池偉利，楊宏

（北京工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院，北京市水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程重點實驗室，北京 100124）

稀土礦區(qū)采用硫酸銨浸出法提取稀土元素后殘留大量的銨鹽，由于雨水的沖刷會產(chǎn)生稀土尾礦廢水[1]。江西贛州某稀土礦區(qū)稀土尾礦廢水每年產(chǎn)生水量為1460 萬立方米，若直接排放，影響周圍的生態(tài)系統(tǒng)?；趥鹘y(tǒng)的硝化反硝化技術(shù)主要有兩級AO生化工藝和人工快速滲濾技術(shù)。朱健玲等[2]采用兩級AO生化工藝處理稀土尾礦廢水，有機(jī)碳源的藥劑處理費用高達(dá)1.777CNY/m3，占到藥劑處理總費用的70.38%。Sun 等[3]采用改進(jìn)的人工快速滲濾系統(tǒng)處理稀土尾礦廢水，氨氮去除率為97.98%，總氮去除率為40.9%。但是該工藝只能去除部分總氮，存在明顯的缺陷，同時存在總氮去除負(fù)荷（NRR）低的問題。因此，需要一種高效率、節(jié)約有機(jī)碳源的生物脫氮方式。

稀土尾礦廢水的C/N 比較低，為0.02～0.31，采用厭氧氨氧化技術(shù)進(jìn)行處理可以節(jié)省大量的有機(jī)碳源。稀土尾礦廢水的主要成分含有氨氮（70～155mg/L）、硝酸鹽氮（25～47mg/L）、鈣離子、鎂離子、錳離子、氟化物、溴離子、亞硫酸鹽和硫酸鹽，同時含有多種稀土元素，水質(zhì)情況十分復(fù)雜。為克服上述成分對厭氧氨氧化菌的影響，本研究將厭氧氨氧化菌包埋固定化。微生物固定化是將特定的目標(biāo)細(xì)菌固定起來，以提供更高的細(xì)胞密度和保持更高的生物量穩(wěn)定性，同時加強(qiáng)了微生物對有毒物質(zhì)或不利環(huán)境條件的抗性[4?6]。目前關(guān)于厭氧氨氧化包埋填料的研究有很多，都表現(xiàn)出較強(qiáng)的處理能力。例如，陳光輝等[7]以包埋厭氧氨氧化菌顆粒作為流加菌啟動厭氧氨氧化反應(yīng)器，在49d 內(nèi)成功實現(xiàn)了加速啟動，NRR為0.505kg N/(m3·d)。王曉曈等[8]利用聚乙烯醇?聚丙烯制備厭氧氨氧化菌包埋填料，經(jīng)過140d 運(yùn)行后，NRR 可達(dá)1.83kg N/(m3·d)。

目前關(guān)于厭氧氨氧化技術(shù)處理稀土尾礦廢水的研究較少，且都停留在實驗室階段，沒有應(yīng)用于實際的中試脫氮研究。本研究是在稀土尾礦廢水的基礎(chǔ)之上，探究厭氧氨氧化包埋填料是否可以適應(yīng)稀土尾礦廢水，然后考察了厭氧氨氧化包埋填料單獨處理稀土尾礦廢水和耦合反硝化包埋填料處理稀土尾礦廢水的脫氮性能，最后通過高通量測序技術(shù)了解在稀土尾礦廢水的水質(zhì)條件下厭氧氨氧化包埋填料內(nèi)部的微生物菌群多樣性和功能菌群變化。

1 材料與方法

1.1 污泥來源與包埋填料的制備

（1）污泥來源 部分亞硝化池內(nèi)的污泥為在稀土尾礦廢水的基礎(chǔ)上經(jīng)過高游離氨（free ammonia，F(xiàn)A）抑制亞硝酸鹽氧化菌（nitrite?oxidizing bacteria，NOB）后的污泥，部分亞硝化性能較好，亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定在90%以上。厭氧氨氧化包埋填料所需污泥為工業(yè)化生產(chǎn)味精廢水處理全程自養(yǎng)脫氮（completely autotrophic nitrogen，CANON）工藝的顆粒污泥（MLVSS/MLSS，78.6%）。反硝化包埋填料所需污泥為實驗室工業(yè)級反應(yīng)器在人工配水的條件下培養(yǎng)的反硝化污泥，污泥濃度為10000mg/L 左右，NRR最高可達(dá)4.8kg N/(m3·d)。

（2） 包埋填料的制備過程 將聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）粉末溶于水中，混合成15%的PVA 水溶液，然后與離心后的厭氧氨氧化污泥（或反硝化污泥）混合。同時加入活性炭和碳酸鈣混合均勻，之后利用飽和硼酸進(jìn)行交聯(lián)定型。最后，切割成條狀填料裝入直徑100mm 的塑料懸浮球中，填料體積約占球體體積的一半。

1.2 研究裝置

如圖1所示，研究裝置的材料均為不銹鋼，原水箱和進(jìn)水箱的有效容積均為4m3。部分亞硝化反應(yīng)裝置為內(nèi)循環(huán)自沉淀反應(yīng)池，反應(yīng)區(qū)為6m3，沉淀區(qū)為3m3，pH自控系統(tǒng)控制堿液泵的啟閉以維持反應(yīng)區(qū)的pH。厭氧氨氧化反應(yīng)裝置的有效容積為2.5m3，內(nèi)部設(shè)有加熱設(shè)備，厭氧氨氧化包埋填料的體積填充率為7.5%。在適應(yīng)和馴化階段，僅有進(jìn)水箱的配水進(jìn)入?yún)捬醢毖趸磻?yīng)裝置，然后與厭氧氨氧化包埋填料接觸反應(yīng)。在其他階段，進(jìn)水箱的配水不再使用，稀土尾礦廢水從部分亞硝化池底部進(jìn)入池內(nèi)，攪拌裝置迅速使反應(yīng)區(qū)混合均勻。離心風(fēng)機(jī)進(jìn)入曝氣管路的進(jìn)氣量由閥門調(diào)控，通過調(diào)節(jié)閥門從而改變進(jìn)氣量以實現(xiàn)不同的溶解氧（dissolved oxygen，DO），最終使出水NO?2?N/NH+4?N比值為1.32左右。之后部分亞硝化池沉淀區(qū)的出水進(jìn)入中間水箱。中間水箱具有調(diào)蓄作用，其出水的一部分進(jìn)入?yún)捬醢毖趸磻?yīng)池包埋填料接觸反應(yīng)，另一部分溢流進(jìn)入稀土尾礦廢水處理廠。

圖1 實驗反應(yīng)器示意圖

1.3 實驗用水

厭氧氨氧化包埋填料適應(yīng)和馴化的實驗用水在稀土尾礦廢水的基礎(chǔ)上配制，主要成分見表1。其中，氨氮由NH4Cl 提供，亞硝酸鹽氮由NaNO2提供，無機(jī)碳源由NaHCO3提供。其余的實驗用水均采用部分亞硝化反應(yīng)裝置的出水，部分亞硝化反應(yīng)裝置的進(jìn)水為稀土礦區(qū)實際的稀土尾礦廢水，主要成分見表2。厭氧氨氧化和反硝化包埋填料耦合所需的COD由乙酸鈉提供。

表1 適應(yīng)和馴化階段的實驗用水

表2 稀土尾礦廢水的主要成分

1.4 分析項目與測定方法

1.4.1 水質(zhì)分析方法

氨氮采用納氏試劑光度法測定。亞硝酸鹽氮采用N?（1?萘基）?乙二胺分光光度法測定。硝酸鹽氮采用紫外分光光度法測定[9]。pH采用SX751便攜式pH計測定（三信，中國）。DO和溫度采用便攜式多功能溶解氧儀（哈希，美國）測定。COD采用連華科技5B?3C型COD快速測定儀測定（連華，中國）。由于稀土尾礦廢水的有機(jī)氮濃度很低，故氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮之和為總氮。

1.4.2 高通量測序分析

樣品S1、S2和S3分別為未運(yùn)行、運(yùn)行125d后和單獨處理稀土尾礦廢水82d后的厭氧氨氧化包埋填料；利用Illumina MiSeq 測序平臺（Illumina，San Diego，USA）確定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。采用兩種引物（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG 和805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC）對細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測序。參考美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫，對細(xì)菌16S rRNA 基因序列進(jìn)行比對。利用MEGAN軟件對環(huán)境微生物的16S rRNA 基因進(jìn)行分析，將獲得的序列按照一定的閾值進(jìn)行分類，得到多個序列聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。根據(jù)OTUs進(jìn)行多樣性分析。最后對分析結(jié)果進(jìn)行分析，使信息更容易解釋。

1.5 運(yùn)行工況

1.5.1 厭氧氨氧化包埋填料的適應(yīng)和馴化

采用階梯式底物和縮短HRT 的運(yùn)行策略（三個階段）進(jìn)行適應(yīng)和馴化，三個階段基質(zhì)濃度見表1。第一階段的水力停留時間（HRT）為12h，第二階段的HRT為10h，第三階段的HRT為8h。水溫控制在28～35℃，無機(jī)碳氮比為3∶1。

1.5.2 厭氧氨氧化包埋填料單獨處理稀土尾礦廢水

部分亞硝化反應(yīng)池的溫度維持在25～30℃，pH 控制在8.2～8.3，HRT 為6h，DO 濃度根據(jù)稀土尾礦廢水的氨氮濃度改變。厭氧氨氧化反應(yīng)池的溫度維持在28～35℃，HRT 從5h 逐漸降低以確定最佳HRT，無機(jī)碳氮比為3∶1。

1.5.3 厭氧氨氧化和反硝化包埋填料的耦合

部分亞硝化反應(yīng)池的運(yùn)行工況與1.5.2節(jié)一致。反硝化包埋填料放置在厭氧氨氧化反應(yīng)池內(nèi)，其體積填充率為2%。厭氧氨氧化反應(yīng)池的HRT 為4.2h，其余與1.5.2節(jié)一致。本實驗設(shè)置的C/N比情況如下：2.5∶1（1～4d）、2∶1（5～8d）、1.5∶1（9～12d）、1∶1（13～16d）和1.5∶1（17～26d），探究是否可以實現(xiàn)短程反硝化和確定最佳C/N比。

1.6 脫氮貢獻(xiàn)率的計算

脫氮貢獻(xiàn)率的計算采用Wang等[10]的計算方法，四種脫氮貢獻(xiàn)率的計算如式(1)～式(7)所示。

當(dāng)b≥1.32a時

當(dāng)b<1.32a時

當(dāng)b<1.32a且b?1.06a

當(dāng)b<1.32a且b?1.06a>c時

當(dāng)b<1.32a且b?1.06a

當(dāng)b≥1.32a時

當(dāng)b<1.32a且b?1.06a

式中，A、PN、PD和D分別為厭氧氨氧化、部分硝化?厭氧氨氧化、部分反硝化?厭氧氨氧化和反硝化反應(yīng)的脫氮貢獻(xiàn)率，%；a、b和c分別為氨氮消耗量、亞硝酸鹽氮消耗量和硝酸鹽氮生成量，mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧氨氧化包埋填料的適應(yīng)和馴化

厭氧氨氧化顆粒污泥制作成包埋填料，其NRR 較低，需要對厭氧氨氧化包埋填料進(jìn)行適應(yīng)和馴化，才能達(dá)到處理稀土尾礦廢水的要求。厭氧氨氧化包埋填料的適應(yīng)和馴化過程如圖2所示。在第一階段（1～45d）的初期，厭氧氨氧化包埋填料的NRR 增長較慢。主要是固定化處理對厭氧氨氧化菌的活性產(chǎn)生了負(fù)面影響和稀土尾礦廢水的稀土元素對厭氧氨氧化菌產(chǎn)生抑制作用。例如，固定化所需要的飽和硼酸可以抑制細(xì)菌活性[11]。朱清江[12]發(fā)現(xiàn)稀土元素鈰的濃度為0.01～100mg/L 時，均對厭氧氨氧化菌的活性產(chǎn)生抑制。本研究的稀土尾礦廢水中含有稀土元素鈰，可能對厭氧氨氧化菌的活性產(chǎn)生抑制。從第15d開始，NRR增長速度有了明顯的提高。董炎等[13]研究發(fā)現(xiàn)稀土元素鑭的質(zhì)量濃度低于1.0mg/L 時，對厭氧氨氧化菌的脫氮效果雖有影響，但隨著細(xì)菌對環(huán)境逐漸適應(yīng)，氨氮去除率仍可恢復(fù)到80%左右。本研究NRR 的提高說明厭氧氨氧化菌對稀土元素逐漸適應(yīng)。在第二階段（46～85d），由于提高了底物濃度和縮短HRT，出水的氨氮和亞硝酸鹽氮濃度下降速度較快。厭氧氨氧化包埋填料的NRR 增長速度明顯高于第一階段的增長速度，最高為0.473kg N/(m3·d)，較上一階段增加了0.288kg N/(m3·d)。Tuyen 等[14]認(rèn)為啟動期間亞硝酸鹽的濃度對厭氧氨氧化的生長至關(guān)重要：濃度超過50～150mg/L可能已經(jīng)導(dǎo)致抑制。本階段亞硝酸鹽氮的平均濃度為140.16mg/L，卻尚未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，說明包埋填料內(nèi)部的厭氧氨氧化菌對亞硝酸鹽的濃度適應(yīng)范圍有所擴(kuò)大。在第三階段（86～125d），厭氧氨氧化包埋填料的NRR 繼續(xù)保持較高的增長速度，最高可達(dá)0.99kg N/(m3·d)，較上一階段增加了0.517kg N/(m3·d)。高濃度的底物可以促進(jìn)厭氧氨氧化菌的活性增長，但第三階段的NRR 增長速度并不顯著高于第二階段，且出水的氨氮和亞硝酸鹽氮濃度下降速度與第二階段保持一致。在這一階段，亞硝酸鹽氮濃度平均為210.92mg/L，遠(yuǎn)高于150mg/L，這抑制了厭氧氨氧化菌的生長。總體而言，高濃度的底物對厭氧氨氧化菌活性增長的促進(jìn)作用大于亞硝酸鹽氮的抑制作用。以上說明了厭氧氨氧化包埋填料對稀土尾礦廢水具有較好的適應(yīng)性，采用階梯式底物和縮短HRT 的運(yùn)行策略實現(xiàn)了厭氧氨氧化菌活性較大幅度的提高。

圖2 厭氧氨氧化包埋填料的適應(yīng)和馴化

汪瑤琪等[15]采用逐漸提升容積負(fù)荷的方式富集厭氧氨氧化菌，在第155d 時總氮去除負(fù)荷為0.42kg N/(m3·d)。張少輝等[16]采用城市污水處理廠厭氧硝化池的污泥，經(jīng)過3個月的運(yùn)行使反硝化生物膜厭氧氨氧化反應(yīng)器的容積總氮負(fù)荷達(dá)0.14kg N/(m3·d)。本研究厭氧氨氧化包埋填料的體積填充率僅為7.5%，在含有實際稀土尾礦廢水的配水中運(yùn)行85d，NRR 便達(dá)到0.473kg N/(m3·d)，這一現(xiàn)象的主要原因有兩個。首先，包埋所需的厭氧氨氧化污泥中具有厭氧氨氧化功能的菌種。如圖3(b)所示，Candidatus Kuenenia和Candidatus Anammoxoglobus的相對豐度分別為5.53%和1.32%，這給厭氧氨氧化菌的富集提供了生長基數(shù)。其次，在富集過程中，包埋固定化避免了厭氧氨氧化菌的流失，最大程度地截留了厭氧氨氧化菌，使得厭氧氨氧化菌屬Candidatus Kuenenia的相對豐度高達(dá)35.67%。而汪瑤琪等[15]發(fā)現(xiàn)主要的厭氧氨氧化菌屬Candidatus Brocadia的相對豐度占13.40%?？傊c其他提高厭氧氨氧化菌活性的方式相比較，包埋固定化有明顯的優(yōu)勢，可以實現(xiàn)厭氧氨氧化菌活性的快速提高。

圖3 樣品S1、S2和S3在門和屬分類水平上的相對豐度

圖2(b)為厭氧氨氧化包埋填料的脫氮貢獻(xiàn)率，脫氮貢獻(xiàn)率反映的是厭氧氨氧化包埋填料內(nèi)部菌群的脫氮情況。第1～20d，厭氧氨氧化的平均脫氮貢獻(xiàn)率為75%，反硝化的平均脫氮貢獻(xiàn)率為25%，說明在適應(yīng)和馴化的初期，以厭氧氨氧化反應(yīng)為主，其次是反硝化作用。由于進(jìn)水COD 濃度僅為5～30mg/L，無法維持較高的反硝化作用。原因可能是由于底物的缺乏，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞裂解，并釋放出大量的有機(jī)物供反硝化細(xì)菌使用。例如，Candidatus Brocadia的相對豐度從6.83%變?yōu)?[圖3(b)]。Xu等[17]也發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動過程中存在明顯的反硝化作用。第21～125d，厭氧氨氧化的平均脫氮貢獻(xiàn)率為91.66%，反硝化的平均脫氮貢獻(xiàn)率為7.95%。異養(yǎng)反硝化活性下降，這與其他研究[18]保持一致。以上說明厭氧氨氧化菌在適應(yīng)和馴化的過程中活性逐漸提高，成為厭氧氨氧化包埋填料中的主要功能菌群。

2.2 厭氧氨氧化包埋填料單獨處理稀土尾礦廢水的脫氮性能

厭氧氨氧化包埋填料經(jīng)過適應(yīng)和馴化后，將部分亞硝化池和厭氧氨氧化池連通，考察厭氧氨氧化包埋填料處理實際稀土尾礦廢水的脫氮性能。圖4(a)為部分亞硝化池的運(yùn)行情況，圖4(b)為厭氧氨氧化池的運(yùn)行情況。根據(jù)原水氨氮濃度的相對大小，分為M1（1～22d）、M2（23～27d）、M3（28～70d）和M4（71～82d）4 個階段。部分亞硝化池的出水NO?2?N/NH+4?N 比值非常重要，直接影響后續(xù)厭氧氨氧化反應(yīng)器的脫氮效果。在M1階段，原水氨氮的平均濃度為122.80mg/L，部分亞硝化池出水氨氮的平均濃度為47.18mg/L，出水NO?2?N/NH+4?N的平均比值為1.41。對于厭氧氨氧化反應(yīng)器而言，HRT 由5h 降低到3.1h 時，出水氨氮濃度為零。當(dāng)HRT 降低到2.8h時，出水氨氮濃度開始顯著增加。當(dāng)HRT 降至2.5h 時，出水氨氮濃度接近15mg/L，說明厭氧氨氧化包埋填料的處理能力達(dá)到極限。考慮到原水氨氮濃度的不穩(wěn)定性，選擇HRT 為3.1h以確保出水達(dá)標(biāo)。第13～22d，出水氨氮的平均濃度為0.76mg/L。在M2 階段，部分亞硝化池的出水O?2?N/NH+4?N 比值突然下降，原因是原水氨氮的平均濃度突然升高至147.03mg/L。部分亞硝化池出水氨氮的平均濃度為64.70mg/L，出水NO?2?N/NH+4?N的平均比值為1.24。對于厭氧氨氧化反應(yīng)器而言，出水氨氮的平均濃度為3.49mg/L。在M3 階段，由于雨季的原因，進(jìn)水氨氮濃度降低。部分亞硝化池的出水NO?2?N/NH+4?N 比值大部分低于1.32，甚至低于1.0。這對后續(xù)的厭氧氨氧化脫氮有很大的挑戰(zhàn)。產(chǎn)生這個現(xiàn)象的原因是：為了保持穩(wěn)定的部分亞硝化，需要維持FA對NOB的抑制。因此，出水氨氮濃度不宜較低，否則會出現(xiàn)部分亞硝化的失穩(wěn)現(xiàn)象。部分亞硝化池出水氨氮的平均濃度為40.57mg/L。對于厭氧氨氧化反應(yīng)器而言，出水氨氮的平均濃度為3.91mg/L，最高濃度為12.49mg/L。但出水氨氮濃度仍然低于15mg/L，說明厭氧氨氧化包埋填料具有較好的應(yīng)對進(jìn)水NO?2?N/NH+4?N 比值變化的能力。在M4階段，原水氨氮濃度逐漸升高，維持在117.34mg/L的水平。部分亞硝化池出水氨氮的平均濃度為49.25mg/L，出水NO?2?N/NH+4?N的平均比值為1.34。對于厭氧氨氧化反應(yīng)器而言，出水氨氮的平均濃度為1.46mg/L。總體來看，厭氧氨氧化反應(yīng)器出水氨氮的平均濃度為3.98mg/L，遠(yuǎn)低于《稀土工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2645—2011）的排放標(biāo)準(zhǔn)。同時，厭氧氨氧化包埋填料可以有效應(yīng)對進(jìn)水N?N/N?N比值的變化。

圖4(d)為厭氧氨氧化反應(yīng)池的氮去除和NRR的變化情況。厭氧氨氧化包埋填料的NRR 平均為0.64kg N/(m3·d)，最高可達(dá)1.02kg N/(m3·d)，氨氮和亞硝酸鹽氮的去除率達(dá)到94.43%。厭氧氨氧化包埋填料去除的總氮約占進(jìn)水總氮的60%，這是因為原水中含有硝酸鹽氮以及部分亞硝化和厭氧氨氧化反應(yīng)也會產(chǎn)生硝酸鹽氮。相較于傳統(tǒng)的硝化反硝化技術(shù)，理論上可以節(jié)省大約60%的有機(jī)碳源，極大降低運(yùn)行成本。但是厭氧氨氧化反應(yīng)池的出水含有硝酸鹽氮，仍需要反硝化技術(shù)處理。若能把這部分硝酸鹽氮僅還原為亞硝酸鹽氮供厭氧氨氧化菌使用，可以進(jìn)一步減少有機(jī)碳源的消耗。

圖4 厭氧氨氧化包埋填料處理稀土尾礦廢水的脫氮性能

2.3 厭氧氨氧化包埋填料耦合反硝化包埋填料的脫氮性能

如圖5(b)所示，C/N 比為2.5∶1 時，出水氨氮的平均濃度為17.54mg/L，出水亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度為0。說明反硝化包埋填料將一部分硝酸鹽氮直接還原為N2，另外一部分硝酸鹽氮進(jìn)行了短程反硝化，產(chǎn)生的亞硝酸鹽氮偏少，故會有氨氮的剩余。C/N比為2∶1時，出水氨氮的平均濃度為8.52mg/L，出水亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度幾乎為0。說明有機(jī)碳源還是比較充足的，反硝化包埋填料仍然將一部分硝酸鹽氮直接還原為N2。C/N比為1.5∶1時，出水氨氮的平均濃度為0.34mg/L，出水亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度為0。說明C/N為1.5可以實現(xiàn)厭氧氨氧化包埋填料耦合反硝化包埋填料脫氮。C/N降低至1∶1時，出水氨氮和硝酸鹽氮的平均濃度分別為7.56mg/L和8.59mg/L，這說明反硝化包埋填料沒有將硝酸鹽氮全部還原，出現(xiàn)了硝酸鹽氮的剩余。同時產(chǎn)生的亞硝酸鹽氮偏少，故也會有氨氮的剩余。因此，C/N=1.5 為厭氧氨氧化包埋填料耦合反硝化包埋填料的最佳條件。第17～26d，控制C/N比為1.5∶1，可以發(fā)現(xiàn)出水氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的平均濃度分別為0.65mg/L、0mg/L和0mg/L，滿足《稀土工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 26451—2011）的排放標(biāo)準(zhǔn)。在其他的研究中，也發(fā)現(xiàn)了同樣的觀點。Li等[19]認(rèn)為，有限的碳源供應(yīng)可以促進(jìn)反硝化細(xì)菌的富集，在電子供體（C/N=1.5）受限的情況下可以加速亞硝酸鹽氮的累積。本研究能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的短程反硝化可能與反應(yīng)體系的高pH有關(guān)。本研究部分亞硝化反應(yīng)池的pH控制在8.2～8.3之間，而且厭氧氨氧化和反硝化反應(yīng)均會產(chǎn)生堿度使反應(yīng)體系的pH 上升。這主要是由于硝酸鹽氮還原酶和亞硝酸鹽氮還原酶的相對活性存在差異，在堿性條件下兩種酶的活性都會受到抑制，但亞硝酸鹽氮還原酶活性受到的抑制作用更強(qiáng)[20]。Shi 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)pH=9.0 的堿性條件下產(chǎn)生較高的亞硝酸鹽氮積累。以上說明了在中試規(guī)模的條件下，控制合適的碳氮比，反硝化包埋填料可以實現(xiàn)穩(wěn)定的短程反硝化，為厭氧氨氧化包埋填料連續(xù)提供底物。本研究結(jié)果對厭氧氨氧化耦合短程反硝化在稀土尾礦廢水處理領(lǐng)域的推廣應(yīng)用具有重要意義和參考價值。

圖5 厭氧氨氧化包埋填料耦合反硝化包埋填料脫氮

根據(jù)反應(yīng)方程式(8)和式(9)，反硝化作用將硝酸鹽氮還原為氮氣所需的電子受體與亞硝酸鹽氮還原為氮氣所需的電子受體之比為5∶3，采用耦合的方式脫氮，剩余40%的總氮可以節(jié)省3/5的有機(jī)碳源投加量，也就是節(jié)省24%的有機(jī)碳源投加量。加上之前節(jié)省60%的有機(jī)碳源，總共可以節(jié)省84%的有機(jī)碳源。采用耦合的方式脫氮，極大地降低運(yùn)行成本，也可以減少反硝化池的設(shè)置。

如圖5(c)所示，厭氧氨氧化包埋填料的NRR平均 為0.88kg N/(m3·d)，最 高 可 達(dá)0.94kg N/(m3·d)，總氮去除率平均為95.6%。根據(jù)厭氧氨氧化反應(yīng)方程式去除的氨氮和亞硝酸鹽氮以及生成的硝酸鹽氮的比例關(guān)系，以厭氧氨氧化反應(yīng)去除的氨氮便可以計算出理論上厭氧氨氧化包埋填料去除的總氮，在整個實驗周期，總氮大部分是由厭氧氨氧化包埋填料去除的，乙酸鈉的加入并沒有明顯抑制厭氧氨氧化菌的活性。在類似的研究中，Güven 等[22]也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：COD濃度低于180mg/L對厭氧氨氧化反應(yīng)沒有明顯影響，當(dāng)COD濃度高于360mg/L時會對其產(chǎn)生明顯的抑制。本研究在C/N比為1.5∶1時，COD濃度低于180mg/L，這也說明了厭氧氨氧化包埋填料耦合反硝化包埋填料的可能性。厭氧氨氧化和反硝化包埋填料雖然在同一個反應(yīng)器內(nèi)，但對基質(zhì)的利用情況不一樣。進(jìn)水中的乙酸鈉大部分會被反硝化包埋填料利用，從而避免了厭氧氨氧化包埋填料中反硝化菌的大量生長，這也為實現(xiàn)長期穩(wěn)定的耦合脫氮提供了可能。

2.4 高通量測序分析

如表3 所示，Simpson 指數(shù)由0.04 增長到0.11，Shannon 指數(shù)由5.27 下降到3.39，同時ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)均大幅度的下降，說明包埋填料內(nèi)部菌群多樣性下降，菌群豐度和菌群數(shù)量大幅度下降。這可以解釋為：在特定的運(yùn)行條件下，一些優(yōu)勢菌群在競爭中勝過其他菌群，逐漸富集，而其他菌群逐漸衰亡，雖然多樣性指數(shù)下降和菌群數(shù)量減少，但是系統(tǒng)形成了功能性菌群。

表3 樣品S1、S2和S3的多樣性指數(shù)

在門的分類水平上，如圖3(a)所示，樣品S1、S2 和S3 的相對豐度均>1%的菌門有：變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、裝甲菌門（Armatimonadetes）和厚壁菌門（Firmicutes）。樣品S2 和S3 中浮霉菌門的相對豐度占比最大，而厭氧氨氧化菌屬于浮霉菌門，這是厭氧氨氧化包埋填料高脫氮效率的主要原因。綠彎菌門作為厭氧氨氧化系統(tǒng)內(nèi)的主要伴生菌[23]，會參與有機(jī)物的降解過程，在厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)去除衰亡的菌體及胞外聚合物[24]。其相對豐度從17.43%下降至4.5%，說明了厭氧氨氧化反應(yīng)裝置內(nèi)有機(jī)物的減少。裝甲菌門可以貢獻(xiàn)次生代謝產(chǎn)物鉬輔因子和葉酸，有益于厭氧氨氧化菌活性并促進(jìn)其生長[25]。其相對豐度從1.6%上升至6.08%，進(jìn)一步促進(jìn)了厭氧氨氧化菌活性的發(fā)揮。

在屬的分類水平上，如圖3(b)所示，樣品S1和S2 中Candidatus Kuenenia的相對豐度從5.53%增加到35.67%，Candidatus Anammoxoglobus的相對豐度從1.32%增加到2.98%。這一結(jié)果表明本實驗中使用的包埋材料適合厭氧氨氧化菌的生長，并成功地在厭氧氨氧化包埋填料中富集。Candidatus Brocadia的相對豐度從6.83%到未檢出。本來，Candidatus Brocadia是適應(yīng)和馴化前的優(yōu)勢菌屬，由于不適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，包埋填料中超過一半的厭氧氨氧化菌逐漸死亡，這也是厭氧氨氧化包埋填料在適應(yīng)和馴化初期活性增長緩慢的原因之一。厭氧氨氧化包埋填料單獨處理稀土尾礦廢水后，Candidatus Kuenenia的相對豐度增長到45.23%，較處理前增長了9.56%，而Candidatus Anammoxoglobus的相對豐度增長到3.67%，變化不是很明顯。Candidatus Kuenenia占據(jù)整個厭氧氨氧化菌屬的92.49%，依然為優(yōu)勢菌屬。

Candidatus Brocadia在稀土尾礦廢水中被淘汰的主要原因有兩個。首先，不同的厭氧氨氧化菌對亞硝酸鹽氮濃度有不同的耐受水平。研究表明，Candidatus Kuenenia可以耐受至少180mg/L 的亞硝酸鹽氮濃度，而Candidatus Brocadia最高只能耐受70mg/L的亞硝酸鹽氮濃度[26]。在本研究中，適應(yīng)和馴化階段的亞硝酸鹽氮平均濃度為73.88～210.92mg/L。因此，Candidatus Brocadia無法存活。其次，稀土元素威脅著厭氧氨氧化菌的生存。例如，Su等[27]發(fā)現(xiàn)隨著稀土元素鑭濃度的增加，Candidatus Kuenenia和Candidatus Anammoxoglobus是主要的厭氧氨氧化菌，其他4種厭氧氨氧化菌的相對豐度低于0.02%。本研究的稀土尾礦廢水中含有稀土元素鑭，這可能會導(dǎo)致Candidatus Brocadia的衰亡。

不同的水質(zhì)條件對厭氧氨氧化包埋填料的菌屬種類具有重要影響。王曉曈等[8]采用人工配水進(jìn)行厭氧氨氧化包埋填料的活性增長實驗，厭氧氨氧化菌屬僅為Candidatus Kuenenia。王維奇等[28]采用人工配水進(jìn)行厭氧氨氧化包埋填料脫氮實驗，發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌屬為Candidatus Kuenenia和Candidatus Brocadia。Candidatus Brocadia之所以可以存在，是因為其人工配水的亞硝酸鹽氮濃度為40～50mg/L，沒有對Candidatus Brocadia產(chǎn)生抑制[26]。本研究和上述研究都存在Candidatus Kuenenia，且都為優(yōu)勢菌屬，說明包埋固定化有利于Candidatus Kuenenia生長。Candidatus Anammoxoglobus僅存在于本研究中，說明該菌屬可以很好地適應(yīng)稀土尾礦廢水。

厭氧氨氧化包埋填料除了厭氧氨氧化菌屬，還有氨氧化菌屬Nitrosomonas（0.9%、0.5%和0.45%）、亞硝酸鹽氧化菌屬Nitrospira（0.48%、0 和0）、反硝 化 菌 屬Pseudomonas（0.76%、0.9% 和7.7%）、Thauera（0.64%、1.59%和1.67%）、Halomonas（0、0.55%和0.59%）、Comamonas（0.89%、0 和0）和Ignavibacterium（0.76%、0.99%和1.38%）。這些菌群參與厭氧氨氧化反應(yīng)池中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的轉(zhuǎn)化，致使ΔNO?2?N/ΔNH+4?N 和ΔNO?3?N/ΔNH+4?N 比值呈現(xiàn)一定的波動性。整體來看，Nitrosomonas始終存在，Nitrosomonas氧化氨氮的同時也降低了水中DO 濃度，避免了DO 對厭氧氨氧化菌群的抑制。反硝化菌屬的總相對豐度明顯上升，反硝化菌降解厭氧氨氧化反應(yīng)池內(nèi)的COD，避免COD 對厭氧氨氧化菌群的抑制，這對厭氧氨氧化菌群脫氮具有非常重要的意義。

3 結(jié)論

（1）厭氧氨氧化包埋填料對稀土尾礦廢水有良好的適應(yīng)性。采用階梯式底物和縮短HRT 的運(yùn)行策略（三個階段）進(jìn)行適應(yīng)和馴化后，成功實現(xiàn)了厭氧氨氧化包埋填料活性的有效提高，NRR 最高可達(dá)0.99kg N/(m3·d)，是適應(yīng)和馴化初期的8.39倍。

（2）僅采用厭氧氨氧化包埋填料處理稀土尾礦廢水，去除的總氮約占進(jìn)水總氮的60%，有效降低了有機(jī)碳源的投加量。面對進(jìn)水NO?2?N/NH+4?N 比值的極端情況，仍然可以保證出水達(dá)標(biāo)，整個運(yùn)行過程的氨氮平均濃度為3.98mg/L，滿足《稀土工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 26451—2011）的排放標(biāo)準(zhǔn)。

（3）控制C/N比為1.5∶1，成功實現(xiàn)了厭氧氨氧化包埋填料與反硝化包埋填料的耦合，厭氧氨氧化包埋填料的活性沒有受到明顯影響。出水總氮的平均濃度為0.65mg/L，總氮去除率平均為95.6%，滿足《稀土工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 26451—2011）的排放標(biāo)準(zhǔn)，理論上可以節(jié)省84%的有機(jī)碳源。

（4）在適應(yīng)和馴化的運(yùn)行策略和稀土尾礦廢水水質(zhì)條件雙重脅迫下，Candidatus Brocadia菌屬的相對豐度從6.83%到未檢出。Candidatus Kuenenia的相對豐度從5.53%上升至35.67%，Candidatus Anammoxoglobus的相對豐度從1.32%上升至2.98%，厭氧氨氧化菌屬的總相對豐度為38.65%，說明填料可以成為良好的微生物生長繁殖載體。