dá)GmNTL7 和GmNTL8 基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)無明顯影響（圖7C、7D、8C、8D）。結(jié)果表明不同GmNTL 基因成員對(duì)擬南芥響應(yīng)低磷脅迫的功能不同。

3 討論與結(jié)論

植物NTL 轉(zhuǎn)錄因子參與干旱、鹽害、滲透和鋁毒等非生物脅迫[7， 18-23]。酸性土壤中鋁毒和低磷脅迫共同存在，植物進(jìn)化出一系列協(xié)同調(diào)控應(yīng)答機(jī)制[10-14]，Lin 等[20] 研究表明，GmNTLs 參與了大豆耐鋁毒脅迫，但是否調(diào)控大豆根系響應(yīng)低磷脅迫還未見報(bào)道。本研究通過設(shè)置不同磷濃度和不同脅迫時(shí)間處理，解析低磷脅迫對(duì)GmNTLs 基因在大豆根系中表達(dá)水平的調(diào)控模式，發(fā)現(xiàn)GmNTLs 基因成員都不同程度地受到低磷誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，暗示這些GmNTLs基因均在大豆響應(yīng)低磷脅迫中發(fā)揮作用；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同基因成員響應(yīng)模式有所區(qū)別，其中GmNTL1、GmNTL4、GmNTL8 和GmNTL12 基因的表達(dá)量在低磷處理6、12 d 后顯著大幅度上調(diào)，而GmNTL7 和GmNTL10 基因的表達(dá)量在低磷處理6 d 時(shí)無明顯變化，只在12 d 后顯著上調(diào)。不同磷濃度處理的結(jié)果也類似，GmNTL10 基因的表達(dá)量只在極度缺乏磷時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，而其他基因表達(dá)量隨磷濃度減少不斷顯著增加，暗示這些GmNTLs基因在大豆適應(yīng)低磷脅迫中可能起重要的作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證GmNTLs 在大豆根系響應(yīng)低磷脅迫中的功能，本研究通過擬南芥的異源表達(dá)，構(gòu)建了超量表達(dá)GmNTL1/4/7/8/10/12 6 個(gè)基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因材料；結(jié)果顯示，不同GmNTL 基因成員在擬南芥響應(yīng)低磷脅迫中的功能不同。超量表達(dá)GmNTL4 和GmNTL12 基因后，擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的鮮質(zhì)量和主根長(zhǎng)與野生型差異顯著。例如，高磷條件下，超量表達(dá)GmNTL4 的轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮質(zhì)量和主根長(zhǎng)均顯著高于野生型，但低磷條件下其主根長(zhǎng)無明顯變化，說明GmNTL4 可能參與了植株地上部生長(zhǎng)對(duì)磷供應(yīng)的適應(yīng)性的調(diào)控，但對(duì)根系的調(diào)控作用不明顯。另外， 低磷條件下， 超量表達(dá)GmNTL12 的轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮質(zhì)量和主根長(zhǎng)均顯著低于野生型，而高磷條件下，超量表達(dá)GmNTL12 的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型與低磷相反。主根縮短是擬南芥根系響應(yīng)低磷脅迫的重要反應(yīng)之一[24]，低磷誘導(dǎo)的擬南芥主根生長(zhǎng)是由生長(zhǎng)素信號(hào)途徑因子TIR1、A U X / I A A 、A t A R F 1 9，以及STOP1、LPR1 和P D R 2 等多基因調(diào)控的綜合結(jié)果[ 2 5 - 2 8 ] 。關(guān)于GmNTL12 為什么在不同磷處理下對(duì)根系生長(zhǎng)的影響不同，其調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。與GmNTL4相反，超量表達(dá)GmNTL1 和GmNTL12 顯著降低了轉(zhuǎn)基因株系在低磷條件下的鮮質(zhì)量，暗示GmNTL1和GmNTL12 可能參與植物適應(yīng)低磷脅迫的負(fù)調(diào)控。無論是在高磷還是低磷條件下，超量表達(dá)GmNTL7和GmNTL8 基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮質(zhì)量和主根伸長(zhǎng)均無明顯影響。當(dāng)植物處于逆境時(shí)，膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核后發(fā)揮功能[29]。超量表達(dá)NTLs全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因幼苗與對(duì)照之間通常不存在表型差異，但是當(dāng)去除過表達(dá)基因跨膜域后，表型出現(xiàn)明顯差異[21， 30]；推測(cè)超量表達(dá)GmNTL7 和GmNTL8 轉(zhuǎn)基因擬南芥在受到低磷脅迫時(shí)，可能沒有誘導(dǎo)膜釋放或膜釋放不當(dāng)，導(dǎo)致這2 個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型無表型差異。

綜上所述，低磷脅迫上調(diào)了大豆根系中GmNTL1/4/7/8/10/12 基因的表達(dá)，GmNTLs 參與了大豆根系對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)。本研究結(jié)果可為后續(xù)深入研究NTL 在大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

OOKA H， SATOH K， DOI K， et al. Comprehensive analysisof NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsisthaliana[J]. DNA Research， 2003， 10（6）： 239-247.

KIM S Y， KIM S G， KIM Y S， et al. Exploring membrane-associated NAC transcription factors in Arabidopsis：Implications for membrane biology in genome regulation[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（1）： 203-213.

趙翠珠， 劉振華， 趙赫， 等. 植物NAC 膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)， 2012， 24（1）： 74-80.

CHI Y H， MELENCION S， ALINAPON C V， et al. Themembrane-tethered NAC transcription factor， AtNTL7，contributes to ER-stress resistance in Arabidopsis[J]. Biochemicaland Biophysical Research Communications，2017， 488（4）： 641-647.

ZHAO J， LIU J S， MENG F N， et al. ANAC005 is amembrane-associated transcription factor and regulatesvascular development in Arabidopsis[J]. Journal of IntegrativePlant Biology， 2016， 58（5）： 442-451.

WANG D， YU Y， LIU Z， et al. Membrane-bound NACtranscription factors in maize and their contribution to theoxidative stress response[J]. Plant Science， 2016， 250：30-39.

KIM M J， PARK M， SEO P J， et al. Controlled nuclearimport of the transcription factor NTL6 reveals a cytoplasmicrole of SnRK2.8 in the drought-stressresponse[J]. Biochemical Journal， 2012， 448（3）： 353-363.

KIM S， LEE A， YOON H， et al. A membrane-boundNAC transcription factor NTL8 regulates gibberellicacid-mediated salt signaling in Arabidopsis seed germination[J]. Plant Journal， 2008， 55： 77-88.

SEO P J， KIM M J， PARK J， et al. Cold activation of aplasma membrane-tethered NAC transcription factor inducesa pathogen resistance response in Arabidopsis[J].Plant Journal， 2010， 61（4）： 661-671.

KOCHIAN L V， HOEKENGA O A， PINEROS M A.How do crop plants tolerate acid soils？ Mechanisms ofaluminum tolerance and phosphorous efficiency[J]. AnnualReview of Plant Biology， 2004， 55： 459-493.

吳佩， 李浩， 早浩龍， 等. 植物對(duì)缺磷和鋁毒協(xié)同進(jìn)化應(yīng)答的分子生理機(jī)制[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2020， 36（7）： 170-181.

LIAO H， WAN H， SHAFF J， et al. Phosphorus and aluminuminteractions in soybean in relation to aluminumtolerance， exudation of specific organic acids from differ- ent regions of the intact root system[J]. Plant Physiology，2006， 141（2）： 674-684.

LIANG C， PINEROS M A， TIAN J， et al. Low pH， aluminum，and phosphorus coordinately regulate malate exudationthrough GmALMT1 to improve soybean adaptationto acid soils[J]. Plant Physiology， 2013， 161（3）：1347-1361.

CHEN W， TANG L， WANG J， et al. Research advancesin the mutual mechanisms regulating response of plantroots to phosphate deficiency and aluminum toxicity[J].International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（3）：1137. doi： 10.3390/ijms23031137.

于芮， 王斌， 王建忠， 等. 我國(guó)大豆市場(chǎng)發(fā)展現(xiàn)狀及建議[J]. 合作經(jīng)濟(jì)與科技， 2021（19）： 92-93.

劉國(guó)選， 陳康， 陸星， 等. 大豆GmPIN2b 調(diào)控根系響應(yīng)低磷脅迫的功能研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021，42（4）： 33-41.

LI S， WANG N， JI D， et al. Evolutionary and functionalanalysis of membrane-bound NAC transcription factorgenes in soybean[J]. Plant Physiology， 2016， 172（3）：1804-1820.

向鳳寧， 王楠. 大豆威廉姆斯82 中NAC 膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL1 及其應(yīng)用： CN106167801A[P]. 2018-08-28[2022-04-16].

向鳳寧， 王楠. 大豆威廉姆斯82 中NAC 膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子基因GmNTL7 及其應(yīng)用： CN106367423B[P]. 2017-02-01[2022-04-16].

LIN Y， LIU G， XUE Y， et al. Functional characterizationof aluminum （Al）-responsive membrane-bound NACtranscription factors in soybean roots[J]. InternationalJournal of Molecular Sciences， 2021， 22（23）： 12854. doi：10.3390/ijms222312854.

PARK J， KIM Y S， KIM S G， et al. Integration of auxinand salt signals by the NAC transcription factor NTM2during seed germination in Arabidopsis[J]. PlantPhysiology， 2011， 156（2）： 537-549.

YOON H K， KIM S G， KIM S Y， et al. Regulation of leafsenescence by NTL9-mediated osmotic stress signaling in

Arabidopsis[J]. Molecules and Cells， 2008， 25（3）： 438-445.

DUAN M， ZHANG R， ZHU F， et al. A lipid-anchoredNAC transcription factor is translocated into the nucleusand activates glyoxalase I expression during droughtstress[J]. Plant Cell， 2017， 29（7）： 1748-1772.

PERET B， CLEMENT M， NUSSAUME L， et al. Rootdevelopmental adaptation to phosphate starvation： Bettersafe than sorry[J]. Trends in Plant Science， 2011， 16（8）：442-450.

P?REZ-TORRES C， L?PEZ-BUCIO J， CRUZRAM?REZA， et al. Phosphate availability alters lateralroot development in Arabidopsis by modulating auxinsensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor[J]. Plant Cell， 2008， 20（12）： 3258-3272.

SHEN C， WANG S， ZHANG S， et al. OsARF16， a transcriptionfactor， is required for auxin and phosphate starvationresponse in rice （Oryza sativa L. ）[J]. Plant Celland Environment， 2013， 36（3）： 607-620.

BALZERGUE C， DARTEVELLE T， GODON C， et al.Low phosphate activates STOP1-ALMT1 to rapidly inhibitroot cell elongation[J]. Nature Communications，2017， 8： 15300. doi： 10.1038/ncomms15300.

HAM B K， CHEN J， YAN Y， et al. Insights into plantphosphate sensing and signaling[J]. Current Opinion inBiotechnology， 2018， 49： 1-9.

CHEN Y N， SLABAUGH E， BRANDIZZI F. Membrane-tethered transcription factors in Arabidopsis thaliana：Novel regulators in stress response and development[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2008， 11（6）：695-701.

LEE S， LEE H J， HUH S U， et al. The Arabidopsis NACtranscription factor NTL4 participates in a positive feedbackloop that induces programmed cell death under heatstress conditions[J]. Plant Science， 2014， 227： 76-83.

【責(zé)任編輯 李慶玲】