汪婷 汪威 徐歡 殷世彬 孫敏華 江心月 徐靜 汪招雄

摘要： 【目的】探究鴨坦布蘇病毒（Duck Tambusu virus，DTMUV） E 蛋白全長及其結構域I、II 和III （DI、DII 和DIII） 對鴨胚成纖維細胞（Duck embryo fibroblast，DEF） 的細胞周期與凋亡的影響。【方法】本研究設計、合成DTMUV E 蛋白全長及其DI、DII 和DIII 真核表達質粒，并轉染至DEF，用流式細胞儀檢測不同蛋白引起的DEF 細胞凋亡和細胞周期的變化。【結果】細胞凋亡結果顯示：質粒轉染細胞24 h 后，E 蛋白全長及DI、DII、DIII 誘導的DEF 早期凋亡率分別是16.4%、15.1%、14.0% 和17.2%；質粒轉染細胞36 h 后，E 蛋白全長及DI、DII、DIII 誘導的DEF 早期凋亡率分別是23.4%、18.5%、26.7% 和29.4%。細胞周期檢測結果顯示：E 蛋白全長及DI、DII、DIII 的質粒轉染細胞24、36 h 后，DNA 合成期（S 期） 細胞比例都明顯高于pEGFP-N1 空載體轉染組。質粒轉染24 h 后，E 蛋白及DI、DII、DIII 的S 期細胞比例分別為5.43%、22.58%、12.75% 和12.80%；質粒轉染細胞36 h 后，E 蛋白及DI、DII、DIII 的S 期細胞比例分別為9.98%、11.44%、10.44% 和11.00%?！窘Y論】DTMUV E 蛋白全長及其3 個結構域均能誘導早期細胞凋亡，引起細胞S 期的停滯，但是各蛋白片段誘導細胞凋亡和引起細胞周期變化的能力存在一定差異。

關鍵詞： 鴨坦布蘇病毒；E 蛋白；結構域；細胞周期；細胞凋亡

中圖分類號： S852文獻標志碼： A 文章編號： 1001-411X（2023）02-0205-07

鴨坦布蘇病毒（ D u c k T e m b u s u v i r u s ，DTMUV） 是黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的一種新型黃病毒，可引起雛鴨腹瀉和神經癥狀，蛋鴨卵巢出血壞死、產蛋量急劇下降，嚴重者出現死亡[1]。近年來有研究報道，該病的感染宿主已擴大至麻雀、鵝、鴿子等多種禽類[2]。該病毒的開放性閱讀框（Open reading frame， ORF） 編碼產生1 個3 425 個氨基酸長度的多肽，在宿主和病毒蛋白酶的作用下，可水解為C、prM、E 結構蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5 非結構蛋白[3]。

E 蛋白是D T M UV 的外膜蛋白，包含大約501 個氨基酸殘基，由1 503 個核苷酸殘基構成，相對分子質量為54 200[4]。其參與病毒的細胞膜融合和穿入，能刺激機體產生保護性的中和抗體，是主要的免疫原性蛋白[5]。E 蛋白空間結構多數為β?折疊，并形成3 個不同的空間結構域?Domain I、Domain II 和Domain III，分別簡稱DI、DII 和DIII[6]。其中，DI 位于包膜蛋白的中部，通過柔性鉸鏈連接DII[ 7 ] ，DI 中的糖基化位點與病毒產生、pH 敏感性和神經侵襲性有關[ 8 ]。DII 由2 個從DI 循環(huán)中投射出來的片段組成，折疊成指狀結構，含有高度保守的疏水性頂端的融合環(huán)，稱為融合肽（Fusion peptide，FP）。當融合形成構象時，融合肽負責與靶膜的直接相互作用[ 9 ]。具有免疫球蛋白IgG 樣結構的E 蛋白DIII 位于融合E 蛋白羧基端，只有1 個二硫鍵影響E 蛋白抗原結構正確性，該區(qū)包含眾多抗原表位，在病毒結合細胞受體并入侵細胞機制中具有重要作用，是臨床診斷和亞單位疫苗制備的重要靶候選區(qū)域[10]。近年來研究表明，E 蛋白是病毒的主要毒力抗原，它參與病毒的許多復制過程；此外，其所含的大量抗原表位與病毒入侵宿主細胞以及病毒致病性密切相關[ 1 1 ]。而目前對DTMUV E 蛋白DI、DII 和DIII 功能的研究較少。

本研究旨在探討E 基因DI、DII 和DIII 真核表達產物對鴨胚成纖維細胞（Duck embryo fibroblast，DEF） 細胞周期與細胞凋亡的影響，為E 蛋白DI、DII 和DIII 的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pEGFP-N1 真核表達質粒由長江大學動物科學學院禽病實驗室保存；DMEM 培養(yǎng)基、Lipo2000 脂質體轉染試劑、Opti-MEM 培養(yǎng)基均購于ThermoFisher Scientific 公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于Biosharp公司。

1.2 重組質粒的構建

根據DTMUV E 蛋白基因及其結構域I、II 和III 基因核苷酸序列，設計pEGFP-N1-E、pEGFPN1-DI、pEGFP-N1-DII、pEGFP-N1-DIII 4 種真核表達質粒，并交由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，基因片段及長度見圖1 和表1。

1.3 質粒轉染

參照Lipo2000 脂質體轉染試劑說明將pEGFPN1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII、pEGFP-N1-DIII 和空載體pEGFP-N1 轉染DEF 細胞。設置不轉染質粒的細胞為陰性對照（CK）。

1.4 倒置熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光表達

將質粒轉染DEF 24 h 后，將細胞置于倒置熒光顯微鏡下，觀察GFP 在細胞中的表達并拍照。

1.5 細胞總蛋白的提取

在質粒轉染DEF 24 h 后，棄去培養(yǎng)基，用胰酶消化，用D M EM 完全培養(yǎng)基（ 含體積分數為10% 的FBS） 吹打細胞，收集于15 mL EP 管中，1 500 r/min 離心5 min，用預冷PBS 洗滌細胞，重復2 次，去上清液。6 孔板每孔加200 μL 裂解液；裂解液用之前1 min 加PMSF（蛋白酶抑制劑），混勻，冰浴30 min。將細胞收集至1.5 mL 離心管中，4 ℃ 條件下于14 000 r/min 離心l0 min。小心吸取上清液，轉移至新的15 mL 離心管中，?80 ℃ 保存。

1.6 Western blot 檢測DTMUV E 蛋白及其DI、DII 和DIII

將蛋白樣品加5× SDS 凝膠上樣緩沖液煮沸處理5 min 后，進行SDS-PAGE 鑒定蛋白純度。純化蛋白經100 g/L SDS-PAGE 分離后，采用濕法將蛋白質轉印至硝酸纖維膜上，采用75 V 電壓作用1.5 h。將蛋白條放入封閉液（脫脂乳體積分數為5% 的TBST 溶液） 中，在37 ℃ 條件下作用1.5 h。將蛋白條轉移到一抗稀釋液中，4 ℃ 慢搖，過夜。次日用TBST 清洗3 次后轉移至二抗稀釋液中，37 ℃ 慢搖，孵育1 h。用TBST 清洗3 次后按照Super ECLPLus 超敏發(fā)光液顯色試劑盒說明書顯色。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

在質粒轉染細胞24、36 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，1 500 r/min 離心5 min，去上清液。用預冷的PBS 重懸細胞，1 500 r/min 離心5 min，去上清液，在用PBS 重懸1 次細胞、小心吸除上清液后，加入250 μL Binding buffer 重懸細胞，吸取100 μL 的細胞懸液于5 mL 流式管中，加5 μLAnnexin V-FITC，避光孵育10 min，上機前5 min 加入10 μL 碘化丙啶（PI） 溶液，輕輕混勻。上機前在反應管中補加400 μL PBS 重懸細胞，避光保存，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.8 流式細胞術檢測細胞周期

在質粒轉染24、36 h 后，小心吸除細胞培養(yǎng)液，用胰酶消化細胞，加入1 mL 完全培養(yǎng)基收集細胞，1 500 r/min 離心5 min，去上清液。用1 mL 預冷P B S 重懸細胞，去上清液。用1 mL 預冷的70%（φ） 乙醇溶液固定細胞，過夜。然后1 500 r/min離心5 min，去上清液。加入預冷的PBS 重懸細胞，1 500 r/min 離心5 min，去上清液。配制碘化丙啶染色液：對于1 個樣品，在0.5 mL 染色緩沖液中加入25 μL 碘化丙啶染色液（20 ×） 和10 μL RNaseA（50 ×），混勻待用。染色：每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕輕混勻重懸細胞沉淀，37 ℃ 避光孵育30 min，就可以進行流式檢測，流式檢測最好在5 h 內完成。流式檢測和分析：用流式細胞儀在微發(fā)波長488 nm 處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用F l o w J o 分析軟件進行細胞DNA 含量和光散射分析。

2 結果與分析

2.1 質粒轉染DEF 后GFP 表達

利用倒置熒光顯微鏡對各組轉染細胞進行觀察， 見圖2 。結果顯示， 在轉染2 4 h 后， 可見pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 重組質粒及pEGFP-N1 空載體轉染的DEF 細胞出現明顯的綠色熒光，GFP 在DEF 中有明顯的表達。隨著時間的推移，各組細胞熒光強度均有所增強。

2.2 E 蛋白及其DI、DII 和DIII 在DEF 中的表達

如圖3 所示， 純化后E 蛋白及D I 、D I I 和DIII 均有單一條帶，與目的片段大小相符，相對分子質量約為82 000、44 000、47 000、40 000，pEGFP-N1 空載體與目的片段大小相符，相對分子質量約為27 000，證明重組質粒E 蛋白及其DI、DII 和DIII 蛋白具有良好的表達。

2.3 質粒表達的蛋白對細胞凋亡的影響

pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 重組質粒及pEGFP-N1 空載體分別轉染DEF 24、36 h 后，收集各組細胞，用流式細胞儀檢測。早期凋亡以Annexin V-FITC （AFITC）染色為主，在流式細胞分析圖（圖4、5） 中為右下區(qū)（Q3、Q7） 細胞簇。晚期凋亡為Annexin VFITC/PI （A-FITC/PI） 雙染色，在流式細胞分析圖（圖4、5） 中為右上區(qū)（Q2、Q6） 細胞簇。

檢測結果表明，在質粒轉染24 h 后，與pEGFPN1 空載體轉染組1 4 . 8% 的早期凋亡率相比，pEGFP-N1-DII 轉染組細胞凋亡率略低，為14.0%；pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI 和pEGFP-N1-DIII 真核表達產物誘導DEF 的早期凋亡率分別是16.4%、15.1% 和17.2%，略高于空載體轉染組。不同蛋白引起DEF 晚期凋亡率的數據正好相反，相對于pEGFP-N1 空載體轉染組47.2% 的晚期凋亡率，pEGFP-N1-DII 轉染組凋亡率略高，為49.4%，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI 和pEGFP-N1-DIII 真核表達產物誘導DEF 的細胞凋亡率分別是45.6%、42.9% 和40.6%，略低于空載體轉染組。質粒轉染36 h 后，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 真核表達產物誘導DEF 的早期凋亡率分別是23.4%、18.5%、26.7% 和29.4%，均明顯高于pEGFP-N1 空載體轉染組15.2% 的凋亡率。

通過分析各組細胞凋亡數據，結合細胞本身的凋亡背景，可以看出，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 重組質粒在轉染DEF 24 h 后，各組細胞早期凋亡率差異不明顯；質粒轉染細胞36 h 后，相對于空載體組，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 重組質粒均能明顯誘導細胞早期凋亡，但是各組誘導細胞凋亡能力存在一定差異。

2.4 質粒表達蛋白對細胞周期的影響

pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 重組質粒及pEGFP-N1 空載體分別轉染DEF 24、36 h 后，收集各組細胞，用流式細胞儀檢測各質粒表達的蛋白對細胞周期的影響。質粒轉染24 h 后，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII 試驗組的DNA 合成期（S 期） 細胞比例分別為5.43%、22.58%、12.75% 和12.80%，都明顯高于pEGFPN1空載體轉染組的4.38%；DNA 合成后期與細胞分裂期（G2/M 期） 除了pEGFP-N1-E 低于pEGFPN1空載體轉染組的14.08% 外，pEGFP-N1-DI、p E G F P - N 1 - D I I 和p E G F P - N 1 - D I I I 組都高于p E G F P - N 1 空載體轉染組， 分別為1 7 . 6 4 % 、14.35% 和14.95%。質粒轉染36 h 后，pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFP-N1-DII 和pEGFP-N1-DIII S 期細胞比例相較于pEGFP-N1 空載體轉染組的9.69% 明顯上升；G2/M 期pEGFP-N1-E、pEGFPN1-DIII 明顯高于pEGFP-N1 空載體轉染組，而相較于24 h 的pEGFP-N1-E、pEGFP-N1-DI、pEGFPN1-DII 和pEGFP-N1-DIII G2/M 期，細胞比例明顯下降，分別下降了1 . 6 4 % 、1 1 . 4 2 % 、7 . 2 6% 和4.67%。具體見表2、圖6 和圖7。

3 討論與結論

DTMUV E 蛋白是誘導機體產生免疫保護性抗體的主要抗原，含有3 個抗原表位區(qū)，分為DI、DII 和DIII， DI 主要包含3 個區(qū)段? 第1—51 個aa、第137—196 個aa、第293—311 個aa，是糖基化位點和生物活性富集區(qū)；DII 包含2 個區(qū)段?第52—136 個aa、第197—292 個aa，為血凝活性及中和活性的富集區(qū)；DIII 只含1 個區(qū)段?第312—411 個aa，主要參與受體結合過程[12]。為探討DTMUV E 基因DI、DII 和DIII 真核表達產物對DEF 細胞周期與細胞凋亡的影響，本研究設計、合成了E 蛋白及其3 個結構域的真核表達質粒，并轉染到DEF，用流式細胞儀檢測了細胞凋亡與細胞周期。

近年來，有許多學者對DTMUV 誘導的細胞凋亡進行了廣泛的研究。李秀麗等[ 1 3 ] 研究表明DTMUV 能夠顯著引起細胞凋亡，導致脾臟淋巴細胞減少，嚴重影響脾臟的免疫功能。提金鳳等[14] 研究發(fā)現感染坦布蘇病毒（Tambursu virus，TMUV）24 h 昆明鼠的脾細胞中，細胞凋亡比例為27.9%，對照組為16.1%，感染TMUV 48 h 昆明鼠的脾細胞中，細胞凋亡比例為32.22%，對照組為25.26%，試驗組和對照組相比差異顯著；證明TMUV 可誘導昆明鼠發(fā)生顯著的脾細胞凋亡，感染病毒時間越長， 脾細胞凋亡越明顯。P a n 等[ 1 5 ] 研究發(fā)現DTMUV 感染后DEF 中細胞凋亡比例與這些細胞獲得的病毒滴度呈正相關，DTMUV 可能通過誘導細胞凋亡來促進病毒體的復制和傳播。在本研究中，DTMUV E 蛋白及其DI、DII 和DIII 重組質粒均能誘導細胞早期凋亡，且凋亡比例隨時間延長逐漸增加，36 h 的凋亡率（18.5%～29.4%） 明顯高于24 h的（14.0%～17.2%），這與前人研究結果一致。但不同的結構域在病毒復制的過程中如何誘導細胞凋亡，凋亡過程與病毒的復制、毒力之間的關系值得進一步探討。

于觀留[ 1 6 ] 研究發(fā)現T M UV 感染1 2 、2 4 h后，BCL2A1 （B 淋巴細胞瘤2A1 抗凋亡蛋白） 干擾組（siRNA-BCL2A1） 的S 期細胞比例與其對照組（siRNA-NC） 相比顯著增加（P<0.01），即siRNABCL2A1可以誘導病毒感染后DEF 在S 期停滯，證明BCL2A1 在調節(jié)病毒感染后的DEF 細胞周期中發(fā)揮著重要作用。林昀[17] 發(fā)現在感染后12、24 h，TMUV 感染組中處于S 期和G2/M 期的細胞比例顯著升高，說明TMUV 的感染可以誘導DEF 在S 期和G2/M 期停滯。在本研究中，質粒轉染24、36 h后，DTMUV E 全長及其DI、DII 和DIII 均可以誘導S 期的停滯， 這與前人研究結果基本一致。DTMUV E 蛋白全長及其DI、DII 和DIII 通過什么途徑造成DEF 凋亡，尚需進一步研究。

E 蛋白是DTMUV 的主要結構蛋白，在膜融合和介導病毒與細胞受體結合過程中起至關重要的作用，可直接影響病毒的宿主范圍、組織嗜性和毒力[ 1 8 ]。在本研究中，E 蛋白及其3 個結構域DI、DII 和DIII 不僅均可以誘導DEF 早期凋亡，也可以引起DEF 在S 期的停滯，這可能為研究DTMUVE 蛋白的功能以及致病機制提供了新的切入點。

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【責任編輯 李慶玲】