SNP芯片評(píng)估柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

李隱俠，牙生江·那斯?fàn)枺惱锟恕ざ悸?，錢(qián) 勇*，曹少先，王偉列，孟春花，張 俊，張建麗

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所， 南京 210014； 2.新疆克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃菘酥菪竽莲F醫(yī)局， 阿圖什 845350；3.新疆克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃菹樘┠翗I(yè)有限公司， 阿圖什 845350)

柯?tīng)柨俗窝蚴切陆胤教厣d羊品種，以四肢高長(zhǎng)、體型勻稱(chēng)、緊湊而著稱(chēng)，具有耐粗飼、抗病和抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)好、風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)良特性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，柯?tīng)柨俗窝蝮w格較大，周歲公羊平均體重為36.65 kg，體高為64.77 cm，體長(zhǎng)為65.63 cm[3]?？?tīng)柨俗窝蚬蝮w重與體尺指標(biāo)均大于母羊，且體重與各項(xiàng)體尺相關(guān)性顯著[4]?？?tīng)柨俗窝蛉獯种?、粗蛋白、不飽和脂肪酸、油酸、亞油酸和微量元?鈣、銅和鐵)含量?jī)?yōu)勢(shì)明顯，重金屬含量低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)有機(jī)食品上具有品種優(yōu)勢(shì)[5-6]。雖然柯?tīng)柨俗窝驈纳鲜兰o(jì)90年代已經(jīng)開(kāi)始選育，但是從未對(duì)其進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)保種、遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)估等工作，導(dǎo)致其品種特性退化嚴(yán)重，現(xiàn)有群體遺傳結(jié)構(gòu)不清晰，嚴(yán)重阻礙了柯?tīng)柨俗窝虻馁Y源保護(hù)和利用。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最早廣泛應(yīng)用于基因組水平的遺傳標(biāo)記基因分型方法，通過(guò)對(duì)群體內(nèi)的個(gè)體進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的SNPs位點(diǎn)分析，得到群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及家系結(jié)構(gòu)[7-9]。SNP芯片具有密度大、覆蓋廣、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)階段重要的育種工具之一，在豬[10-11]、牛[12-13]、山羊[14-15]上均有廣泛應(yīng)用。利用SNP芯片評(píng)估馬身豬保種群的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性豐富，但近交程度高，家系較少，需要從原種場(chǎng)引入新的血統(tǒng)，擴(kuò)大保種群數(shù)量，降低近交系數(shù)[10]?；赟NP芯片對(duì)里岔黑豬進(jìn)行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析，表明里岔黑豬遺傳多樣性豐富，但群體近交現(xiàn)象明顯[11]；利用SNP芯片信息評(píng)估新疆近交牛基因組純合度，為新疆近交牛遺傳資源的育種規(guī)劃及未來(lái)該群體的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)[12]?；诟咄縎NP芯片建立了一種可評(píng)估牛早期胚胎染色體質(zhì)量和生產(chǎn)性能的方法，為胚胎牛育種提供了技術(shù)支撐[13]，使用60K山羊SNP 芯片分析云上黑山羊的遺傳結(jié)構(gòu)，顯示其在基因組水平具備較好的品種一致度和群體穩(wěn)定性，已具備獨(dú)立的品種特點(diǎn)[14]；利用50K芯片解析巴基斯坦山羊品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，為巴基斯坦國(guó)家育種計(jì)劃提供了寶貴的基因庫(kù)[15]。

ROH(runs of homozygosity)指長(zhǎng)的純合基因型的連續(xù)片段，被定義為來(lái)自同一個(gè)祖先，是使用基因型評(píng)估遺傳多樣性的最新方法[16-18]?；赗OH的基因組近交系數(shù)FROH與基于系譜的近交系數(shù)相比更接近于真實(shí)的近交系數(shù)[19]，長(zhǎng)ROH片段反映最近世代發(fā)生過(guò)近交，而短ROH說(shuō)明較遠(yuǎn)世代產(chǎn)生的近交[20-22]。

新疆克州阿圖什市柯?tīng)柨俗窝蛄挤敝行默F(xiàn)有種公羊31只，能繁母羊1 000余只，其遺傳多樣性、親緣關(guān)系和家系結(jié)構(gòu)并不清晰，不利于后續(xù)保種和選育工作的開(kāi)展。本試驗(yàn)采用高密度SNP芯片對(duì)該柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為柯?tīng)柨俗尉d羊的保護(hù)、選育及種質(zhì)創(chuàng)新利用等提供分子水平的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究中柯?tīng)柨俗窝騺?lái)自新疆克州阿圖什市柯?tīng)柨俗窝蛄挤N繁育中心，共采集61頭年齡2～3歲種羊，其中公羊31頭，母羊30頭，所有個(gè)體的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境條件一致。采集61頭種羊的靜脈血于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和鑒定

采用磁珠法提取柯?tīng)柨俗窝駾NA，通過(guò)NanoDrop2000、Agilent 2100和Qubit方法測(cè)定基因組DNA的濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。

1.3 柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA的SNP分型

DNA基因組分型在北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，采用InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片進(jìn)行測(cè)序和基因分型。

1.4 SNP 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控

數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行重復(fù)樣本的檢測(cè)，使用Plink (V1.90)軟件對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：使用常染色體上的位點(diǎn)，最小等位基因頻率(MAF)≥ 0.01，哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)P值≥0.000 001，SNP檢出率(call rate)≥90%，個(gè)體檢出率≥90%。

1.5 柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性分析

采用Plink (V 1.90) 軟件對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算柯?tīng)柨俗窝蛉后w的多態(tài)標(biāo)記比例 (PN)、期望雜合度 (He)、觀察雜合度 (Ho)、多態(tài)性信息含量 (PIC)、有效等位基因數(shù) (Ne) 和最小等位基因頻率(MAF)。

1.6 柯?tīng)柨俗窝蛉后wROH分析

使用Plink (V1.90) 軟件計(jì)算柯?tīng)柨俗窝蛉后w中每個(gè)樣本基因組上的長(zhǎng)純合片段ROH，統(tǒng)計(jì)ROH在柯?tīng)柨俗窝蛉后w中的分布、長(zhǎng)度、數(shù)目等，根據(jù)每個(gè)樣本中ROH片段的總長(zhǎng)度占常染色體基因組總長(zhǎng)的比例計(jì)算基于ROH的近交系數(shù)(FROH)[23]，采用R軟件(https://www.r-project.org/)繪制FROH小提琴圖。

1.7 柯?tīng)柨俗窝蛉后wIBS距離矩陣和G矩陣分析

利用Plink (V1.90) 軟件計(jì)算群體個(gè)體間的狀態(tài)同源性(identical by state, IBS)，計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離，同時(shí)根據(jù)VanRaden[24]提出的基因組關(guān)系G 矩陣構(gòu)建方法構(gòu)建柯?tīng)柨俗窝蛉后wG矩陣，分析群體個(gè)體間的親緣關(guān)系，并使用R軟件繪制IBS距離矩陣和G矩陣結(jié)果熱圖。

1.8 柯?tīng)柨俗窝蛉后w家系構(gòu)建分析

采用MegaX (V10.0)[25]軟件對(duì)質(zhì)控后的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分析，采用鄰接法 (neighhor-Joining, NJ) 構(gòu)建群體進(jìn)化樹(shù)，分析柯?tīng)柨俗窝蛉后w中種公羊的家系結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)不同家系種公羊的數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 柯?tīng)柨俗窝駾NA提取和結(jié)果檢測(cè)

采用磁珠法提取柯?tīng)柨俗畏N公羊和種母羊的靜脈血DNA， 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA樣品平均濃度在50 ng·L-1左右，OD260 nm/OD280 nm為1.8～2.0。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA條帶清晰，無(wú)拖帶現(xiàn)象，說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA質(zhì)量較好，達(dá)到芯片檢測(cè)要求，可以用于后續(xù)的試驗(yàn)研究(圖1)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～61. 柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA

2.2 柯?tīng)柨俗窝蛉后w基因組DNA的SNP分型和質(zhì)控

使用InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片對(duì)柯?tīng)柨俗窝蚧蚪MDNA進(jìn)行基因分型和質(zhì)控檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。61只柯?tīng)柨俗窝蚬矙z測(cè)到64 734個(gè)SNPs，表明此款芯片適用于分析柯?tīng)柨俗窝蚧蚪M的SNP位點(diǎn)；質(zhì)控后的SNPs數(shù)量為56 763，其中1號(hào)染色體上SNPs位點(diǎn)分布最多(6 305個(gè))，24號(hào)染色體上SNPs位點(diǎn)分布較少(845個(gè))(圖2)。

圖2 柯?tīng)柨俗窝騍NPs在每條染色體上的分布

2.3 柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性分析

柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性見(jiàn)表2。SNPs位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量為0.273±0.112， 其中多態(tài)性信息含量在0～0.15之間的SNPs位點(diǎn)較少(占15.6%)；多態(tài)性信息含量在0.30～0.45之間的SNPs位點(diǎn)較多(56.9%)，27.5%的SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量處于0.15～0.30之間(圖3A)。具體來(lái)說(shuō)，多態(tài)性信息含量在0～0.25之間的SNPs位點(diǎn)有12 419個(gè)，占比21.9%，多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間的SNPs位點(diǎn)有44 344個(gè)，占比78.1%，說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蛉禾幱谥卸冗z傳性。61只柯?tīng)柨俗窝蚬矙z測(cè)到有效等位基因數(shù)為96.567，平均有效等位基因數(shù)為1.583。SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性標(biāo)記比例為0.889，此群體的平均期望雜合度和觀察雜合度均為0.368，說(shuō)明現(xiàn)在的柯?tīng)柨俗窝蛉后w無(wú)外源血統(tǒng)的引入和近交現(xiàn)象發(fā)生。平均最小等位基因頻率為0.263±0.147，分布相對(duì)均勻，0.1～0.2占比最少(17.0%)，0.4～0.5占比最多(23.0%)(圖3B)。

表2 柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性

A.多態(tài)信息含量分布；B.最小等位基因頻率分布

2.4 柯?tīng)柨俗窝蛉后w的親緣關(guān)系分析

2.4.1 ROH分析 61只柯?tīng)柨俗窝蚬矙z測(cè)到200個(gè)ROHs，ROHs在柯?tīng)柨俗窝蛉后w的染色體上均有分布，其中在2號(hào)染色體上分布最多，24號(hào)染色體上分布最少(圖4A)。在61只柯?tīng)柨俗窝蛑校?6只羊的ROH長(zhǎng)度在0～50 Mb之間(圖4B)。在柯?tīng)柨俗窝蛉褐?，長(zhǎng)度1～5 Mb的ROHs最多，占67.5%左右，長(zhǎng)度為15～20 Mb的ROHs最少，占4% 左右 (圖4C)?？?tīng)柨俗窝蛉后w基于ROH的平均近交系數(shù)FROH為0.008 19±0.018 8，其中D8392的FROH最大為0.115，31只柯?tīng)柨俗喂虻腇ROH為0.004 65±0.008，其中9只公羊的FROH近交系數(shù)為0(圖5)。

A. ROH在染色體上分布； B. 柯?tīng)柨俗窝騻€(gè)體ROH長(zhǎng)度的分布情況； C. 柯?tīng)柨俗窝虿煌L(zhǎng)度ROH分布

圖中心的白色點(diǎn)代表群體FROH的中位數(shù)，中間黑色方框的上緣和下緣分別為群體FROH的上四分位數(shù)和下四分位數(shù)。小提琴圖的寬窄表示群體FROH的概率密度分布，圖越寬表示處于該水平的樣本數(shù)目越多，反之越少

2.4.2 基于G矩陣的柯?tīng)柨俗窝蛉后w間的親緣關(guān)系分析 利用全基因組SNPs位點(diǎn)構(gòu)建的G矩陣能真實(shí)反映個(gè)體間的親緣關(guān)系，柯?tīng)柨俗窝蛉后w親緣關(guān)系結(jié)果見(jiàn)圖6，顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近，G 矩陣結(jié)果顯示柯?tīng)柨俗窝蛉后w間親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

該圖展示兩兩個(gè)體間的基因組親緣關(guān)系系數(shù)，顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近

2.4.3 基于IBS距離矩陣的柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳距離分析 61只柯?tīng)柨俗窝蛑g的IBS遺傳距離在0.229～0.307之間，平均遺傳距離為0.294；31只種公羊間IBS遺傳距離在0.229～0.306之間，平均遺傳距離為0.294。柯?tīng)柨俗窝蛉后wIBS距離矩陣的結(jié)果見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示柯?tīng)柨俗窝騻€(gè)體間IBS遺傳距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明此群體近交風(fēng)險(xiǎn)較低。

該圖展示兩兩個(gè)體間的遺傳距離，顏色越接近綠色表示親緣關(guān)系越近

2.5 柯?tīng)柨俗窝蛉后w中公羊的家系結(jié)構(gòu)分析

鑒于公羊?qū)τ谡麄€(gè)群體的重要性，采用MegaX (V10.0) 軟件構(gòu)建柯?tīng)柨俗窝?1只種公羊群體進(jìn)化樹(shù)，結(jié)合基因組親緣關(guān)系分析結(jié)果，以公羊間基因組親緣關(guān)系系數(shù)大于等于0.1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類(lèi)分析，將現(xiàn)有種公羊劃分為25個(gè)家系(圖8)，其中家系17包含4只公羊，家系18包含2只公羊，家系20包含3只公羊，其余家系目前均只有1只公羊。

圖8 基于基因組親緣關(guān)系系數(shù)的柯?tīng)柨俗喂蛉后w進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

柯?tīng)柨俗窝蚴切陆畠?yōu)良的綿羊品種之一，具有獨(dú)特的形態(tài)特征，但是其遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)尚未得到系統(tǒng)的研究，尤其是在基因組水平上。本研究采用50K高密度SNP芯片技術(shù)檢測(cè)阿圖什市良繁中心柯?tīng)柨俗窝?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的全基因組SNPs，并基于這些高質(zhì)量SNPs對(duì)柯?tīng)柨俗窝虻倪z傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，遺傳雜合度越高，群體的變異越大，雜合度高于0.5表明群體沒(méi)有受到高強(qiáng)度選擇[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，柯?tīng)柨俗窝蛉后w平均預(yù)期雜合度和觀測(cè)雜合度均為0.368，說(shuō)明此柯?tīng)柨俗窝蛉簾o(wú)血統(tǒng)流失或者外來(lái)血統(tǒng)的引入。趙冰茹等[27]采用9個(gè)微衛(wèi)星檢測(cè)了南疆地區(qū)4個(gè)綿羊品種的平均雜合度，發(fā)現(xiàn)柯?tīng)柨俗窝虻钠骄s合度為0.737，預(yù)期雜合度為0.857，與本研究的結(jié)果相差很大，這可能與微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇有關(guān)，也與采樣地區(qū)和樣本量有關(guān)。不同地方綿羊群體的雜合度不同，西藏浪卡子綿羊的觀測(cè)雜合度為0.235，青海山谷型藏羊的觀測(cè)雜合度為0.323[28]，甘肅灘羊的觀測(cè)雜合度高達(dá)0.875[29]，說(shuō)明不同品種綿羊的群體變異與地域環(huán)境及其選育程度有較大的關(guān)系。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因片段多態(tài)性的常用有效指標(biāo)[30-32], Botstein 等[33]認(rèn)為，對(duì)于微衛(wèi)星位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，PIC>0.5時(shí)定義為高度多態(tài)位點(diǎn)，PIC<0.25時(shí)定義為低度多態(tài)位點(diǎn)，PIC位于0.5和0.25之間為中度多態(tài)位點(diǎn)，柯?tīng)柨俗窝騍NPs位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量為0.273，但是56.9%的SNPs多態(tài)信息含量分布在0.30～0.45之間，78.1%的多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間，說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蛉禾幱谥卸冗z傳[33]，且柯?tīng)柨俗窝蛉后w間個(gè)體差異很大。以上結(jié)果顯示，阿圖什良繁中心柯?tīng)柨俗窝蛉后w具有中度遺傳變異，雖然沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)選育、合理利用和保種，但是從二十世紀(jì)90年代開(kāi)始對(duì)柯?tīng)柨俗窝蜻M(jìn)行不斷的選育，導(dǎo)致其遺傳變異下降。

根據(jù)ROH覆蓋的基因組比例評(píng)估近親繁殖系數(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)近親繁殖效益的一種強(qiáng)大而準(zhǔn)確的方法[34]，也是一種有效的替代譜系近親繁殖的系數(shù)[35-36]。全基因組SNP芯片顯示，通城豬平均ROH長(zhǎng)度為23.7 Mb, 范圍為11.26～69.02 Mb，基于ROH的平均近交系數(shù)為0.04%，表明近交水平較低，研究結(jié)果為制定通城豬的管理和保種策略提供了理論依據(jù)[37]； 用ROH檢測(cè)8個(gè)印度牛品種的遺傳多樣性，表明在較小的本地種群中近交水平達(dá)到臨界狀態(tài)，研究結(jié)果為保護(hù)生物多樣性提供了有用的工具[38]。本研究在61只柯?tīng)柨俗窝蛉褐邪l(fā)現(xiàn)，91.8 %的ROH長(zhǎng)度在0～50 Mb之間，ROH總長(zhǎng)度較短，且基于ROH的近交程度分析發(fā)現(xiàn)，此柯?tīng)柨俗窝蛉后w平均近交系數(shù)為0.008，近交系數(shù)較低。但是隨著保種時(shí)間延長(zhǎng)，加上群體規(guī)模局限性和相對(duì)封閉的運(yùn)行模式，近交系數(shù)必然上升[39]。所以在日常管理中應(yīng)該加強(qiáng)系譜檔案的管理，完善配種記錄，避免系譜錯(cuò)誤導(dǎo)致近親繁殖，維持柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性。同時(shí)，加強(qiáng)柯?tīng)柨俗窝虮酒贩N選育，進(jìn)一步提純復(fù)壯。

遺傳距離是指不同種群或個(gè)體間基因差異的程度，是探究物種起源、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和分析群體間親緣關(guān)系的基礎(chǔ)，對(duì)育種工作中指導(dǎo)親本選育有重要作用[40]。本研究也分析了柯?tīng)柨俗窝蛉后w間IBS遺傳距離，以此評(píng)價(jià)個(gè)體間的親緣關(guān)系[33]?？?tīng)柨俗窝蛉后w的IBS平均遺傳距離為0.294 2，31只公羊間平均遺傳距離為0.294 4，說(shuō)明柯?tīng)柨俗窝蚍N公羊和種母羊之間具有適中的遺傳距離[18]。因?yàn)榉N公羊在整個(gè)群體中的重要性，基于31只種公羊的遺傳距離構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，按照親緣關(guān)系小于0.1的標(biāo)準(zhǔn)將種公羊劃分為25個(gè)家系，大部分家系只有1只種公羊，后期應(yīng)注意后代的選育，避免血統(tǒng)流失。而測(cè)序的30只母羊與所有檢測(cè)的公羊血緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)，可以任意進(jìn)行交配。

4 結(jié) 論

本研究基于InfiniumTM Ovine SNP50K Genotyping Array v3芯片分析了柯?tīng)柨俗窝蛉后w的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)柯?tīng)柨俗窝蛉后w遺傳多樣性較豐富，群體內(nèi)近交程度低，雖然家系較多，但是每個(gè)家系種公羊數(shù)量太少，需要加強(qiáng)種公羊的后代選育，避免血統(tǒng)流失。