孫雅楠　尹明潔　米穎　李斯

【摘要】? 目的? 探討代謝相關(guān)microRNA，microRNA-9-3p（miR-9-3p）在2型糖尿病（T2DM）患者血漿的表達(dá)水平，并評價(jià)血漿水平miR-9-3p對T2DM的診斷價(jià)值。方法? 選取2017年1月- 2019年6月醫(yī)院T2DM患者47例為T2DM組；健康人員28例為對照組。抽取患者靜脈血，提取miRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR），檢測兩組血漿中miR-9-3p表達(dá)水平；應(yīng)用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析血漿miR-9-3p對T2DM的診斷價(jià)值，評價(jià)診斷結(jié)果的真實(shí)性和一致性。結(jié)果? T2DM組血漿miR-9-3p的表達(dá)水平顯著升高（P<0.001）；ROC曲線顯示miR-9-3p對于T2DM的診斷價(jià)值，AUC=0.742（95%CI：0.628～0.857，P=0.0005）；以血漿miR-9-3p表達(dá)水平（2-?CT轉(zhuǎn)換后）>0.00985為診斷T2DM的標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)果顯示，靈敏度=68.085%，特異度=100.000%，具有較高的真實(shí)性，并且Kappa=0.614，診斷結(jié)果與實(shí)際結(jié)果高度一致，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)論? T2DM患者血漿miR-9-3p的表達(dá)水平顯著升高，miR-9-3p對于T2DM精準(zhǔn)診斷有一定診斷價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】? ?microRNA-9-3p；2型糖尿?。籖OC曲線

中圖分類號? R587.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）05--04

糖尿病分為4種類型，包括1型糖尿病、2型糖尿?。═2DM）、特殊類型糖尿病以及妊娠期糖尿病，其中T2DM患病率最高，以代謝紊亂為主要表現(xiàn)的終身性疾病。在T2DM病程中，患者體內(nèi)的糖、脂代謝紊亂，并且其相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平也發(fā)生變化[1-3]。在人體代謝調(diào)節(jié)的眾多因子中，microRNA是重要的組成之一，它廣泛存在于體液、血液等人體循環(huán)系統(tǒng)中。研究表明miR-9-3p與體內(nèi)糖代謝、脂類物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)相關(guān)，在胰島組織中的β細(xì)胞內(nèi)，miR-9-3p高表達(dá)，發(fā)揮抑制胰島素分泌的作用[4-5]。還有報(bào)道顯示，miR-9-3p通過細(xì)胞內(nèi)膽固醇調(diào)節(jié)因子，影響體內(nèi)膽固醇等血脂的代謝。T2DM發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗及胰島素分泌絕對減少，miR-9-3p在這兩個(gè)過程中均有重要作用[6-7]。但國內(nèi)外關(guān)于T2DM患者血漿中miR-9-3p表達(dá)水平的研究較少。本研究探討血漿miR-9-3p的表達(dá)水平與T2DM的關(guān)系及對T2DM的診斷價(jià)值。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

研究選取2017年1月至2019年6月醫(yī)院收治的T2DM患者47例為病例組（T2DM組）。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：葡萄糖耐量試驗(yàn)：15min內(nèi)緩慢口服溶于300ml溫水內(nèi)的無水葡萄糖粉75g，檢測空腹靜脈血糖≥7.0mmol/L，糖水負(fù)荷后2h靜脈血糖≥11.1mmol/L，即可診斷糖尿病。T2DM患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)OGTT實(shí)驗(yàn)，符合糖尿病診斷的患者；②體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為18.5～30.0；③無影響血糖代謝的相關(guān)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①檢出糖尿病自身抗體的患者，如已確診1型糖尿病的患者；②驗(yàn)室檢查提示C肽水平極低甚至缺乏的患者；③藥物難治性血壓患者；④肝轉(zhuǎn)氨酶水平升高，如谷草轉(zhuǎn)氨酶≥正常值范圍上限的2.5倍；⑤慢性腎衰竭3級以上；⑥糖尿病急性并發(fā)癥如高深昏迷及酮癥酸中毒；⑦手術(shù)、外傷、感染及其它應(yīng)激狀態(tài)為近3個(gè)月內(nèi)發(fā)生；⑧有嚴(yán)重的其他系統(tǒng)性疾??；⑨正處于妊娠期、哺乳期的患者。同期選取年齡、性別等與T2DM組相匹配的健康人員28例為對照組。本研究由唐山工人醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2? 資料收集

內(nèi)容包括研究對象的人口學(xué)資料、現(xiàn)病史、既往史、個(gè)人史、體檢及實(shí)驗(yàn)室檢測資料等。

1.3? 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.3.1? 血漿中總RNA的提取? 本部分實(shí)驗(yàn)使用mirVana Paris Kit試劑盒，根據(jù)試劑盒的說明書提取總RNA，并且本部分操作完成后，將標(biāo)本存放于-80℃冰箱凍存。

1.3.2? cDNA的合成? 首先配置RT-PCR的反應(yīng)體系，體系包括：10×緩沖液0.8μl、dNTP0.2μl、抑制劑0.1μl、RNA 4.5μl、無酶水體積為0.4μl、RNA 引物為1.5μl、RTase0.5μl（總反應(yīng)體系為8μl），本部分實(shí)驗(yàn)全過程于冰浴中完成。進(jìn)一步設(shè)定反應(yīng)的條件：16℃進(jìn)行孵育60min、42℃孵育60min、85℃孵育5min、4℃無限循環(huán)保存。

1.3.3? qRT-PCR實(shí)驗(yàn)? 首先配置qRT-PCR 反應(yīng)體系，體系包括：2×TaqMAN universal PCR Master 混合物10μl、cDNA為4μl、無酶水5μl、TaqMAN probe1 μl（總反應(yīng)體系為20μl）。設(shè)定反應(yīng)條件為：95℃10min起始模板預(yù)變性，95℃15s中模板變性、60℃60s退火循環(huán)40次；本實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣本均做副管，并且進(jìn)行重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄實(shí)驗(yàn)CT值，取平均值，后經(jīng)2-?CT轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4? 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖。計(jì)數(shù)資料計(jì)算百分率，兩組間率比較采用卡方檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料使用“±s”表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25，P75）來表示，兩組間中位數(shù)比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用ROC曲線評估血漿miR-9-3p的表達(dá)水平對T2DM的診斷效能，并篩選臨界值。計(jì)算靈敏度、特異度、Kappa值評價(jià)血漿miR-9-3p的表達(dá)水平對T2DM的診斷效果。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? T2DM組與對照組基本特征比較

T2DM組及對照組性別、年齡、BMI、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。T2DM組空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血紅蛋白水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見表1。

2.2? 兩組血漿中miR-9-3p（2-?CT轉(zhuǎn)換）表達(dá)水平

血漿miR-9-3p在T2DM組的表達(dá)水平為0.050（0.005，0.500），對照組表達(dá)水平為0.007（0.005，0.009），T2DM組血漿miR-9-3p的表達(dá)水平顯著高于對照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3? 血漿中miR-9-3p表達(dá)水平與T2DM關(guān)系的多因素分析

以是否T2DM為因變量（是=1，否=0），以血漿miR-9-3p表達(dá)水平是否升高（是=1，否=0）及上述分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是否達(dá)標(biāo)設(shè)定空腹血糖（<6.1mmol/L=0，>6.1mmol/L=1）；餐后2h血糖（<7.8mmol/L=0，>7.8mmol/L=1）和糖化血紅蛋白（<6.0%=0，>6.0%=1）為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，血漿miR-124表達(dá)水平與冠心病仍然存在關(guān)系（P<0.05），血漿miR-9-3p水平升高發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，見表2。

2.4? ROC曲線分析血漿miR-9-3p對于T2DM的診斷價(jià)值

以健康人群為對照組，評價(jià)miR-9-3p對于T2DM的診斷價(jià)值，AUC=0.742，說明miR-9-3p對于T2DM診斷有一定準(zhǔn)確性（95%CI：0.628～0.857，P=0.0005），見圖1，根據(jù)約登指數(shù)最大篩選臨界值為0.00985。

2.5? 血漿miR-9-3p用于T2DM的診斷結(jié)果

以血漿miR-9-3p表達(dá)水平（2-?CT轉(zhuǎn)換后）大于0.00985為診斷T2DM的標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，血漿miR-9-3p診斷T2DM靈敏度68.085%，特異度100.000%，具有較高的真實(shí)性，并且Kappa值為0.614，診斷結(jié)果與實(shí)際結(jié)果中高度一致，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

3? 討論

miRNA是一類由非編碼的單鏈小RNA分子組成的因子，功能是調(diào)節(jié)體內(nèi)多種蛋白質(zhì)類物質(zhì)的表達(dá)。miRNA因子廣泛的存在于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)以及全身的循環(huán)系統(tǒng)之中。機(jī)體處于相對穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，個(gè)體之間細(xì)胞及循環(huán)中的miRNA表達(dá)量是大致相同的，在機(jī)體出現(xiàn)某些特定的狀態(tài)下，如生長發(fā)育、疾病，細(xì)胞中miRNA表達(dá)水平會發(fā)生變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，或細(xì)胞崩解加劇，大量miRNA釋放如血漿，可以檢測到血漿中miRNA量發(fā)生變化。miRNA調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，血漿中miRNA的變化是要早于蛋白類標(biāo)記物[8]，檢測血漿miRNA表達(dá)水平能夠預(yù)測疾病的發(fā)生。

miR-9-3p基因定位于15號染色體，是miRNA家族中的組成之一，首次的功能研究被認(rèn)為是一種腦源性相關(guān)的miRNA，在血管性癡呆中研究顯示，海馬中miR-9-3p表達(dá)水平顯著下調(diào)，突觸相關(guān)蛋白97（SAP97）是一種眾所周知的與突觸功能相關(guān)的基因，在海馬神經(jīng)元上進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-9-3p負(fù)調(diào)節(jié)SAP97的表達(dá)。然而目前國外研究表明，miR-9-3p還具有調(diào)節(jié)胰島素分泌、促進(jìn)胰島素抵抗的作用，因此miR-9-3p在糖尿病相關(guān)的研究較受關(guān)注[9-10]。miR-9-3p在調(diào)節(jié)胰島素分泌過程中起到重要作用，如研究證實(shí)：當(dāng)胰島β細(xì)胞中miR-9-3p表達(dá)量升高時(shí)，加強(qiáng)其抑制胰島素分泌的功能，機(jī)制可能是通過轉(zhuǎn)錄后的翻譯抑制過程[11]。還有研究證實(shí)：在高糖模型中，如高血糖刺激，可以檢測到胰島β細(xì)胞中miR-9-3p顯著升高，之后調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)降低[12]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，相較于正常人在糖尿病患者外周血細(xì)胞中miR-9-3p表達(dá)水平也是升高的，并且糖尿病患者還存在脂代謝紊亂[13]。本研究顯示與健康對照組相比，T2DM組血漿中miR-9-3p表達(dá)水平顯著升高，并進(jìn)一步通過ROC曲線分析血漿miR-9-3p對于T2DM的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示：以體檢健康人群為對照組，miR-9-3p對于T2DM精準(zhǔn)診斷有一定準(zhǔn)確性。以上結(jié)果說明血漿miR-9-3p有望成為T2DM精準(zhǔn)診斷的潛在分子標(biāo)記物。

本研究證實(shí)T2DM患者血漿miR-9-3p表達(dá)水平較健康人群產(chǎn)生顯著差異。代謝相關(guān)microRNA，miR-9-3p在病理生理過程中可能發(fā)揮促進(jìn)T2DM進(jìn)展的作用，本實(shí)驗(yàn)為T2DM精準(zhǔn)診治提供新型分子標(biāo)記物。

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[2023-01-09收稿]