李斯 尹明潔 米穎　孫雅楠

【摘要】? 目的? 探討血漿miR-138水平與冠心?。╟oronary heart disease，CHD）的關(guān)系及對HepG2細(xì)胞沉默信息調(diào)節(jié)因子（sirtuin type 1，Sirt1）基因mRNA表達(dá)的影響，評價(jià)血漿miR-138應(yīng)用于CHD臨床診斷的價(jià)值。方法? 選取2018年1月- 2020年1月在醫(yī)院診斷CHD并完成冠狀動(dòng)脈造影的患者30例為病例組（CHD組）及健康人員28例為對照組。檢測兩組血漿miR-138的水平及HepG2細(xì)胞Sirt1基因mRNA表達(dá)水平；通過單因素分析及多因素Logistic回歸分析血漿miR-138的水平與CHD的關(guān)系，并通過ROC曲線評估血漿miR-138的水平對CHD的診斷價(jià)值。結(jié)果? 單因素分析顯示，CHD組血漿miR-138的水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；多因素Logistic回歸分析顯示，血漿miR-138的水平降低，發(fā)生CHD的危險(xiǎn)性增加（P<0.05）。ROC曲線下面積AUC=0.768（95%CI：0.626～0.909），臨界值=0.00162，此時(shí)血漿miR-138診斷CHD的靈敏度=73.333%，特異度=100.000%，Kappa=0.726，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。miR-138轉(zhuǎn)染組Sirt1 mRNA水平顯著低于對照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）。結(jié)論? 血漿中miR-138的表達(dá)水平與CHD有關(guān)聯(lián)，血漿中miR-138的表達(dá)水平降低，CHD的風(fēng)險(xiǎn)增大，在對CHD的診斷中有一定價(jià)值。轉(zhuǎn)染miR-138能夠抑制HepG2細(xì)胞mRNA表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】? ?miR-138；冠心?。籋epG2細(xì)胞；Sirt1

中圖分類號? R541.4? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）05--04

隨著時(shí)代的發(fā)展，人們生產(chǎn)生活方式的改變，冠心病（coronary heart disease，CHD）的患病率逐年升高，已經(jīng)成為威脅人類健康的主要致病因素之一。miR-138是microRNA組成之一，目前報(bào)道顯示，其能夠參與血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、分化，以及調(diào)控細(xì)胞的凋亡[1]，表明其在CHD的形成過程中可能存在一定在作用。沉默信息調(diào)節(jié)因子（sirtuin type 1，Sirt1）是一種組蛋白脫乙酰酶，主要依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸發(fā)揮作用，Sirt1 能夠廣泛的存在于機(jī)體組織當(dāng)中，并且參與到機(jī)體能量代謝的調(diào)整以及細(xì)胞周期的調(diào)整，延緩細(xì)胞凋亡，延緩細(xì)胞衰老 [2]。血漿miR-138水平與CHD的關(guān)系尚未見報(bào)道，并且miR-138是否對HepG2細(xì)胞Sirt1基因產(chǎn)生影響仍不明確。本研究檢驗(yàn)CHD患者血漿中miR-138表達(dá)變化情況，在HepG2細(xì)胞中研究miR-138對Sirt1基因的影響，評價(jià)血漿miR-138用于CHD臨床診斷的價(jià)值。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

選取2018年1月- 2020年1月在醫(yī)院診斷CHD并完成冠狀動(dòng)脈造影的患者30例為病例組（CHD組）。根據(jù)年齡及性別等基本資料與CHD組相匹配的原則，同時(shí)選擇健康人員28例為對照組。本研究由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，并向所有研究對象進(jìn)行宣講知情同意，所有研究對象表示同意參與并簽署知情同意。

（1）CHD的診斷及入組標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)2011年《USA心臟學(xué)會(huì)以及UA/非ST段抬高心肌梗死指南》，冠心病患者具備以下特點(diǎn)之一：①患者在既往的病史中已存在心絞痛的癥狀，近期（1個(gè)月）內(nèi)，心絞痛癥狀較前加重或心絞痛癥狀發(fā)作頻率增加；②患者的心絞痛癥狀，為近1個(gè)月之內(nèi)新發(fā)生的癥狀；③患者如為靜息性心絞痛的發(fā)作滿足：患者在休息或者安靜時(shí)（非勞累狀態(tài)下）發(fā)作的心絞痛癥狀；④患者近期（1個(gè)月）內(nèi)心絞痛的癥狀發(fā)作的持續(xù)時(shí)間延長，并經(jīng)給予含服硝酸酸甘油后效果比較差的。其次對于臨床診斷CHD的患者，需要經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查，如至少1支冠狀動(dòng)脈血管的直徑狹窄程度≥50%。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有存在先天性心臟病或者存在心臟瓣膜病的，已臨床明確診斷的具有嚴(yán)重的充血性心衰患者；②患者近3個(gè)月內(nèi)，出現(xiàn)的造成損傷性血管的疾病，近1個(gè)月出現(xiàn)急性炎癥感染的疾病等；③患者目前存在肝臟、腎臟及其他臟器的重癥疾病及風(fēng)濕免疫類或腫瘤類疾病，嚴(yán)重的顱內(nèi)血管病、外周動(dòng)脈栓塞及閉塞等。

1.2? 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

1.2.1? 血漿miR-138表達(dá)水平檢測

（1）標(biāo)本采集：空腹8h后，于次日清晨早8h（CHD患者在行冠狀動(dòng)脈造影之前），行靜脈采血，分離血漿，收集標(biāo)本。

（2）血漿中總RNA的提?。捍瞬糠謱?shí)驗(yàn)是應(yīng)用mirVana Paris Kit試劑盒完成本部分實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)根據(jù)說明書操作，按步驟來提取血漿RNA，將提取總RNA試管放置于-80℃的冰箱內(nèi)進(jìn)行凍存保留。

（3）cDNA的合成：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以Taqman探針法進(jìn)行，配置RT-PCR反應(yīng)體系：加入10×緩沖液0.8μl、加入RNA 4.5μl、加入dNTP 0.2μl、加入抑制劑為 0.1μl、加入無水的RNase 0.4μl、加入RNA引物1.5μl、加入RTase 0.5μl，總體系為8μl，經(jīng)充分混勻后離心，反應(yīng)體系配置過程均在冰板上進(jìn)行。反應(yīng)條件設(shè)置為：16℃ 60min、42℃ 60min、85℃ 5min、4℃forever。

（4）qRT-PCR：體系配置：吸取所需物質(zhì)配置反應(yīng)體系，加入2× TaqMAN universal PCR Master混合物為10μl、加入無水RNase 5μl、加入TaqMAN 探針1μl、加入cDNA為 4μl，反應(yīng)體系總量為20μl，搖勻后離心。反應(yīng)條件為：模板預(yù)變性時(shí)間為95℃經(jīng)10 min，中模板變性時(shí)間95℃經(jīng)15s、60℃經(jīng)60s后進(jìn)行退火，共40循環(huán)；本部分試驗(yàn)樣本均做副管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次，仔細(xì)記錄每一次實(shí)驗(yàn)的CT值結(jié)果，經(jīng)計(jì)算取平均值錄入數(shù)據(jù)，后期經(jīng)2-?CT轉(zhuǎn)換，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2? HepG2細(xì)胞Sirt1mRNA水平檢測

（1）HepG2細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：將HepG2細(xì)胞用PBS洗2次，將配制好的miR-138轉(zhuǎn)染復(fù)合物，分別加入到6孔板中，加入Opti-MEM培養(yǎng)基750μl/孔，混合均勻，于 37℃、5.0﹪CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

（2）細(xì)胞qRT-PCR：①細(xì)胞總RNA的提?。恨D(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)束后輕柔剝離細(xì)胞，使細(xì)胞脫落并進(jìn)一步應(yīng)用裂解液裂解，吸取上清液，加入等體積的異丙醇加入離心管，留取試管底部會(huì)白色沉淀物，吸取75%的乙醇1ml緩慢沿管壁加入離心管，離心后棄去。于室溫下干燥5min，使乙醇完全揮發(fā)，加入70～80μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解沉淀，待miRNA沉淀完全溶解后，-80℃冰箱保存。②細(xì)胞mRNA qRT-PCR：

引物序列Sirt1：5' CTACTGGTCTTACT TTGAGGG3'（上游）；

5'CAAGGGATGGTATTTATGCT3'（下游）

β-actin：5'ACAGAGCCTCGCCTTTGC3'（上游）

5'CCACCATCACGCCCTGG3'（下游）

以β-actin作為內(nèi)參，配置每個(gè)反應(yīng)體系：2×One Step SYBR?RT-PCR Buffer 4 10μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 1.0μl、PCR Forward Primer（10μM）1.0μl、PCR Reverse Primer（10μM） 1.0μl、總RNA4.0μl、RNase Free H2O 3μl，總反應(yīng)體系共20μl。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃30min、95℃10min 1個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)條件：95℃10s、60℃60s 40循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄反應(yīng)的Ct值，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料計(jì)算百分率（%），率的比較采用卡方檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料使用“±s”表示，采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用“M（P25，P75）”來表示，組間中位數(shù)比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 兩組人員臨床特征比較

CHD組BMI水平、吸煙比例顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；兩組性別、年齡、空腹血糖（FPG）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2? 血漿miR138表達(dá)水平與冠心病的關(guān)系

2.2.1? 單因素分析? CHD組與對照組血漿miR138表達(dá)水平比較結(jié)果顯示，CHD組血漿miR-138的表達(dá)水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明血漿miR-138的表達(dá)水平與冠心病有關(guān)聯(lián)，見表2。

2.2.2? 多因素分析? 以是否冠心病患者為因變量（是=1，否=0），以表1中有統(tǒng)計(jì)意義的因素及血漿miR-138表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，在控制了其他因素影響后，血漿miR-138表達(dá)水平仍然與冠心病有關(guān)系（P<0.05），血漿miR-138表達(dá)水平降低，冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，見表3。

2.3? 血漿miR-138水平對CHD診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示，AUC=0.768（95%CI：0.626～0.909），說明血漿miR-124水平對于CHD具有一定的區(qū)分度，根據(jù)約登指數(shù)篩選的診斷臨界值為0.00162，見圖1。以血漿miR-138表達(dá)水平<0.00162為診斷CHD的標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，血漿miR-138診斷CHD靈敏度73.333%，特異度100.000%，具有較高的真實(shí)性，并且Kappa值為0.726，診斷結(jié)果與實(shí)際結(jié)果高度一致，具有臨床應(yīng)用價(jià)值，見表4。

3? 討論

CHD是威脅人類健康的首要治病因素，是心肌梗死、心源性猝死的前期病癥，但是CHD的診斷仍依據(jù)患者的臨床癥狀，心電圖甚至是冠狀動(dòng)脈造影檢查術(shù)，目前仍缺乏對于CHD精準(zhǔn)診斷的簡便方法。miRNA是一類非編碼的小RNA分子，它在多種生物學(xué)功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，對靶基因表達(dá)方面發(fā)揮抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[3]。miRNA在人體生理以及病理過程中發(fā)揮一定作用，其中miR-138報(bào)道與心血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及細(xì)胞周期代謝相關(guān)[2]，但是miR-138表達(dá)水平是否在CHD患者發(fā)生變化目前尚未見報(bào)道。

關(guān)于miR-138的功能研究顯示，高表達(dá)miR-138能夠顯著抑制血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移及血管生成作用，應(yīng)用白藜蘆醇后能夠顯著抑制miR-138的表達(dá)水平，并且改變其對內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用，改變血管生成及遷移，改變血栓的機(jī)化再通作用[4]。還有研究提示GECs細(xì)胞中miR-138處于中低表達(dá)水平，過量表達(dá)miR-138能夠抑制膠質(zhì)瘤的血管新生過程，研究中還證實(shí)miR-138能夠負(fù)性調(diào)控SOX13因子的表達(dá)發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤血管的新生，抑制腫瘤的遷移及轉(zhuǎn)移，在控制腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。還有學(xué)者研究表明，miR-138的上調(diào)通過下調(diào)Lcn2的促凋亡基因表達(dá)來抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[6]。基于miR-138在心血管細(xì)胞調(diào)節(jié)中的作用，此次研究顯示在CHD患者血漿中miR-138水平顯著低于正常對照組，在CHD發(fā)病過程中與miR-138過渡消耗可能相關(guān)。

目前有報(bào)道顯示miR-138具有參與細(xì)胞凋亡及調(diào)整細(xì)胞周期的作用。學(xué)者建立了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的衰老模型，因?yàn)槿四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力會(huì)伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸下降。在實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)miR-138能夠穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)水平與培養(yǎng)時(shí)間正相關(guān)，并且通過細(xì)胞凋亡及增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)凋亡作用[7]，發(fā)現(xiàn)miR-138能夠通過縮短細(xì)胞周期，發(fā)揮通過促進(jìn)細(xì)胞衰老的作用抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[8]。在細(xì)胞凋亡過程中，Sirt1起到重要作用，具有維持基因組的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞壽命，以及在調(diào)整細(xì)胞周期中起到重要作用[9]，其機(jī)制可能通過內(nèi)皮型一氧化氮合酶等因子的靶基因作用，延緩細(xì)胞衰老等、促進(jìn)細(xì)胞功能的作用[10]。研究顯示miR-138可能對Sirt1基因表達(dá)產(chǎn)生影響，如大鼠缺氧心肌細(xì)胞中證實(shí)，Sirt1的轉(zhuǎn)染可以產(chǎn)生對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，miR-138能夠抑制Sirt1基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)缺氧心肌細(xì)胞的凋亡，而miR-138抑制劑轉(zhuǎn)染后能夠減少缺血缺氧心肌細(xì)胞的凋亡[11]。然而在miR-138是否對Sirt1因子mRNA水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，是否對Sirt的蛋白轉(zhuǎn)錄過程起關(guān)鍵作用，目前未見報(bào)道。本次研究顯示，轉(zhuǎn)染miR-138能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞mRNA表達(dá)，但在轉(zhuǎn)錄后翻譯過程中是否發(fā)揮作用需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜合以上，CHD患者血漿中miR-138表達(dá)水平降低，可能是由于其在CHD發(fā)生發(fā)展中存在過度消耗，miR-138能夠抑制HepG2細(xì)胞Sirt1基因mRNA的表達(dá)，但其是否對Sirt1蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，有待于之后的研究進(jìn)一步證實(shí)。

4? 參考文獻(xiàn)

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[2023-01-09收稿]