楊 寒，任 珊，劉茂倫，趙 暉，陶 秋，唐 順，明天琪，徐海波

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理系 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的惡性消化道腫瘤。最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，受老齡化、飲食習(xí)慣改變、肥胖、吸煙等因素的影響，CRC的患病率和死亡率在全球迅速上升，已分別高居第三和第二位，其中發(fā)達(dá)國家的CRC發(fā)病率比發(fā)展中國家高約4倍[1,2]。盡管近年來CRC在診斷技術(shù)和治療方法上已取得較大突破，但其五年生存率仍不足10%?；熓强鼓[瘤治療的基石。5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等作為CRC治療的常用藥物，其在臨床上的應(yīng)用常因黏膜炎、骨髓功能抑制、脫水等毒副作用而受到限制[3]。因此，探索CRC的發(fā)病機制，尋求毒副作用低、靶向性強的治療藥物依然是目前CRC研究的重點。

實踐證明，中藥在抗腫瘤治療中具有多方面的優(yōu)勢，不僅能增強化療藥的療效、降低不良反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)耐藥性，還能改善預(yù)后、提高患者的生活質(zhì)量，而且中藥中含有多種活性成分，研究表明，很多活性成分可通過影響細(xì)胞的遷移、侵襲以及凋亡等方式來發(fā)揮抗腫瘤作用[4,5]。因此，中藥及其活性成分對于腫瘤的治療具有良好的開發(fā)前景。野黃芩苷(scutellarin，SCU)，一種黃酮類化合物，主要來源于中藥半枝蓮、燈盞花以及黃芩，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、神經(jīng)保護和心腦血管保護等多種藥理作用[6]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，SCU還具有廣泛的抗腫瘤活性，能抑制結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，是一種潛在的抗腫瘤藥物[7]。

Hippo信號通路是過去十年中在腫瘤研究領(lǐng)域廣受關(guān)注的一條信號通路。研究證實，Hippo信號通路的異常阻滯與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、侵襲以及耐藥性的產(chǎn)生等密切相關(guān)[8]。當(dāng)Hippo信號通路被抑制時，通路的主要效應(yīng)因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)/具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄激活因子(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)核轉(zhuǎn)位聚集到細(xì)胞核中，與TEA轉(zhuǎn)錄因子1～4結(jié)合，促進下游靶基因如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin E1、原癌基因c-Myc等轉(zhuǎn)錄[9]。Hippo信號通路在維持正常腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及受損組織的修復(fù)和再生中起重要作用，YAP/TAZ高活性常作為CRC預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子，與腫瘤的分期、淋巴結(jié)狀態(tài)和轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)[10]。此外，YAP/TAZ的異常激活與Hippo信號通路上游調(diào)控因子的缺失有關(guān)，哺乳動物STE20樣蛋白激酶1/2(Mammalian sterile 20-like kinase 1/2，MST1/2)或大腫瘤抑制因子1/2(Large tumor suppressor 1，LATS1/2)缺失可導(dǎo)致YAP/TAZ不同程度的激活[11]。

迄今為止，SCU抗CRC的作用已被獲得多方面證實。有研究表明，SCU可通過多種信號通路發(fā)揮作用，包括Hedgehog[12]、Wnt/β-catenin[13]等。但目前還未見SCU通過調(diào)控Hippo信號通路發(fā)揮抗CRC作用的研究報道，因此本研究主要以結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞為體外模型，研究SCU對結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡的影響，初步探索其作用機制，為CRC治療藥物的開發(fā)提供參考和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑

野黃芩苷(成都曼思特生物技術(shù)有限公司，批號：MUST-20100910，純度：98.13%)；5-氟尿嘧啶(Merck life Science，批號：WXBC6532V，純度：≥99%)；McCoy’s 5A培養(yǎng)基(以色列Biological Industries，批號：01-075-1ACS 500mL)；胎牛血清(南美)(依科賽生物科技有限公司，批號：20210928)；青鏈霉素混合液(雙抗)(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，批號：CR2111084)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0009-2)；RIPA裂解液(強)(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，批號：CR2107181)；結(jié)晶紫染液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20210922)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：122120210430)；抗熒光淬滅封片液(含Hoechst 33342/PI)(上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：121818191028)；Annecin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(MultiSciences，貨號：A11015)；LATS1(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：00077426)；MST1(Affinity Biosciences，批號：#10j6740)；TAZ(Affinity Biosciences，批號：#89c2601)；YAP1(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10010504)；p-YAP(Ser127) (Affinity Biosciences，批號：#36z2539)；c-Myc(Affinity Biosciences，批號：#49x79651)；Bax(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：00102164)；Bcl-2(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10016705)；Anti-GAPDH(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，批號：AC2111015A)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號：A00251)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(武漢三鷹生物科技有限公司，批號：10010504)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：HJ202301)；牛血清白蛋白(BSA)(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：CR2108100)；BeyoRTTMⅢ cDNA第一鏈合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：06162122010)；2×Universal Blue SYER Green qPCR Master Mix(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：MPC2112039)。

1.3 主要儀器

3001多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DMI30008倒置顯微鏡(德國Leica公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman coulter)；QUOTQTION電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Forma3111CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Allegra X?-12series離心機(美國BECK MAN Coulter)；CYT5MFV微孔板成像系統(tǒng)(美國Bio Tek公司)；CFX Connect實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的McCoy′s 5A完全培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞生長面積達(dá)到80%～90%時，按1∶3的比例進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 SCU母液配制

SCU溶于DMSO配制成濃度為50 mg/mL的母液，分裝保存于-80 ℃冰箱中，臨用前用McCoy′s 5A完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度。

1.4.3 SCU對細(xì)胞形態(tài)的影響

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL，以500 μL/孔的體積接種在24孔板中，培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)液，空白對照組(control，Con)加入含0.28%DMSO的培養(yǎng)基、給藥組分別加入等體積的含35、70、140 μg/mL SCU和5-氟尿嘧啶(5-fuorouracil，5-Fu)(40 μmol/L)的培養(yǎng)基，在37 ℃、5%O2的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用倒置熒光顯微鏡下于明場模式下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。

1.4.4 MTT法檢測SCU對細(xì)胞存活率的影響

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以1×104個/孔的密度接種至96孔板中，培養(yǎng)過夜，每孔加入100 μL不同濃度的SCU(0、20、40、80、120、160、200、240、280、300 μg/mL)處理24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)，37 ℃避光孵育4 h，吸除上清液，每孔加入150 μL二甲基亞(dimethyl sulfoxide，DMSO)，搖床上避光反應(yīng)10 min，用多功能酶標(biāo)儀測定波長490 nm處的吸光度(A)，參照下面公式計算細(xì)胞存活率，并求出SCU給藥24 h的半數(shù)抑制濃度(50% concentration of inhibition，IC50)，根據(jù)IC50值設(shè)置后續(xù)試驗的給藥濃度，實驗重復(fù)6次。

細(xì)胞存活率=[(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)] × 100%

1.4.5 平板克隆形成實驗

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，按照1×103個/孔的密度接種在6孔板中，細(xì)胞貼壁生長3 d后，按“1.4.3”項下分組并分別加入2 mL含0.28%DMSO和不同濃度藥物的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)7 d，期間更換培養(yǎng)基3次。結(jié)束后，吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS清洗2次，用0.5%的結(jié)晶紫染液染色30 min，染色結(jié)束后用PBS清洗至背景干凈，自然風(fēng)干，拍照。

1.4.6 細(xì)胞劃痕實驗

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以5×104個/mL的密度、500 μL/孔的體積接種至24孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜，用200 μL移液器槍頭的尖端垂直于細(xì)胞培養(yǎng)板底部劃出十字形的劃痕，PBS清洗后按“1.4.3”項下分組并分別加入500 μL含0.28%DMSO和不同濃度藥物的無血清培養(yǎng)基，并分別于0、24、48 h時置于熒光倒置顯微鏡下成像，記錄細(xì)胞劃痕的愈合情況，使用Image J軟件測定劃痕面積，以0 h劃痕面積為基準(zhǔn)，計算各組細(xì)胞24 h和48 h的劃痕愈合率。

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以1×106個/mL的密度，1 mL/孔的體積接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，按“1.4.3”項下分組并分別加入2 mL含0.28%DMSO和不同濃度藥物的培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。結(jié)束后，吸除培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加100 μL含Hoechst 33342/PI的抗熒光淬滅封片液，于微孔板成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.4.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測SCU對HCT116細(xì)胞凋亡率的影響

采用Annexin V-FITC凋亡試劑盒測定SCU對HCT116細(xì)胞凋亡的影響。收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106個/mL，以1 mL/孔的體積接種在6孔板中，每組3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)液，按“1.4.3”項下分組并分別加入2 mL含0.28%DMSO和不同濃度藥物的培養(yǎng)基，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌2次，300 g離心5 min，棄上清；從樣品管中分出小部分細(xì)胞，設(shè)置1管空白管和2管單染管；再用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞1次，離心后棄上清，加入500 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞；每管樣本管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，2管單染管中分別加入5 μL Annexin V-FITC或10 μL PI，輕輕渦旋后混勻，室溫避光孵育5 min；打開流式細(xì)胞儀，用空白管調(diào)節(jié)FSC、SSC、FITC和PI通道的電壓，在此電壓條件下，用單染管調(diào)節(jié)FITC和PI之間的補償，然后上機樣本。

1.4.9 qRT-PCR檢測SCU對HCT116細(xì)胞凋亡及通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以1×106個/mL的密度、1 mL/孔的體積接種到6孔板中，培養(yǎng)過夜，按“1.4.3”項下分組并分別加入2 mL含0.28%DMSO和不同濃度藥物的培養(yǎng)基，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，并按照逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增，PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共進行40個循環(huán)。每組4個復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參采用2-ΔΔCt方法計算各mRNA的相對表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)進行歸一化處理。基于National Center for Biotechnolgy Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫的基因詞典，查閱相關(guān)基因信息，尋找合適的外顯子基因序列，采用Blast檢測引物的特異性。引物合成來自上海生工生物工程股份有限公司和北京擎科生物技術(shù)有限公司，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequences

1.4.10 Western blot檢測SCU對HCT116細(xì)胞凋亡及通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以1×106個/mL的密度、1 mL /孔的體積接種至6孔板中，培養(yǎng)過夜，按“1.4.3”項下分組并分別加入2 mL含0.28%DMSO和不同濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，然后依次進行濕法轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育。結(jié)束后，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image Lab 3.0軟件對蛋白條帶進行定量分析。

被國人稱之為“東方猶太人”的溫州商人，以白手起家、艱苦奮斗的創(chuàng)業(yè)精神；不等不靠、依靠自己的自主精神；闖蕩天下、四海為家的開拓精神，開創(chuàng)出了自己的一片天地。坐在我們面前的浙江勁豹機械有限公司掌門人方新通，正是這樣一位具有創(chuàng)業(yè)精神、自主精神和開拓精神的溫州商人——他外表斯文儒雅，骨子里卻有著溫州人敢想敢拼的精神。從1995年的下崗職工到如今的企業(yè)掌門人，從企業(yè)開創(chuàng)時的步履維艱到如今在國內(nèi)絲網(wǎng)印刷設(shè)備制造領(lǐng)域的領(lǐng)先地位，方新通向我們講述了其自己的草根進化史，以及勁豹的發(fā)展變革史。在他娓娓道來的講述中，我們深切地感受到了溫州企業(yè)的魅力之所在。

1.4.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SCU對HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖1所示，使用倒置熒光顯微鏡于明場模式下觀察SCU處理對HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果表明，空白對照組中的HCT116細(xì)胞形態(tài)清晰可見，貼壁生長良好，胞體飽滿。給予SCU和陽性藥5-Fu處理后，HCT116細(xì)胞的貼壁能力明顯降低，細(xì)胞皺縮變圓，且隨著SCU濃度的增加，細(xì)胞皺縮和碎片化的比例也明顯增加，提示SCU能誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞形態(tài)的改變。

圖1 SCU對HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of SCU on morphology of HCT116 cells注：A.空白對照組；B.SCU 35 μg/mL組；C.SCU 75 μg/mL組；D.SCU 140 μg/mL組；E.5-Fu 40 μmol/L組。Note:A.Control;B.SCU 35 μg/mL group;C.SCU 75 μg/mL group;D.SCU 140 μg/mL group;E.5-Fu 40 μmol/L group.

2.2 SCU抑制HCT116細(xì)胞活性

如圖2所示，使用不同濃度的SCU(0、20、40、80、120、160、200、240、280、300 μg/mL)處理HCT116細(xì)胞24 h后，相比空白對照組，SCU在濃度達(dá)到40 μg/ mL后能顯著降低HCT116細(xì)胞的存活率，呈濃度依賴性，其IC50值為75.96 μg/mL。參考以上結(jié)果，確定將35、70、140 μg/mL分別作為后續(xù)實驗的SCU低、中、高劑量組，并選擇24 h作為SCU的給藥處理時間。

圖2 SCU對HCT116細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of SCU on proliferation of HCT116 cells

2.3 SCU抑制HCT116細(xì)胞克隆形成能力

如圖3所示，在平板克隆形成試驗中，SCU 140 μg/mL組和陽性藥5-Fu組能顯著減少HCT116細(xì)胞的集落形成數(shù)目，70 μg/mL組的抑制作用其次，35 μg/mL組也能在一定程度上減少HCT116細(xì)胞的集落形成數(shù)目，提示SCU對HCT116細(xì)胞的克隆形成能力具有抑制作用。

圖3 SCU對HCT116細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of SCU on colony-formation ability of HCT116 cells

2.4 SCU抑制HCT116細(xì)胞遷移

如圖4和表2所示，與空白對照組相比，SCU處理24 h和48 h均能顯著降低HCT116細(xì)胞的遷移率(P<0.01)，表明SCU能有效地抑制HCT116細(xì)胞遷移，且這種抑制作用隨SCU的濃度增加而逐漸增強，呈濃度依賴性。

圖4 SCU對HCT116細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effect of SCU on migration of HCT116 cells

表2 SCU對HCT116細(xì)胞遷移的影響Table 2 Effect of SCU on migration of HCT116 cells

2.5 SCU誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡

采用Hoechst 33342/PI染色法觀察不同濃度的SCU對HCT116細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖5所示，與空白對照組相比，SCU干預(yù)后的HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡早期染色質(zhì)固縮所形成的致密濃染，發(fā)出亮藍(lán)色熒光，顏色泛白且比較明亮，提示SCU能夠誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡。此外，隨著SCU給藥濃度的增加，發(fā)亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目也逐漸增多。值得注意的是，SCU 140 μg/mL組誘導(dǎo)發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目明顯多于陽性藥5-Fu。

圖5 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of SCU on apoptosis of HCT116 cells

2.6 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡率的影響

使用Annexin V-FITC流式細(xì)胞分析法檢測SCU處理24 h后各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如圖6和表3所示，與空白對照組相比，SCU各給藥組均能顯著提高HCT116的細(xì)胞凋亡率(P<0.05，P<0.01)，且隨著給藥濃度的提高，細(xì)胞總凋亡比例逐漸增加，呈濃度依賴性。其中，35、70、140 μg/mL組的細(xì)胞凋亡率分別為(10.62 ± 0.21)%、(17.26 ± 0.45)%和(21.51 ± 2.26)%，5-Fu組的細(xì)胞率為(14.59 ± 1.40)%，提示SCU能誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡，且70、140 μg/mL組對HCT116細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用強于陽性藥組。

表3 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 Effect of SCU on apoptosis rate of HCT116 cells

圖6 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡率的影響Fig.6 Effect of SCU on apoptosis rate of HCT116 cells

2.7 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響

如表4所示，與空白對照組相比，SCU處理后能顯著上調(diào)Bax、caspase-9和caspase-3的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，下調(diào)Bcl-2的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，呈濃度依賴性。其中，SCU 70、140 μg/mL組對上述凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平的調(diào)控作用更加顯著，且140 μg/mL組的作用強于陽性藥5-Fu組，表明線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑在SCU誘導(dǎo)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

表4 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響Table 4 Effect of SCU on mRNA expression of apoptosis-related factors in HCT116

2.8 SCU對HCT116細(xì)胞Hippo-YAP/TAZ信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響

如表5所示，與空白對照組相比，SCU干預(yù)后能顯著升高MST1、LATS1的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，降低YAP1、TAZ以及通路下游靶基因c-Myc的mRNA表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)，其中SCU 70、140 μg/mL組的作用更加顯著，表明SCU對結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的作用與其參與Hippo信號通路活性的調(diào)控有關(guān)。

表5 SCU對HCT116細(xì)胞中Hippo-YAP/TAZ通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響Table 5 Effect of SCU on mRNA expression of Hippo-YAP/TAZ pathway-related factors in HCT116

2.9 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測SCU對HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖7所示，與空白對照組相比，SCU 35、70、140 μg/mL組均能顯著升高HCT116細(xì)胞中促凋亡因子Bax的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，顯著降低抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，與qRT-PCR的結(jié)果相對應(yīng)，從蛋白水平上表明SCU能通過調(diào)控HCT116細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)來促進細(xì)胞凋亡。

圖7 SCU對HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of SCU on expression of apoptosis-related proteins in HCT116 注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，下同。Note:Compared with Con,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.10 SCU對HCT116細(xì)胞Hippo-YAP/TAZ通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測SCU對HCT116細(xì)胞中Hippo-YAP/TAZ信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖8所示，與空白對照組相比，SCU能顯著升高LATS1、MST1、p-YAP(Ser127)的蛋白表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)，降低YAP1、TAZ、c-Myc的蛋白表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01)，呈濃度依賴性，與qRT-PCR的結(jié)果相對應(yīng)，從蛋白水平上表明SCU能對Hippo信號通路的活性產(chǎn)生影響。

圖8 SCU對HCT116細(xì)胞中Hippo信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of SCU on expression of Hippo signaling pathway-related proteins in HCT116

3 討論與結(jié)論

越來越多的證據(jù)表明，SCU可通過多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，具有開發(fā)成為抗腫瘤藥物的潛力。Sun等[14]發(fā)現(xiàn)，SCU能明顯抑制非小細(xì)胞肺癌PC-9和H1975細(xì)胞的增殖。Han等[15]的研究結(jié)果也表明，SCU能以濃度依賴的方式顯著抑制人骨肉瘤143B和U2OS細(xì)胞的增殖。在本研究中，SCU能顯著降低結(jié)直腸腫瘤HCT116細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞克隆，阻礙其增殖，與上述結(jié)論一致。

在癌癥中，癌細(xì)胞常通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來獲得增殖和侵襲的能力。在肝細(xì)胞癌中，Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SCU可通過下調(diào)Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號通路的活性來抑制肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，SCU可通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K信號通路的活性，下調(diào)胃癌MGC-803、AGS細(xì)胞中的上皮性鈣黏附蛋白(E-caderin)表達(dá)水平，上調(diào)波形蛋白(Vimentin)和神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)的表達(dá)水平，抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究中，細(xì)胞劃痕試驗的結(jié)果表明，與空白對照組相比，SCU給藥組HCT116細(xì)胞的遷移率被顯著降低，并呈濃度依賴性，提示SCU對結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用，與前面的研究結(jié)果相符。

目前普遍接受的觀點認(rèn)為，細(xì)胞凋亡不足是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要原因。因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是腫瘤治療的一種有效手段[18]。Cao等[19]的研究證實，SCU可通過抑制AKT/mTOR/4EBP1和STAT3通路，將順鉑耐藥肺腺癌A549細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。在肝癌中，Xu等[20]發(fā)現(xiàn)，SCU可通過抑制肝癌HepG2細(xì)胞中活性氧ROS的產(chǎn)生使STAT3信號通路的活性降低，進而下調(diào)下游靶蛋白BCL-XL和MCL-1的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同樣，在本研究中，我們通過Hoechst 33342/PI雙染和細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，SCU能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯著提高HCT116細(xì)胞的凋亡率。然而SCU的具體調(diào)控機制尚不明確，因此在后續(xù)研究中做了進一步探索。

有研究指出，Hippo信號通路能參與細(xì)胞增殖的調(diào)控，YAP過度激活或過度表達(dá)可導(dǎo)致肝臟、胃腸道、皮膚和心臟等多個組織的細(xì)胞過度增殖[21]。此外，YAP和TAZ還是細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的活性誘導(dǎo)劑，高活性的YAP和TAZ能誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ZEB1/2的表達(dá)，從而促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[22]。Hippo信號通路對細(xì)胞凋亡也起重要調(diào)控作用。YAP可通過調(diào)控下游抗凋亡基因如COX-2、Survivin和Glut1等轉(zhuǎn)錄促進細(xì)胞凋亡[23]；而且過表達(dá)的YAP還能阻斷腫瘤壞死因子、FAS以及化療藥物誘導(dǎo)的凋亡[24]；He等[25]的研究也證實，YAP可通過Ser351驅(qū)動NR4A1發(fā)生AKT依賴性的磷酸化，使其被隔離在細(xì)胞核中，削弱其促進細(xì)胞凋亡的作用。

本研究的結(jié)果表明，SCU能上調(diào)HCT116細(xì)胞中MST1、LATS1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，下調(diào)YAP1和TAZ的mRNA和蛋白表達(dá)水平，促進YAP磷酸化，使p-YAP(Ser127)蛋白表達(dá)水平升高，因此推測SCU的作用可能與激活Hippo信號通路有關(guān)。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，SCU處理24 h能有效升高HCT116細(xì)胞中的Bax、caspase-3、casepase-9的mRNA表達(dá)水平，降低Bcl-2的mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測結(jié)果也表明，SCU能顯著提高HCT116細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。此外，c-Myc的mRNA和蛋白表達(dá)水平也在SCU處理24 h后被明顯降低。以上結(jié)果提示，SCU可能是通過激活Hippo-YAP/TAZ信號級聯(lián)，促進YAP/TAZ磷酸化，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性被抑制，下游靶基因c-Myc的表達(dá)受到抑制，凋亡蛋白家族成員Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，并轉(zhuǎn)位進入線粒體，促進細(xì)胞色素C的釋放和凋亡復(fù)合體的形成，進而激活caspase家族中的凋亡啟動因子caspase-9及下游的凋亡執(zhí)行因子caspase-3，最終經(jīng)線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SCU能顯著抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與激活Hippo信號通路有關(guān)，但考慮到結(jié)直腸癌的形成原因復(fù)雜以及不同來源的腫瘤細(xì)胞系之間存在差異等諸多因素，關(guān)于SCU抗結(jié)直腸癌的作用仍需在其他多個結(jié)直腸癌細(xì)胞系上進行驗證，并結(jié)合體內(nèi)動物試驗做進一步全面探討。此外，據(jù)報道，Wnt、Notch、Hedgehog以及BMP信號通路都能參與腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和再生的調(diào)節(jié)，并且有研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路與這些通路之間能發(fā)生相互作用，存在串?dāng)_[26,27]。因此，SCU是否是通過綜合調(diào)控Hippo信號通路及其串?dāng)_通路的活性來發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用也需要深入探討。