菊芋WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族基因的鑒定及分析

趙孟良 郭怡婷 任延靖

（1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；2. 青海大學(xué)三江源生態(tài)和高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）又名洋姜，鬼子姜，屬菊科向日葵屬多年生草本植物［1］，原產(chǎn)自北美，18 世紀(jì)末傳入我國(guó)，常規(guī)用于腌制咸菜，隨著其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的發(fā)掘，菊芋已被廣泛應(yīng)用于食品開(kāi)發(fā)、藥用、工業(yè)、綠化觀賞等領(lǐng)域［2-7］。同時(shí)菊芋又具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，它可以在干旱地、沙荒地、鹽堿地等不同類型的土壤中種植，且能夠正常生長(zhǎng)［8-10］，并產(chǎn)生相當(dāng)可觀的生物量。由于菊芋對(duì)貧瘠土地較強(qiáng)的適應(yīng)性，已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)治理等領(lǐng)域［11-13］。除此之外，菊芋還可用于菊粉的提取以及功能食品［14］、動(dòng)物飼料［15］等的開(kāi)發(fā)。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最常見(jiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一，具有高度的保守序列和特殊功能，能夠參與植物響應(yīng)生物和非生物脅迫［16］。研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY67 參與調(diào)控水稻（Oryza sativaL.）響應(yīng)多種非生物脅迫，通過(guò)ABA 信號(hào)通路介導(dǎo)負(fù)向調(diào)控水稻苗期耐旱性［17］，而過(guò)表達(dá)水稻OsWRKY6能提高水稻對(duì)病原物的抵抗性［18］。在牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R. Br.）中，BhWRKY11 轉(zhuǎn) 錄因子可通過(guò)調(diào)控BhGolS1基因的表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱脅迫的耐受性［19］；在小麥中TaWRKYK2可與STZ和下游的抗旱基因RD29B啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)干旱脅迫有積極的調(diào)控作用。

截至目前，空心菜（Ipomoea aquatica）［20］、睡蓮（Nymphaea colorata）［21］等WRKY 轉(zhuǎn)錄因子已有相關(guān)研究，但未見(jiàn)到有關(guān)菊芋WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)研究。

本研究以菊芋的葉片為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族，對(duì)其進(jìn)行鑒定及表達(dá)分析，以期明晰與菊芋響應(yīng)干旱脅迫密切相關(guān)的WRKY 基因，為今后菊芋WRKY基因的克隆及功能驗(yàn)證奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取前期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組與代謝組測(cè)序的青芋2 號(hào)菊芋品種為研究材料，于2020年4月種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)基地，正常田間肥水管理，9月下旬于開(kāi)花期進(jìn)行取樣，選取盛花時(shí)期的7 個(gè)組織（包括根、塊莖、花莖、葉、花瓣、管狀花和幼嫩種子），液氮速凍后，置于-80℃貯藏備用，每個(gè)樣品選取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

同時(shí)，采用25% PEG-6000 模擬干旱脅迫，分別選取處理0、18、24 和36 h 的菊芋葉片與幼根，液氮速凍后，置于-80℃貯藏備用，每個(gè)樣品選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取及第一鏈cDNA 合成 采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 純度及完整性，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度及質(zhì)量，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA，將cDNA 溶液稀釋為100 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2HtWRKY基因的篩選 根據(jù)干旱脅迫下菊芋葉片的轉(zhuǎn)錄組信息（SUB8106956）、轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序注釋文件，以WRKY 為關(guān)鍵詞，依次在NR、Swissprot、Tremble 和KEGG 注釋文件中進(jìn)行搜索，根據(jù)搜索到的測(cè)序序列Cluster 編號(hào)查找序列信息，將查找到的Cluster 序列提交至NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），進(jìn)行在線BLAST 分析，再將獲得的比對(duì)序列提交至在線工具ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/） 中分析其序列特征，采用MEME3.0 分析序列的motif結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)Cluster 電子序列及NCBI 的比對(duì)結(jié)果，采用DNAMAN 9.0 軟件進(jìn)行序列相似度分析，選取重疊區(qū)域，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物，并且通過(guò)奧科（楊凌）生物工程股份有限公司合成引物，引物序列見(jiàn)附表1。

1.2.3 進(jìn)化樹(shù)分析 選取能夠比對(duì)到NCBI 中的74個(gè)菊芋的Cluster 片段，以及NCBI 中下載的30 個(gè)擬南芥、30 個(gè)向日葵、40 個(gè)萵苣的WRKY 基因，采用MEGA X 軟件的最大似然方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 組織差異表達(dá)分析與干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)基因的表達(dá)情況，以25sRNA和Clath-3為內(nèi)參基因，RTqPCR 反應(yīng)體系為2 × Unique AptamerTMqPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）10 μL、上下游引物各0.8 μL、模板cDNA（200 ng/μL）1 μL 和雙蒸水7.4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 15 min；95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，降溫：40℃ 30 s。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HtWRKY基因家族成員的鑒定及蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)篩選轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)117 個(gè)WRKY 基因，與NCBI 中WRKY 基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)部分Cluster序列比對(duì)到同一個(gè)WRKY 基因，綜合整理后，共鑒定出74 個(gè)WRKY 基因（附表2）。Expasy 分析顯示，序列長(zhǎng)度為510-2 040 bp，平均序列長(zhǎng)度為1 105 bp，編碼氨基酸數(shù)量為169-679 個(gè)，平均367 個(gè)，其中，序列最短的氨基酸是HtWRKY75-3，序列最長(zhǎng)的是HtWRKY2-3，分子量為18 882.98-74 247.19，平均為40 639.5，等電點(diǎn)為5.13-10.19，最低的是HtWRKY40-2，最高的是HtWRKY51-3，親水性分析顯示，HtWRKY65-3 具有較強(qiáng)的親水性，HtWRKY7-2 具有明顯的疏水性。

2.2 HtWRKY基因的保守基序分析

利用MEME 在線軟件對(duì)菊芋74 個(gè)WRKY 基因的保守序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）顯示，HtWRKY基因含有保守的Motif 基序的長(zhǎng)度為25-50 個(gè)堿基。

圖1 HtWRKY 基因的保守基序標(biāo)識(shí)Fig. 1 Conversed motif logo of HtWRKY genes

2.3 HtWRKY基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA X 軟件的最大似然法構(gòu)建74 個(gè)HtWRKY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），被分為四大類。

圖2 HtWRKY 基因的聚類分析圖及基序位置Fig. 2 Phylogenetic relationship and motif locations of HtWRKY genes

在這四大類中，第一類包含23 個(gè)基因，檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量為2-11 個(gè)不等，平均含有5.8個(gè)Motif，主要含有的保守基序?yàn)镸otif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8 和Motif 9；第二類包含19個(gè)基因，檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量為2-9 個(gè)，平均含有6 個(gè)Motif，主要含有的保守基序?yàn)镸otif 1、Motif 2、Motif 3 和Motif 6；第三類僅包含3 個(gè)基因，檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量分別是2、4 和6 個(gè)，平均含有4 個(gè)Motif；第四類包含29 個(gè)基因，檢測(cè)到的保守Motif 數(shù)量為2-11 個(gè)，平均含有7 個(gè)Motif，主要含有的保守基序?yàn)镸otif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8、Motif 9、Motif 14 和Motif 15。

2.4 WRKY家族基因的進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄因子HtWRKY 與其他物種WRKY 基因之間的親緣關(guān)系，選取與菊芋（Helianthus tuberosusL.）親緣關(guān)系較近的向日葵（Helianthus annuus）和萵苣（Lactuca sativa），以及模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）進(jìn)行家族進(jìn)化分析，利用MEGA X 軟件對(duì)74 個(gè)菊芋WRKY 家族基因、30個(gè)向日葵WRKY 家族基因、40 個(gè)萵苣WRKY 家族基因以及30 個(gè)擬南芥WRKY 家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖3）顯示，這些WRKY 基因分為了六大類，第一類33 個(gè)基因，其中菊芋WRKY 占27 個(gè)，其他分別是4 個(gè)萵苣和2 個(gè)擬南芥WRKY 基因；第二類40 個(gè)基因，分別包括菊芋、向日葵、萵苣和擬南芥的WRKY 基因15、8、11 和6 個(gè)，大部分HtWRKY 與這3 個(gè)物種的WRKY 聚為一小類；第三類2 個(gè)基因，分別是萵苣WRKY51 和擬南芥WRKY22；第四類23 個(gè)基因，分別包括菊芋、向日葵、萵苣和擬南芥WRKY 基因8、8、5 和2 個(gè)；第五類10 個(gè)基因，包含2 個(gè)HtWRKY、3 個(gè)HaWRKY、1 個(gè)LsWRKY 和4 個(gè)AtWRKY；第 六 類65 個(gè) 基因， 包 含21 個(gè)HtWRKY、11 個(gè)HaWRKY、18 個(gè)LsWRKY 和15 個(gè)AtWRKY，大部分HtWRKY 與這3 個(gè)物種中的WRKY 聚為一小類。

圖3 4 個(gè)物種WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of WRKY transcription factors in four species

2.5 HtWRKY家族基因的組織特異性表達(dá)分析

為進(jìn)一步明晰HtWRKYs在不同組織的表達(dá)特性，選取菊芋的種子、根、莖、葉、花瓣及塊莖為材料，以花為參考，運(yùn)用RT-qPCR 分析HtWRKY的表達(dá)特性，結(jié)果（圖4）顯示，種子中，HtWRKY6-1、HtWRKY7-4、HtWRKY65-5、HtWRKY33-1、HtWRKY6-6、HtWRKY40-4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22、HtWRKY33-2和HtWRKY44表達(dá)量較高；根中，HtWRKY33-1、HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY40-4、HtWRKY21、HtWRKY13和HtWRKY33-2表 達(dá) 量 較高；莖中，HtWRKY6-6、HtWRKY24、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY22、HtWRKY33-2表達(dá)量較高；葉 片 中，HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY6-6、HtWRKY21、HtWRKY22和HtWRKY33-2表達(dá)量較高；花 瓣 中，HtWRKY41、HtWRKY26-3、HtWRKY51-4、H t W R K Y 6-6、H t W R K Y 4 0-4、H t W R K Y 2 4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22和HtWRKY33-2表達(dá)量較高，且花瓣中的表達(dá)量普遍高于種子、根、葉片和莖中的表達(dá)量；塊莖中，HtWRKY51-4、HtWRKY17-3和HtWRKY13表達(dá)量較高，說(shuō)明菊芋WRKY家族基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。

圖4 HtWRKY 基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫下的組織特異性表達(dá)水平熱圖Fig. 4 Tissue-specificity expression heatmap of HtWRKY genes under PEG-6000 -simulated drought stresses

2.6 HtWRKY家族基因在干旱脅迫后的誘導(dǎo)表達(dá)

參考前期菊芋葉片在干旱脅迫后的轉(zhuǎn)錄組信息，分析所鑒定出的74 個(gè)WRKY 基因在干旱脅迫后的表達(dá)水平變化，結(jié)果（圖5）顯示，有11 個(gè)基因明顯受到干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，在PEG-6000 模擬干旱脅迫18 h 時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升的變化，分別為HtWRKY70、HtWRKY50、HtWRKY17-2、HtWRKY2-4、HtWRKY6-2、HtWRKY40-1、HtWRKY75-2、H t W R K Y 7-5、H t W R K Y 5 5、H t W R K Y 3 3-2和HtWRKY9-2；有7 個(gè)基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫24 h 表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升變化的趨勢(shì)，分別 為HtWRKY51-1、HtWRKY6-1、HtWRKY27、HtWRKY26-1、HtWRKY40-2、HtWRKY51-3 和HtWRKY75-3；有2 個(gè)基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫24-36 h 表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升變化的趨勢(shì)，分別為HtWRKY6-5和HtWRKY40-4。

圖5 74 個(gè)HtWRKY 基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫下的菊芋葉片中的表達(dá)水平熱圖Fig. 5 Expression heatmap of 74 HtWRKY genes under PEG-6000-simulated drought stress in H. tuberosus leaves

在根中，對(duì)干旱脅迫條件下74 個(gè)菊芋WRKY基因的表達(dá)進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)，鑒定出19 個(gè)HtWRKY基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫的菊芋根中有表達(dá)，結(jié)果（圖6）顯示，與CK 相比，除了HtWRKY55在3 個(gè)處理時(shí)間下的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高之后逐漸降低的趨勢(shì)，其他18 個(gè)HtWRKYs均呈現(xiàn)“升高-降低-升高”的變化趨勢(shì)。其中，HtWRKY20-1、HtWRKY32-1和HtWRKY75-3在干旱脅迫18 h 的相對(duì)表達(dá)量較高；HtWRKY51-1、HtWRKY2-1、HtWRKY65-5、HtWRKY58-2和HtWRKY75-3在干旱脅迫36 h 的相對(duì)表達(dá)量較高。

圖6 19 個(gè)HtWRKY 基因在干旱脅迫下菊芋根中的表達(dá)情況Fig. 6 Expressions of 19 HtWRKY genes in the Jerusalem artichoke roots under drought stress H. tuberosus

總之，發(fā)現(xiàn)HtWRKY51-1和HtWRKY75-3在菊芋葉片和根中均呈現(xiàn)高表達(dá)特性。

3 討論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族在生物和非生物脅迫響應(yīng)中起著重要作用［22］，這與高等植物的多種生物過(guò)程有關(guān)。WRKY 蛋白可以通過(guò)在其啟動(dòng)子位點(diǎn)與W-box 特異性結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)或抑制其下游基因的表達(dá)，并最終激活其應(yīng)激反應(yīng)［23］，據(jù)報(bào)道，多數(shù)WRKY基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的特性。Chu 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，棉花GhWRKY41正向調(diào)控轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽脅迫和耐旱性。Chen 等［25］報(bào)道了擬南芥中WRKY46、WRKY54 和WRKY70 轉(zhuǎn)錄因子參與了干旱反應(yīng)。Zhang 等［26］認(rèn)為WRKYs 參與了地梢 瓜（Cynanchum thesioides（Freyn）K. Schum.）抵御干旱脅迫的反應(yīng)。EI-Esawi 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AtWRKY30 轉(zhuǎn)錄因子可以提高小麥（Triticum aestivumL.）的耐熱性和耐旱性。Ghodke 等［28］分析了不同洋蔥（Allium cepaL.）基因型對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在抗逆品種中WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)表現(xiàn)出高度上調(diào)，然而，目前對(duì)菊芋中WRKY基因的分布和功能少見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)干旱脅迫下的菊芋葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出了響應(yīng)干旱脅迫的117 個(gè)WRKY 基因，通過(guò)與NCBI 的比對(duì)分析，去除比對(duì)重復(fù)的序列后，共鑒定出74 個(gè)WRKY 基因，分析其保守序列，發(fā)現(xiàn)含有保守Motif 基序的長(zhǎng)度為25-50 個(gè)堿基不等。利用MEGA X 軟件的最大似然方法構(gòu)建74 個(gè)HtWRKY基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，這些基因能夠被分為4 大類，第一類包含23 個(gè)基因，第二類包含19 個(gè)基因，第三類僅包含3 個(gè)基因，第四類包含29 個(gè)基因。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，這些WRKY 基因分為了六大類，第一類包含33 個(gè)基因，第二類包含40 個(gè)基因，第三類僅包含2 個(gè)基因，第四類包含23 個(gè)基因，第五類共包含10 個(gè)基因，第六類包含65 個(gè)基因。目前，關(guān)于HtWRKYs在干旱脅迫下不同組織中的表達(dá)模式尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)PEG-6000 模擬干旱脅迫，對(duì)不同菊芋部位的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了RT-qPCR 測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HtWRKY75-3在干旱脅迫36 h 時(shí)的表達(dá)量最高，達(dá)到188.71，后續(xù)可對(duì)該基因進(jìn)行克隆驗(yàn)證等工作。

植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫中起著至關(guān)重要的作用，轉(zhuǎn)錄因子主要根據(jù)其保守的DBDs［29］的特征氨基酸序列被分為幾個(gè)家族組。其中，DREB/CBF、NAC、MYB、WRKY 和bZIP 家族是在干旱過(guò)程中起作用的主要轉(zhuǎn)錄因子。

WRKY 蛋白屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子中WRKY-GCM1的超大家族［30］，存在于大多數(shù)植物中，并有助于提高植物抵御生物和非生物脅迫的能力［31-32］。研究發(fā)現(xiàn)OsWRKY11參與植物的干旱和熱響應(yīng)［33］。OsWRKY45被認(rèn)為對(duì)ABA 有響應(yīng)，并在氣孔關(guān)閉中發(fā)揮作用，以提高植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的能力［34］。HvWRKY38在大麥抵御干旱和寒冷時(shí)發(fā)揮著積極作用［35］。TaWRKY44的擬南芥超表達(dá)株系對(duì)ABA、干旱和鹽等脅迫處理的敏感性高于野生型，這與本研究中克隆獲得的菊芋WRKY 基因的功能相同［36］。

本研究結(jié)果還表明，HtWRKY參與了抵御干旱脅迫的作用，并揭示了HtWRKY基因與其他作物中已鑒定的WRKYs 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。綜上所述，這些結(jié)果為今后深入了解菊芋WRKY 基因家族的進(jìn)化，及其在非生物脅迫響應(yīng)中的關(guān)鍵作用提供了依據(jù)，在后續(xù)研究中可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化、染色質(zhì)免疫沉淀、酵母雙雜交和酵母單雜交等手段，進(jìn)一步研究HtWRKYs基因的功能和機(jī)制。

4 結(jié)論

在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出74 個(gè)WRKY 基因，其長(zhǎng)度為510-2 040 bp，Motif 基序?yàn)?5-50 個(gè)堿基，大部分HtWRKY基因與其他WRKY 基因聚合為一類。HtWRKY基因在花瓣和塊莖中相對(duì)表達(dá)量較高，分別有20 個(gè)和19 個(gè)HtWRKY基因在菊芋干旱誘導(dǎo)表達(dá)分析的葉片和根中呈現(xiàn)誘導(dǎo)后表達(dá)量上升的趨勢(shì)，HtWRKY參與了抵御干旱脅迫的過(guò)程。

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