王海峰 向曉歡 楊周赟 李奕萍

以進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)變性為特征的青光眼影響全球超過6000萬人，并已成為不可逆性失明的主要原因[1]。目前，青光眼的治療旨在降低眼壓以延緩RGC的進(jìn)行性死亡[2-3]。最近幾項(xiàng)研究揭示了炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷，并證明了Toll樣受體4/NOD樣受體3(TLR4/NLRP3)炎癥小體的激活參與了視網(wǎng)膜損傷的發(fā)展[4-7]。在眼部疾病的研究中，高良姜素能減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變，其作用機(jī)制涉及了降低小膠質(zhì)細(xì)胞激活、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2磷酸化、核因子-κB和早期生長反應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活[8]。然而，高良姜素對(duì)青光眼視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用的報(bào)道尚少，值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康SD 大鼠52只(48只月齡為3個(gè)月，雌雄各半，體重200～250 g；4只4 d齡，雌雄各半，體重30～42 g)，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK(渝)2017-0005]。本研究已獲得四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 主要試劑與儀器動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)系統(tǒng)(美國MIDMARK公司)、Hamilton注射器(瑞士Hamilton公司)、TonoLab回彈式眼壓計(jì)(芬蘭Icare公司)、Olympus FluoView1000共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)、異氟醚(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、聚苯乙烯微珠(美國Invitrogen公司)、膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素(FITC-V)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)、高良姜素(上海陶托生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型建立及分組將48只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、對(duì)照+高良姜素組、高眼壓組和高眼壓+高良姜素組，每組12只(12眼)。各組處理方法如下：造模后第0 天和第14 天采用動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)系統(tǒng)吸入異氟醚麻醉大鼠，高眼壓組和高眼壓+高良姜素組大鼠在手術(shù)顯微鏡下將直徑為10 μm、最終濃度為7.2×106個(gè)·mL-1的聚苯乙烯微珠注入大鼠右眼前房，誘導(dǎo)單側(cè)眼壓升高。對(duì)照組和對(duì)照+高良姜素組大鼠的眼睛相同部位注射等量的無菌生理鹽水。注射的具體操作如下：首先用30號(hào)針頭輕輕刺入角膜，然后使用Hamilton注射器通過預(yù)先形成的針孔將10 μL微珠溶液注入前房。注射后立即用棉簽防止微珠流出眼睛。術(shù)后，在注射眼局部涂抹抗生素軟膏以防止感染。造模后第15 天，對(duì)照+高良姜素組和高眼壓+高良姜組大鼠接受高良姜素滴眼液治療，每天1次，持續(xù)14 d。對(duì)照組和高眼壓組大鼠則接受相同劑量二甲基亞砜(DMSO)溶劑滴眼。高良姜素滴眼液配制方法：將高良姜素溶解于DMSO中以獲得25 g·L-1儲(chǔ)備液，然后將該儲(chǔ)備液進(jìn)一步溶解在DMSO溶液中制備2 g·L-1眼用溶液。為了讓高良姜素有效進(jìn)入眼睛，將藥物留在大鼠眼睛上5 min以上，并在1周內(nèi)使用新鮮配制的高良姜素滴眼液。

1.4 眼壓測(cè)量眼壓的測(cè)量方法參照文獻(xiàn)[9]，通過吸入異氟醚麻醉SD大鼠，并在動(dòng)物反射消失后使用TonoLab回彈式眼壓計(jì)測(cè)量眼壓。微珠注射前3 d測(cè)基線眼壓，于造模后第3天、第7天、第14天、第18天、第22天、第26天、第28天監(jiān)測(cè)大鼠眼壓變化,眼壓計(jì)通過內(nèi)部軟件自動(dòng)生成并顯示5次測(cè)量后的平均值，從每眼中獲得5個(gè)眼壓值，剔除最高值和最低值，并計(jì)算平均值以確定眼壓。

1.5 HE染色和免疫熒光化學(xué)染色造模后第28天，每組取6只SD大鼠，將動(dòng)物深度麻醉，取出眼球分離視網(wǎng)膜組織，固定脫水后包埋于石蠟塊中。常規(guī)切片脫蠟后，各組取一部分視網(wǎng)膜切片，采用HE染色檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化。使用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量視網(wǎng)膜厚度。

取另一部分視網(wǎng)膜組織脫蠟后，用10 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0) 進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后將其置于含1 g·L-1Triton X-100的PBS中室溫封閉1 h。切片在4 ℃下與大鼠一抗Brn3a多克隆抗體稀釋液(150)、兔抗TLR4多克隆抗體稀釋液(150)、大鼠一抗GFAP多克隆抗體稀釋液(1100)、兔抗NLRP3多克隆抗體稀釋液(150)孵育過夜。將切片洗滌數(shù)次，與Alexa Fluor?488抗小鼠IgG (H + L)或Alexa Fluor?594抗山羊IgG (H + L)二抗稀釋液(1200)在室溫下于黑暗環(huán)境中放置1 h。PBS洗3次后，細(xì)胞核用DAPI染色。使用Olympus FluoView1000共聚焦顯微鏡獲取圖像。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與分組根據(jù)文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行RGC分離。具體操作如下：取4 d齡的SD大鼠視網(wǎng)膜，并在4.5×103U·L-1木瓜蛋白酶溶液中水解。然后將細(xì)胞懸液依次與涂有兔抗巨噬細(xì)胞抗體和小鼠抗Thy1.1(CD90.1)抗體的培養(yǎng)皿一起孵育。收集RGC并將其接種到涂有小鼠層粘連蛋白和多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中。然后將RGC與200 μmol·L-1氯化鈷(CoCl2)一起孵育48 h誘導(dǎo)缺氧和細(xì)胞凋亡[11]；隨后加入0 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、50 μmol·L-1或100 μmol·L-1高良姜素處理，優(yōu)選最佳濃度另處理RGC細(xì)胞不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)。確定最佳高良姜素給藥處理時(shí)間后，將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組：空白組、光氣組和光氣+高良姜素組。光氣組和光氣+高良姜素組RGC與200 μmol·L-1CoCl2一起孵育48 h，然后光氣+高良姜素組RGC中加入20 μmol·L-1高良姜素孵育48 h，收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)RGC的凋亡率及相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，并采用ELISA法檢測(cè)各組RGC中IL-18和IL-1β表達(dá)水平。

1.7 CCK-8檢測(cè)RGC的增殖情況按1.6中方法處理的RGC接種到96孔板培養(yǎng)12 h，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，并將RGC在37 ℃下孵育4 h，然后用Synergy H1酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各組細(xì)胞的光密度。

1.8 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織及RGC中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況對(duì)照組、對(duì)照+高良姜素組、高眼壓組和高眼壓+高良姜素組中各取4只大鼠新鮮的視網(wǎng)膜組織，并收集各組大鼠RGC，分別在含磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解，并收集視網(wǎng)膜組織及RGC的總蛋白。使用BCA測(cè)定法測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度。將含蛋白質(zhì)上清液(20 μg)的10 g·L-1凝膠于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析，并通過濕法轉(zhuǎn)膜將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。然后將膜置于含50 g·L-1脫脂牛奶的TBST緩沖液中室溫封閉1 h。隨后將膜洗滌15 min，于4 ℃下與一抗稀釋液孵育過夜。洗膜數(shù)次，將其與辣根過氧化物酶(HRP 12500)偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗(抗兔或抗小鼠)于室溫下孵育1 h。洗膜數(shù)次，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗處曝光并顯影，借助UVP成像系統(tǒng)捕獲圖像。各種一抗稀釋比例如下：TLR4(11000)、GFAP(11000)、NLRP3(11000)、GAPDH(11000)。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)分析采用FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒評(píng)估RGC細(xì)胞凋亡情況。將上述處理的細(xì)胞接種在24孔板中并培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，胰蛋白酶消化離心收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞用FITC-V和PI染色15 min，最后使用FACS細(xì)胞儀進(jìn)行分析，以確定凋亡細(xì)胞百分比。

1.10 數(shù)據(jù)處理所有統(tǒng)計(jì)分析均使用Graph Prism 8.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高良姜素對(duì)大鼠眼壓的影響造模后第3～28天,與對(duì)照組比較,高眼壓組大鼠眼壓均顯著升高(均為P<0.001)。造模后第0～28天，對(duì)照組與對(duì)照+高良姜素組大鼠的眼壓差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。造模后第3～28天，對(duì)照組與高眼壓+高良姜素組大鼠眼壓差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。造模后第18～28天，與高眼壓組比較,高眼壓+高良姜素組大鼠眼壓均持續(xù)顯著降低(均為P<0.05)(圖1)。

圖1 各組大鼠造模后第0～28天眼壓變化情況 注：與對(duì)照組比較,***P<0.001；與高眼壓組比較,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。1 kPa=7.5 mmHg。

2.2 高良姜素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織和RGC的保護(hù)作用HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織無水腫、空泡。對(duì)照+高良姜素組大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與對(duì)照組大鼠相似。與對(duì)照組比較，高眼壓組大鼠右眼視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)明顯損傷，伴有視網(wǎng)膜水腫、空泡變性和核染色質(zhì)濃縮。與高眼壓組比較，高眼壓+高良姜素組大鼠視網(wǎng)膜組織無空泡、水腫不明顯，視網(wǎng)膜損傷顯著減輕(圖2)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色 注：GCL為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，IPL為內(nèi)叢狀層，INL為內(nèi)核層。

此外，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜厚度[(113.55±17.27)μm]與對(duì)照+高良姜素組[(124.36±20.69)μm]相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，高眼壓組大鼠視網(wǎng)膜厚度[(74.54±18.77)μm]顯著減少(P<0.01)。與高眼壓組比較，高眼壓+高良姜素組大鼠視網(wǎng)膜厚度[(94.24±19.97)μm]顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，高眼壓+高良姜素組大鼠視網(wǎng)膜厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠RGC生存率[(97.39±8.11)%]與對(duì)照+高良姜素組[(94.07±10.22)%]相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，高眼壓組大鼠RGC生存率[(46.89±8.71)%]顯著減少(P<0.01)。與高眼壓組比較，高眼壓+高良姜素組大鼠RGC生存率[(78.53±10.26)%]顯著增加(P<0.01)。與對(duì)照組比較，高眼壓+高良姜素組大鼠RGC生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織免疫熒光化學(xué)染色 注：紅色為RGC的細(xì)胞核。

2.3 高良姜素對(duì)TLR4/NLRP3炎癥小體的影響對(duì)照組和對(duì)照組+高良姜素組大鼠的GFAP主要位于神經(jīng)纖維層(NFL)。高眼壓組中，呈現(xiàn)出星形膠質(zhì)細(xì)胞增加并擴(kuò)展到視網(wǎng)膜的其他層。高眼壓+高良姜素組大鼠在高良姜素干預(yù)后可抑制這種擴(kuò)展(圖4)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高眼壓組大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4、NLRP3蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(均為P<0.001)，高眼壓+高良姜素組大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4、NLRP3蛋白表達(dá)均顯著降低(均為P<0.001)，對(duì)照+高良姜素組大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4、NLRP3蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與高眼壓組比較,高眼壓+高良姜素組大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4、NLRP3蛋白表達(dá)均顯著降低(均為P<0.01)(圖5)。這與免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果一致。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中TLR4、NLRP3蛋白的表達(dá)情況 注：免疫熒光化學(xué)染色標(biāo)記GFAP(紅色)、NLRP3(紅色)和TLR4(綠色)，ONL為外核層。

圖5 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中GFAP、NLRP3和TLR4蛋白的表達(dá) 注：與對(duì)照組比較,***P<0.001；與高眼壓組比較,##P<0.01，###P<0.001。

2.4 高良姜素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RGC細(xì)胞凋亡的影響本研究以20 μmol·L-1作為后續(xù)研究的最佳有效濃度，選擇24 h作為最佳高良姜素給藥時(shí)間。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，光氣組RGC凋亡率(28.33±3.56)%較空白組(5.24±1.17)%顯著增加(P<0.001)，而光氣+高良姜素組RGC凋亡率(13.98±1.96)%較空白組顯著增加(P<0.001)；與光氣組比較,光氣+高良姜素組RGC凋亡率明顯降低(P<0.001)。表明高良姜素處理顯著減少了RGC凋亡的數(shù)量。

2.5 高良姜素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RGC的TLR4/NLRP3炎癥小體的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組RGC中IL-18、IL-1β[(25.13±1.35)ng·L-1、(27.55±1.77)ng·L-1]相比,光氣組RGC中IL-18[(91.26±2.44)ng·L-1]和IL-1β[(67.54±2.87)ng·L-1]表達(dá)均顯著增加(均為P<0.001)。與光氣組比較，光氣+高良姜素組RGC中IL-18[(43.57±1.62)ng·L-1]和IL-1β[(38.14±1.19)ng·L-1]表達(dá)均顯著減少(均為P<0.001)。光氣+高良姜素組與空白組RGC中IL-18、IL-1β表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。此外，光氣組RGC中TLR4(3.23±0.43)、NLRP3(2.67±0.83)蛋白表達(dá)較空白組(0.96±0.07、1.05±0.09)均顯著增加(均為P<0.001)。且光氣+高良姜素組RGC中TLR4(1.27±0.12)、NLRP3(1.39±0.17)蛋白表達(dá)較光氣組均顯著減少(均為P<0.01)，與空白組RGC中TLR4、NLRP3蛋白表達(dá)相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

3 討論

本研究選擇局部給藥作為高良姜素給藥方式，結(jié)果顯示，高良姜素不僅可以降低眼壓，還可以保護(hù)RGC免受損傷。此外，這種治療可以通過抑制TLR4/NLRP3炎癥小體的激活抑制GFAP的活化，從而保護(hù)RGC免受損傷。這與Tanna等[12]研究報(bào)道的局部給藥是降低眼壓的最佳方法，并且其副作用極小的結(jié)果相似。

視神經(jīng)炎癥在青光眼中起著關(guān)鍵作用，特別是涉及炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素NLRP3炎癥小體；視網(wǎng)膜高眼壓損傷通過髓樣分化因子88、TNF受體相關(guān)因子和核因子-κB誘導(dǎo)TLR4信號(hào)激活，這進(jìn)一步導(dǎo)致NRLP3炎癥小體的激活，并分泌IL-1β和IL-18，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)毒性炎癥，導(dǎo)致軸突退化和RGC的死亡[13]。最近研究證實(shí)，TLR4/NF-κB通路抑制能有效降低急性青光眼中的NLRP1/NLRP3炎癥小體激活和IL-1β、IL-18的分泌，從而減輕RGC死亡[14]。本研究結(jié)果表明，高良姜素對(duì)視網(wǎng)膜高眼壓損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制TLR4/NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)的，為視網(wǎng)膜高眼壓損傷的炎癥反應(yīng)提供了新的治療策略，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論相似。

NLRP3誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥參與眼部疾病的發(fā)病機(jī)制。多項(xiàng)研究證實(shí)，NLRP3炎癥小體導(dǎo)致RGC丟失[15-16]。有研究表明，與TLR4基因野生型小鼠比較,接受視神經(jīng)橫斷的TLR4缺陷小鼠的RGC存活率更高[17]，表明TLR4與RGC損傷存在密切聯(lián)系。為進(jìn)一步探索高良姜素潛在的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，采用CoCl2在體外誘導(dǎo)缺氧并模擬青光眼微環(huán)境[18]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高良姜素逆轉(zhuǎn)了CoCl2誘導(dǎo)RGC中TLR4、NLRP3蛋白表達(dá)增加和IL-18、IL-1β炎癥因子分泌。這提示高良姜素可能通過抑制TLR4/NLRP3炎癥小體激活減輕RGC損傷。本研究中RGC的凋亡數(shù)量在100 μmol·L-1高良姜素作用時(shí)顯著減少，表明高良姜素在高濃度下具有毒性。這可能是由于當(dāng)藥物濃度過高時(shí)，介質(zhì)滲透壓升高，可能對(duì)RGC造成損害。

綜上，高良姜素局部給藥至眼睛可降低青光眼模型大鼠眼壓并防止RGC死亡，其保護(hù)機(jī)制可能與抑制TLR4/NLRP3炎癥小體激活有關(guān)。本研究結(jié)果可能為青光眼的治療提供一種新的有效策略。