馬鈴薯抗晚疫病種質(zhì)資源中抗病基因的篩選

李曉川， 王朝海， 周 平， 馬 維， 陳 軍， 陸 燚， 吳 顯， 王宗明，吳 瑞， 宋治豪， 馬 杰， 付 毅

(畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學研究所， 貴州 畢節(jié) 551700)

0 引言

【研究意義】我國是馬鈴薯生產(chǎn)第一大國，而貴州所處的烏蒙山區(qū)是我國馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)，但同時由于氣候冷涼潮濕，特別適合馬鈴薯晚疫病病原菌生長，易造成晚疫病大規(guī)模爆發(fā)。晚疫病由致病疫霉菌引起，是馬鈴薯生產(chǎn)的第一大病害[1-2]。晚疫病病原菌具有高度變異性，因此，研究新的晚疫病抗性基因?qū)︸R鈴薯晚疫病抗性育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已克隆獲得多個晚疫病抗性R(Resistance)基因，均是NBS-LRR類基因[3-15]。其中，來源于馬鈴薯野生種Solanumdemissum(2n=6x=72)的R1位于第V號染色體上[3]；R2和R2-like位于第IV號染色體上，在LRR2和LRR3間相差一段氨基酸序列[4]；R3a和R3b位于第XI號染色體上，有73%的氨基酸序列一致性[5-6]；R8位于第IX號染色體上[7]。來源于馬鈴薯野生種S.bulbocastanum(2n=2x=24)的Rpi-blb1/RB、Rpi-blb2和Rpi-blb3，被認為是具有廣譜晚疫病抗性的基因，Rpi-blb1/RB定位于第Ⅷ號染色體上[8-9]，Rpi-blb2位于第Ⅵ號染色體上與番茄Mi-1基因位點相同的區(qū)域[10]，Rpi-blb3定位于第Ⅳ號染色體上[4]，以及來源于S.venturii、S.americanum和S.stoloniferum的R基因，大多數(shù)R基因在不同馬鈴薯野生種中是同源基因[4，11-15]。最初晚疫病抗性基因的克隆主要通過圖位克隆的方式，但隨著發(fā)現(xiàn)R基因的結構上均為NBS-LRR類基因，利用不同的技術手段富集并挖掘抗晚疫病種質(zhì)資源基因組或轉(zhuǎn)錄組內(nèi)包含NBS-LRR保守序列的基因，進而篩選晚疫病抗性基因[13-15]的研究較多。【研究切入點】利用田間多點鑒定及室內(nèi)接種晚疫病病原菌鑒定得到的野生種S.demissum品系cs47，通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ν硪卟】垢胁牧系牟町惐磉_基因進行篩選，并根據(jù)已克隆晚疫病抗病基因在結構上的保守性，篩選差異表達基因中的馬鈴薯晚疫病抗病基因。【擬解決的關鍵問題】利用晚疫病抗病種質(zhì)資源，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術篩選晚疫病抗病基因，為馬鈴薯晚疫病抗性種質(zhì)創(chuàng)新與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣譜晚疫病抗性材料野生種S.demissum品系cs47，通過室內(nèi)接種晚疫病病原菌鑒定獲得，在2018—2020年于馬鈴薯晚疫病高發(fā)重災區(qū)的貴州省畢節(jié)七星關區(qū)和威寧彝族回族苗族自治縣6個地點進行田間晚疫病鑒定，發(fā)現(xiàn)其在晚疫病大規(guī)模發(fā)病的早期、中期和晚期，葉片雖有晚疫病侵染發(fā)病的菌斑，但菌斑均未擴大，說明其擁有持續(xù)且較強的抗性。卡它丁(Katahdin)、大西洋(Atlantic)和底西瑞(Desiree)經(jīng)過多年種植鑒定且查詢歐洲馬鈴薯栽培種數(shù)據(jù)庫(http://www.europotato.org/quick_search.php)，3個品種均為易感晚疫病品種。

1.2 方法

1.2.1 病葉取樣 分別取cs47、卡它丁、大西洋和底西瑞經(jīng)晚疫病侵染的多片葉片，按單品種混合。樣品經(jīng)液氮速凍后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及分析 樣品送安諾優(yōu)達生物科技公司進行轉(zhuǎn)錄組文庫構建和測序。經(jīng)Illumina NovaSeq PE150高通量平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，原始數(shù)據(jù)過濾掉低質(zhì)量Reads(測序片段)和不合格序列后，完整Reads使用Bowtie2(--bowtie2-mismatch-rate)與馬鈴薯參考基因組(SolTub_3.0)進行比對。基于上述比對后，對各樣本中比對到參考基因組的各unigene(條非重復序列)上的Reads進行定量，并進行FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值的轉(zhuǎn)換，從而獲取各條unigene的表達水平[16-17]。利用Corrplot進行相關性分析。基于定量得到各unigene的FPKM值對樣品間差異表達基因進行比較，利用DEGSeq進行cs47和卡他丁、cs47和底西瑞及cs47和大西洋的基因差異表達分析[18]，并選取|log2Ratio|≥1(即基因間表達水平相差大于2倍)和Q<0.05的基因作為顯著差異表達基因，并進一步選取基因間表達水平相差大于10倍的基因作為顯著差異的表達基因。對獲得的顯著差異表達基因利用GO(Gene Ontology，基因本體論分析)數(shù)據(jù)庫從生物過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細胞成分(Cellular component)3個類別進行基因功能注釋[19]。

1.2.3 序列比對及系統(tǒng)進化分析 基因的氨基酸序列利用Clustal Omega在線服務器(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行多序列比對[20]。利用MEGA 6的Neighbor-Joining參數(shù)經(jīng)過計算1 000次生成聚類樹[21]。

2 結果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序

將晚疫病抗病材料cs47和3個易感晚疫病品種進行轉(zhuǎn)錄組測序，過濾低質(zhì)量Reads和不合格序列后，樣品測得54 410 876～59 397 314個Reads。將完整Reads與馬鈴薯參考基因組進行比對，分別有4 602 576～40 166 116個Reads比對到參考基因組上。獲取各條unigene的表達水平，利用DEGSeq分別進行3組樣品間基因差異表達分析， cs47與卡它丁相比分別有6 464個和6 316個基因表達水平顯著上升和顯著下降(圖1A)；cs47與底西瑞相比分別有6 547個和6 264個基因表達水平顯著上升和顯著下降(圖1B)；cs47與大西洋相比分別有6 084個和6 264個基因表達水平顯著上升和顯著下降(圖1C)。經(jīng)計算，cs47與3個樣品間的相關性系數(shù)(r)分別為0.79、0.71和0.74，而3個樣品間的相關性系數(shù)分別為0.83、0.90和0.82，相關性系數(shù)越高，說明樣本間的表達模式越接近。因此，cs47與易感晚疫病品種的表達模式差異大于易感晚疫病品種間的表達模式差異。

注：A為cs47與卡它丁對比，B為cs47與底西瑞對比，C為cs47與大西洋對比。其中黃點和藍點分別代表基因表達顯著上升和顯著下降的基因。

2.2 差異表達基因的GO分析

cs47與卡它丁間的差異表達基因，在生物過程類別中涉及到免疫系統(tǒng)(immune system process)的分別有270個和223個表達顯著上升和顯著下降的基因，涉應激反應的(response to stimulus)分別有1 579個和1 616個表達顯著上升和顯著下降的基因(圖2A)。cs47與底西瑞間的差異表達基因，在生物過程類別中涉及到免疫系統(tǒng)的分別有283個和210個表達顯著上升和顯著下降的基因，涉應激反應的分別有1 599個和1 619個表達顯著上升和顯著下降的基因(圖2B)。cs47與大西洋間的差異表達基因，在生物過程類別中涉及免疫系統(tǒng)的分別有270個和193個表達顯著上升和顯著下降的基因，涉應激反應的分別有1 540個和1 540個表達顯著上升和顯著下降的基因(圖2C)。

圖2 3組對比顯著差異性表達基因的GO基因功能注釋

2.3 候選晚疫病抗性基因

在樣品間基因表達水平相差10倍的基因中，有3個基因?qū)儆赾c-NBS-LRR類，分別為PGSC0003DMP400045185、PGSC0003DMP400015105和PGSC0003DMP400015107，而當前已克隆馬鈴薯的抗晚疫病基因均屬于cc-NBS-LRR類基因，將其氨基酸序列與已克隆的馬鈴薯抗晚疫病基因進行序列比對，分別由911個、1 243個和1 072個氨基酸組成。已克隆R基因和候選R基因的蛋白序列內(nèi)均含有CC、NBS和LRR結構域區(qū)域(圖3)。并對候選R基因和已克隆的R基因進行系統(tǒng)進化分析顯示，PGSC0003DMP400045185和R1-A基因的親緣關系較近，同時與R8以及Rpi-blb2基因的親緣關系較近。PGSC0003DMP400015105和PGSC0003DMP400015107的氨基酸序列比較類似，與Rpi-pta1、Rpi-blb1/RB和Rpi-sto1基因的親緣關系較近(圖4)。

注：類似性質(zhì)的氨基酸為同顏色字符；R 基因的CC結構域區(qū)域標注為黃色、NBS結構域區(qū)域標注為藍色、LRR結構域區(qū)域標注為灰色。

圖4 3個晚疫病抗性基因與已克隆晚疫病抗性基因的系統(tǒng)進化樹

3 討論

通過轉(zhuǎn)錄組測序技術是分析馬鈴薯抗晚疫病種質(zhì)資源中抗病基因的重要手段。在本研究中，通過分析抗晚疫病種質(zhì)資源cs47與3個易感晚疫病品種的轉(zhuǎn)錄組差異表達基因發(fā)現(xiàn)，在不同材料中分別有6 084～6 547個和6 264～6 316個基因表達水平顯著上升和顯著下降。在不同材料中，涉及免疫系統(tǒng)的分別有270～283個和193～223個表達顯著上升和顯著下降的基因，涉及到涉應激反應的分別有1 540～1 599個和1 540～1 619個表達顯著上升和顯著下降的基因。

在更加顯著差異表達的基因中，得到3個cc-NBS-LRR類基因，分別為PGSC0003DMP400045185、PGSC0003DMP400015105和PGSC0003DMP400015107。PGSC0003DMP400045185和R1-A的親緣關系較近，同時又與R8以及Rpi-blb2基因的親緣關系較近。Rpi-blb2克隆自馬鈴薯野生種S.bulbocastanum，是具有廣譜晚疫病抗性的基因[10]。PGSC0003DMP400015105和PGSC0003DMP400015107與Rpi-pta1、Rpi-blb1/RB和Rpi-sto1基因的親緣關系較近。Rpi-blb1/RB克隆自馬鈴薯野生種S.bulbocastanum，是第1個克隆得到的具有廣譜晚疫病抗性的基因[8-9]，Rpi-sto1和Rpi-pta1克隆自馬鈴薯野生種S.stoloniferum，是Rpi-blb1/RB的同源基因[11, 13]。

4 結論

通過轉(zhuǎn)錄組測序技術，利用馬鈴薯抗病種質(zhì)資源廣譜晚疫病抗性材料野生種S.demissum品系cs47，篩選得到PGSC0003DMP400045185、PGSC0003DMP400015105和PGSC0003DMP400015107共3個潛在的晚疫病抗性基因。轉(zhuǎn)錄組測序技術有助于分離晚疫病抗病基因，為晚疫病抗性育種提供理論基礎。