廣東佛山地區(qū)田間煙粉虱的隱種鑒定及帶毒率檢測

林曉濤 王依娜 張可國 鐘澤鑫 劉雅婷

（佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528000）

煙粉虱〔Bemisia tabaci（Gennadius）〕屬半翅目（Hemiptera）粉虱科（Aleyrodidae），是一種入侵性強、危害性大的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，已入侵除南極洲外的100 多個國家和地區(qū)（Boykin et al.，2007；Wang et al.，2010），是一個快速進化的復合種（de Barro et al.，2011），目前推測的煙粉虱隱種已達40 個（鄭慧新，2021）。我國報道的煙粉虱隱種有15 個，其中MEAM1 和MED 隱種是我國許多地區(qū)的優(yōu)勢種（劉銀泉和劉樹生，2012）。MEAM1隱種于20 世紀90 年代傳入我國，并在南方地區(qū)煙草、番茄等多種作物上為害嚴重（羅晨 等，2002；Wu et al.，2002）。MED 隱種于2003 年首次在云南被發(fā)現(xiàn)，其后陸續(xù)在北京、山東、河南等地發(fā)生為害（褚棟 等，2005；Chu et al.，2006）。近年來，MED 隱種憑借超強的環(huán)境適應性和化學藥劑抗藥性在我國境內(nèi)迅速擴散，逐漸取代MEAM1 隱種成為我國主要優(yōu)勢種群（Teng et al.，2010；Hu et al.，2011；Pan et al.，2011；Zheng et al.，2017）。

煙粉虱的危害不僅表現(xiàn)在刺吸植物汁液，造成植物枯萎，分泌蜜露，造成煤污??；還表現(xiàn)在傳播多種植物病毒病上（談星 等，2021）。研究表明，煙粉虱可以傳播200 余種植物病毒，包括番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）和番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）（Jones，2003；衛(wèi) 靜 等，2015）。TYLCV是危害全球番茄產(chǎn)量最嚴重的DNA 病毒，屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）。該病毒1939 年在以色列首次發(fā)現(xiàn)，并于2002 年傳入我國，隨后迅速蔓延至我國各省份（李延剛和李長松，2011）。TYLCV 主要危害茄科、豆科蔬菜，作物感染該病毒后，出現(xiàn)葉片黃化、植株矮化、果實僵化等癥狀，嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)（劉晨 等，2016）。ToCV 與TYLCV類似，可侵染番茄、茄子等茄科植物，是長線形病毒科（Closteroviridae）的一種RNA 病毒。該病毒1998 年首次在美國佛羅里達州被發(fā)現(xiàn)，2012 年在我國北京檢測到后，迅速擴散至我國多個省份（Zhao et al.，2013）。ToCV 可導致感染植株發(fā)育受阻、果實減產(chǎn)，造成嚴重的經(jīng)濟損失（Wintermantel &Wisler，2006）。

在自然條件下，TYLCV 和ToCV 不能在植物之間傳播，只能依靠昆蟲媒介如煙粉虱進行傳播（Rubinstein &Czosnek，1997；Wisler et al.，1998）。鄭慧新等（2016）研究指出，TYLCV 和ToCV 在我國的流行暴發(fā)與煙粉虱的大規(guī)模入侵密切相關。因此，了解各地區(qū)煙粉虱的入侵情況及其攜帶TYLCV 和ToCV 病毒的情況，有助于科學制定控制煙粉虱的有效策略，為我國TYLCV 和ToCV 的綜合防控提供科學指導。

本試驗采集了廣東省佛山市6 個地點的煙粉虱樣本，通過DNA、RNA 提取及PCR 擴增，檢測了佛山地區(qū)田間煙粉虱MED 和MEAM1 隱種的種群分布情況及其TYLCV 和ToCV 的帶毒率，以期為佛山地區(qū)田間有效且可持續(xù)地防治煙粉虱及其攜帶的病毒病提供全面、科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙粉虱樣本的采集

2021 年9—11 月在廣東省佛山市6 個地點采集煙粉虱，田間采集樣品信息詳見表1。各點采集樣本數(shù)量均≥ 200 個，將采集樣本（活體）置于5 mL 離心管中，-80 ℃保存。

表1 煙粉虱田間采集樣品信息

1.2 煙粉虱隱種鑒定

分別從各地點采集的煙粉虱樣本中隨機選取20 頭成蟲，利用DNA 提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取單頭煙粉虱的DNA。根據(jù)Chu 等（2005）的方法，PCR 擴增mtCOI基因，引物序列見表2。使用限制性內(nèi)切酶AseI 進行酶切處理，電泳檢測，根據(jù)酶切的片段大小確定隱種。若AseI 成功將mtCOI片段酶切成2 個不同長度的片段（498 bp，122 bp），則表明樣本為MED 隱種；若AseI 酶切后，mtCOI片段仍為620 bp，則表明樣本為MEAM1 隱種。為了驗證試驗結果的準確性，在每個地點樣本中隨機選取1～2 個個體，PCR 擴增后送北京擎科生物技術有限公司測序驗證。

表2 供試引物信息

1.3 煙粉虱TYLCV 帶毒率檢測

分別從各地點采集的煙粉虱樣本中隨機選取20 頭成蟲進行TYLCV 帶毒率檢測。以單頭煙粉虱DNA 為模板，使用TYLCV 的特異性引物進行PCR 擴增，引物序列見表2。PCR 反應體系 為20 μL：PCR Mix 10 μL，TYLCV-61 1 μL，TYLCV-473 1 μL，煙粉虱DNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循環(huán)30 次；72 ℃ 15 min。PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

1.4 煙粉虱ToCV 帶毒率檢測

分別從各地點采集的煙粉虱樣本中隨機選取20 頭左右成蟲進行ToCV 帶毒率檢測。使用TRIzol試劑（Invitrogen 公司）提取單頭煙粉虱總RNA。使用NanoDrop 2000 超微量分光光度計（Thermo Scientific）對RNA 進行定量，并采用1% Tris/硼酸鹽/EDTA（TBE）瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。根據(jù)說明書的指示，采用TaKaRa 公司的反轉錄試劑盒PrimerSprit?RT Reagent Kit 進行cDNA 合成，合成的cDNA 立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以單頭煙粉虱cDNA 為模板，使用ToCV 的特異性引物進行PCR 擴增，引物序列見表2。PCR反應體系為20 μL：PCR Mix 10 μL，ToCV-172 1 μL，ToCV-610 1 μL，cDNA 模板1.5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR 反應條件為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)30 次；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

2 結果與分析

2.1 煙粉虱隱種鑒定

由圖1 可知，佛山市三水區(qū)番茄寄主上采集的煙粉虱種群全部為MED 隱種，禪城區(qū)、南海區(qū)、順德區(qū)均為MED、MEAM1 混合種群。其中，除南海區(qū)獅山鎮(zhèn)石門中學和南海區(qū)佛山科學技術學院外，其余地點的優(yōu)勢種均為MED 隱種，占比≥85%（表3）。表明，在廣東省佛山地區(qū)，田間煙粉虱主要以MED、MEAM1 種群混合發(fā)生，且MED隱種為多數(shù)地點的主要發(fā)生種。

圖1 佛山地區(qū)煙粉虱隱種鑒定情況

表3 佛山地區(qū)煙粉虱隱種分布情況

2.2 煙粉虱TYLCV 帶毒率檢測結果

由表4 可知，佛山6 個地點的田間煙粉虱樣品均攜帶TYLCV，且除南海區(qū)獅山鎮(zhèn)石門中學外，其余地點的煙粉虱TYLCV 帶毒率均大于50%。表明TYLCV 經(jīng)煙粉虱傳播，已在佛山地區(qū)擴散。

表4 佛山地區(qū)煙粉虱TYLCV 帶毒情況

2.3 煙粉虱ToCV 帶毒率檢測結果

由表5 可知，佛山6 個地點的田間煙粉虱樣品均攜帶ToCV，且除南海區(qū)丹灶鎮(zhèn)金沙上安村外，其余地點的煙粉虱ToCV 帶毒率均達到100%。表明，ToCV 經(jīng)煙粉虱傳播已在佛山地區(qū)迅速蔓延。

表5 佛山地區(qū)煙粉虱ToCV 帶毒情況

3 結論與討論

歷經(jīng)6 年田間調(diào)查，鄭慧新（2021）總結了我國田間煙粉虱隱種的動態(tài)變化規(guī)律：MED 隱種持續(xù)作為田間優(yōu)勢種群分布于全國各地區(qū)，MEAM1隱種零星分布在沿海、云貴高原地區(qū)。肖思（2019）研究發(fā)現(xiàn)，2017 年在廣東廣州甘藍寄主上采集的煙粉虱為MEAM1 隱種，占比達100%；2018 年在廣東廣州黃瓜、茄子寄主上采集的煙粉虱均為MEAM1、MED 混合種群，且在茄子上MED 隱種占比達60%。本試驗對2021 年采集自佛山6 個地點的田間煙粉虱進行了隱種鑒定，結果顯示三水區(qū)番茄寄主上的煙粉虱種群全部為MED 隱種；禪城區(qū)、南海區(qū)、順德區(qū)均為MED、MEAM1 混合種群，且大部分地點MED 隱種占比大于MEAM1?？梢?，MED 隱種正在廣東地區(qū)擴張傳播，呈現(xiàn)出取代MEAM1 隱種成為廣東地區(qū)主要優(yōu)勢種的趨勢。

TYLCV 和ToCV 都是以煙粉虱為主要媒介進行傳播，一般感染了TYLCV 的番茄將減產(chǎn)30%，嚴重的可減產(chǎn)50%，甚至絕收（趙統(tǒng)敏 等，2007；范麗娜 等，2021）。鄭慧新（2021）調(diào)查顯示：2015 年在我國29 個地區(qū)采集的14 個煙粉虱種群中只有2 個種群的TYLCV 帶毒率為100%，而在2016 年采集的15 個煙粉虱種群中有14 個種群的TYLCV 帶毒率達到了100%。短短1 年時間，TYLCV 就在我國大部分地區(qū)迅速傳播蔓延。本試驗結果顯示，2021 年采集自佛山地區(qū)的田間煙粉虱樣本除南海區(qū)獅山鎮(zhèn)石門中學茄子寄主上煙粉虱種群TYLCV 帶毒率為40%外，其他地點帶毒率均大于50%。田間癥狀為：番茄葉片邊緣均出現(xiàn)不同程度的上卷，部分植株出現(xiàn)矮化、果實著色不均勻。

回望2013—2016 年間全國煙粉虱ToCV 的帶毒情況（鄭慧新，2021）：2013 年采集的15 個煙粉虱種群中，僅5 個攜帶ToCV，且?guī)Ф韭首罡咧挥?6.67%；2014 年這些種群帶毒率普遍上升，超過50%；2015 年這些種群帶毒率已遠超90%?？梢姡琓oCV 正在我國快速擴散。2014—2015 年間廣東廣州地區(qū)煙粉虱ToCV 的帶毒率均為0（鄭慧新，2021），而本試驗中2021 年廣東佛山地區(qū)煙粉虱種群的ToCV 帶毒率均大于50%，且在調(diào)查的6 個地點中有5 個地點帶毒率達到了100%。田間采樣時，部分地點的作物正值苗期，植株染病癥狀并不明顯；開花、結果期時筆者再次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，植株表現(xiàn)出嚴重的褪綠黃化、葉片干枯脫落等癥狀?？梢?，ToCV 在苗期的隱匿性極強，造成田間防治的困難。實時監(jiān)測煙粉虱種群ToCV 的帶毒率，或能在一定程度上探知植株ToCV 的染病情況，幫助農(nóng)民及早做出相應的防控措施，降低經(jīng)濟損失。

綜合分析佛山地區(qū)田間煙粉虱的隱種分布及帶毒率情況，發(fā)現(xiàn)煙粉虱MED 隱種占比高的地點TYLCV 的帶毒率也相對較高。這可能是因為煙粉虱MED 隱種獲毒、持毒、傳毒能力都明顯高于MEAM1（Ning et al.，2015）。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TYLCV 的煙粉虱MED 隱種在存活時間和產(chǎn)卵量上都高于MEAM1 隱種，并且發(fā)現(xiàn)獲毒后MED 隱種的環(huán)境適應性得到提高，而MEAM1隱種的環(huán)境適應性下降（Rubinstein &Czosnek，1997；Matsuura &Hoshino，2009；Pan et al.，2012）。因此，推測煙粉虱攜帶的不同植物病毒在某種程度上也影響了田間煙粉虱隱種的分布。

綜上所述，廣東省佛山地區(qū)目前主要以煙粉虱MED、MEAM1 種群混合發(fā)生，由煙粉虱傳播的TYLCV 和ToCV 已呈暴發(fā)流行趨勢。今后需對佛山地區(qū)田間煙粉虱攜帶的TYLCV 和ToCV 進行更加全面的監(jiān)測，為有效防控TYLCV 和ToCV 的流行和傳播提供科學指導。