植物花粉影響因素和保存方法研究進展

王 慧，張從合，黃艷玲，汪和廷，方 玉，楊 韋，管昌紅，楊 力，王 林，嚴 志

（1安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司/農業(yè)農村部雜交稻新品種創(chuàng)制重點實驗室，合肥 230088；2上海中科荃銀分子育種技術有限公司，上海 200233）

0 引言

花粉是植物種質的主要形式之一，具有豐富的遺傳多樣性[1]，在植物有性繁殖中發(fā)揮著非常重要的作用，也是植物遺傳、雜交育種和種質資源保存工作中最重要和最基礎的材料。但是大部分植物花粉在離體狀態(tài)下的壽命都很短，不利于植物的遺傳研究，同時也給雜交育種和種質資源研究工作帶來很大難度。

將植物花粉進行集中收集，在特殊的條件下進行花粉保存研究，延長花粉壽命，對于農業(yè)產業(yè)特別是提高育種進程，克服雜交制種花期不育或花時不同步，提高土地利用率，提高機械化水平，完善種質資源的保存等都具有非常重要的價值?；ǚ刍盍κ侵参镎Ｊ芫Y實的關鍵因素之一，花粉能否保存成功關鍵在于花粉活力的保持，1922年KNOWLTON等[2]最早報道了將金魚草花粉儲藏在超低溫(-180℃)后仍然具有一定的活力后，花粉保存研究日漸興起。據(jù)統(tǒng)計，國內外對花粉不同保存方法和保存技術的研究已從最初的果樹、主要農作物發(fā)展到園林植物、經濟林木、藥用作物等170多種植物材料，并開展花粉活力測定方法對花粉保存效果的檢驗，同時也有利用保存的花粉成功應用于雜交育種研究的報道[3-11]。為了完善種質資源保存方法及加速育種進程，本文通過整理上述研究，闡述了影響植物花粉生活力的主要因素、花粉生活力測定方法、花粉的收集及植物花粉的主要保存方法，以期為進一步研究不同植物花粉的長期高效保存提供參考依據(jù)。

1 影響花粉生活力的主要因素

花粉的生活力通常指維持受精時間長短的能力，影響花粉生活力的因素很多，植物花粉本身的基因型、花粉類型和遺傳特性決定了不同植物花粉的生活力不同；此外，溫度、濕度、光照和氣體成分等外在因素也會對花粉生活力產生很大影響。

1.1 花粉類型對花粉生活力的影響

花粉的類型、結構及所含的化學物質對花粉生活力影響較大，成熟花粉的壁內面包含一個營養(yǎng)細胞和一個生殖細胞或由生殖細胞產生的兩個精子。根據(jù)花粉成熟時所含的核數(shù)目，被子植物的花粉分為二核型、三核型以及兼具兩種花粉類型的混合型花粉。前人對265科植物花粉的觀察并分類得出，包括豆科、茄科、百合科、石蒜科等179科屬于二核型花粉；包括禾本科、十字花科、菊科等54科屬于三核型花粉；其余32科為混合型花粉[3,12]。

一般認為三核型花粉活力喪失速度是二核型花粉的2倍，與二核型花粉相比壽命較短也較難保存。因此研究二核型花粉成功保存的較多[12]。關于兩類花粉壽命差異的原因較多，有分析認為三核型比二核型多經歷一次減數(shù)分裂，消耗了細胞質內的淀粉、脂肪等貯藏物質導致，也有認為三核型花粉外壁較薄，所以抗外界環(huán)境如干燥等能力較差，還有認為三核型花粉的代謝旺盛，呼吸強度是二核型花粉的三倍左右，因此不易保存[13]。禾本科植物中的水稻、玉米、小麥等花粉屬于三核型，而木本科植物中的蘋果、梨、桃等屬于二核型[12]。

1.2 基因型及化學成分對花粉生活力的影響

不同物種的花粉生活力差別較大，如禾本科作物的花粉生活力在離體狀態(tài)下喪失較快，水稻花粉5分鐘基本全部失去活力，高粱花粉5 h基本全部失活，小麥花粉在5 h后授粉結實率僅為6.4%，玉米花粉生活力在離體狀態(tài)下僅維持1～2天，瓜菜類植物花粉處于自然狀態(tài)下4～5 h，花粉活力也會全部喪失[14-16]。

花粉本身是富含淀粉和脂肪及某些激素的有生命的顆粒，王金祥等[17]研究得出狼尾草相比水稻玉米花粉耐儲藏是由于其蛋白質含量較高、淀粉含量較低；李要民等[18]研究幾種禾本科植物花粉的生理比較表明花粉在貯藏過程中，花粉活力保存的時間長短與花粉的化學成分的變化有關，花粉活力保存較短的花粉中生長素、赤霉素、玉米素含量比活力保存時間長的花粉高，抑制生長的脫落酸含量則相對較低[19]。

同一物種不同品種間花粉生活力也有不同[20]，J.科佩等[21]研究玉米的8種不同遺傳背景之間花粉的生活力差異，通過花粉采集后置于4℃下80 min進行體外萌發(fā)實驗得出，8種玉米花粉的體外萌發(fā)百分比在28%～63%之間，相差兩倍多；同時研究了2種水稻基因型的花粉在相同環(huán)境下20 h后，花粉萌發(fā)率相差25倍?？梢娀蛐蛯ǚ凵盍τ绊戄^大。

1.3 環(huán)境因素對花粉生活力的影響

花粉生活力除受遺傳因素影響外，受環(huán)境條件特別是溫度和相對濕度的影響很大，同時，氣壓和氣體對花粉的貯藏壽命也會產生影響。王業(yè)遴等[22]研究表明濕度是影響桃花儲藏花粉生活力的主要因素，溫度次之，光照影響較小。李要民等[18]研究得出低溫高濕條件有利于禾本科作物花粉活力的保存，在低溫(5℃)高濕(80%)條件下，水稻和玉米花粉活力分別為46.4%和83.3%。J.科佩等[21]研究在減壓/減氧水平保存時，玉米花粉生活力保持時間更長，玉米最佳條件是67k～84 kPa，得出如果離體花粉在低于大氣壓下的狀態(tài)下，在高濕度和低溫儲存期間的花粉生活力通常會得到改善。在不損傷離體花粉原生質的前提下，保存花粉活力的有利環(huán)境是最大限度地降低花粉的代謝活性。

2 花粉生活力的測定方法

通常用染色法、離體萌發(fā)率測定法、基于微流控芯片技術檢測活力法及雜交授粉測定結實率法等檢測花粉生活力，進行花粉生活力測定，選擇適宜的活力檢測方法顯得尤為重要。

2.1 染色法

花粉染色法主要包括I2-IK法、四唑染色法（TTC法）、聯(lián)苯胺染色法、FDA熒光染色法等[23-24]。其中I2-IK法是根據(jù)淀粉遇碘變藍的深淺程度來判斷花粉的活力，對于菊屬植物等淀粉含量低的花粉不適宜用該方法[25]，對于細胞壁厚的花粉粒該方法染色很淺，而棉花花粉則不著色[13]。四唑染色法（TTC法）是利用無色的四唑（氯化三苯基四氮唑的簡稱）滲入細胞后與脫氫酶反應后的顏色來判斷花粉活性，有生活力的花粉為紅色。胡君艷等[26]得出TTC法測得銀杏花粉的活力最接近離體萌發(fā)測的花粉活力；但是該法染色后顏色差別較小不易分辨。聯(lián)苯胺染色法主要由花粉細胞壁上的過氧化物酶將聯(lián)苯胺氧化成藍褐色，進而判斷花粉的活性，番茄和馬鈴薯等由于花粉壁缺乏過氧化物酶，用聯(lián)苯胺不染色，禾本科作物的花粉用聯(lián)苯胺均能著色[14]。FDA熒光染色法能測試花粉中酶活性及質膜的完整性，通過熒光染料進入原生質后，被醋酶作用形成一種能產生熒光的熒光素并根據(jù)花粉產生熒光的情況判斷花粉活性[27-28]，該方法可以表征油茶花粉潛在的活力[28]，目前在國內少有報道。

2.2 離體萌發(fā)測定法

花粉離體萌發(fā)測定法是測定植物花粉活性較為直觀和準確的方法，指將花粉置于特定成分的培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，通過在顯微鏡下觀察花粉管伸長的長度來確定花粉活力的大小[13,29]。常用的培養(yǎng)基有液態(tài)和固態(tài)兩種，均是在一定的人工控制條件下培養(yǎng)，但離體萌發(fā)測定法應用過程中培養(yǎng)基中礦質元素、營養(yǎng)物質以及培養(yǎng)溫度和時間等萌發(fā)條件等都會影響花粉萌發(fā)率進而影響花粉的活力[30]，胡君燕等[31]認為固體培養(yǎng)基法比較適宜測定銀杏花粉生活力，在培養(yǎng)基中添加少量的硼和鈣對銀杏花粉萌發(fā)有一定的促進作用。有研究表明玉米的花粉較難在培養(yǎng)基上萌發(fā)，石思信等[15]研究配制15%的蔗糖、0.01%的硼酸、0.03%的硝酸鈣、0.7%的瓊脂配制成的固體培養(yǎng)基可以是玉米花粉的萌發(fā)率達到74%。袁德義等[32]研究得出離體萌發(fā)法是山茶屬植物花粉最為理想的快速測定法。

2.3 基于微流控芯片技術檢測活力法

隨著科技的不斷發(fā)展，近年來快速測定花粉活力也會用到基于微流控芯片技術的花粉活力分析儀，主要原理是當細胞流經施加了高頻交流電壓的微電極，高靈敏傳感器即刻捕捉到兩電極間的阻抗變化，得到流經細胞的數(shù)量、大小、以及其他物理特征，進而快速分析出花粉活力。該方法檢測縮短了樣品預處理的時間，無需染色、操作簡單、測定快速，并且不會破壞花粉，大大節(jié)省了科研工作者的時間及勞動支出，并可得到大量可供分析的信息和實時數(shù)據(jù)。J.科佩等[21]利用花粉活力分析儀快速分析玉米、水稻等離體花粉活力。但由于活力分析儀價格昂貴而沒有被廣泛應用。

2.4 雜交授粉測定結實率

雜交授粉測定結實率主要通過將花粉授予母本柱頭，成熟期計算母本結實率來測定花粉的生活力，是最真實也是最具有實際應用價值的方法，在進行田間授粉時需要注意隔離母本花粉，防止其他花粉干擾，在進行試驗設計時也要避免由于遺傳因素導致的不親和，該方法檢測花粉活力的時間較長，也容易受到外界因素的影響。

3 花粉的采集

不同植物花粉的特性不同，花粉采集的時間、方法和季節(jié)也不同?；ǚ鄣漠a量和質量除了受遺傳特性影響之外還會受到環(huán)境因素的限制[1]。CRADDOCK等[33]得出剛開裂的花藥保存花粉效果最好。梁立等[34]研究得出成熟花粉與近成熟花粉的保存效果較好，而幼嫩花粉保存效果較差。MARCHANT等[35]則認為未開的花朵可以減少花粉污染的風險，也是可取的。通常花粉采集選擇在晴朗的天氣，于開花盛花期采集的數(shù)量和質量效果最好，雨天或雨后收集花藥含水量太高，導致花粉結團生活力降低[29]。大多數(shù)木本科植物在中午散粉量最大，牡丹花粉根據(jù)品種特性集中在10:00—14:00采集最佳[36]，且在綻口期采集的花粉萌發(fā)率最高，采集過早，則雄蕊未完全成熟，花粉量少且積累的營養(yǎng)物質不足，造成花粉活力低下；采集過遲，大部分雄蕊已散粉，影響花粉采集量。禾本科植物中，水稻花粉一般在晴朗的上午10:00—11:00開花高峰期進行采集，小麥花粉適宜在10:00—12:00和15:00—18:00采集[37]。

目前花粉采集主要分為人工采集和機械采集，人工采集花粉時間較長、效率較低、采粉不均勻，且人為操作可能會使花粉活力降低較快。關于機械采集，張從合等[38-40]研究保持禾本科作物離體花粉高活力的方法及裝置，可以縮短花粉采集時間，提高花粉采集效率和花粉生活力。

4 植物花粉的主要保存方法

4.1 有機溶劑保存方法

巖波洋造等[41]得出在有機溶劑中可以儲藏植物花粉。獼猴桃花粉、百合屬、茶梅、鳳仙花等均可以保存在有機溶劑中[11]。劉武林等[42]證實了山茶、柳、杏等植物花粉在有機溶劑中保存的可行性，認為選擇適宜的有機溶劑是能否應用有機溶劑貯存花粉的關鍵。常用的有機溶劑包括醚類、苯類、酮類、醇類等等。王郁民等[43]研究獼猴桃花粉的有機溶劑保存可行性，得出花粉在二甲苯、甲苯、苯、1-戊醇、乙酸乙酯和己烷等有機溶劑中能維持較久的生活力，但需要花粉含水量適中，中華獼猴桃和美味獼猴桃在有機溶劑中保存的適宜含水量分別為8.46%和8.71%。劉國儉等[44]將山荊子、桃、山杏3種果樹新鮮干燥花粉分別浸于丙酮、苯、二甲苯和乙酸乙酯4種有機溶劑中保存1天后都具有正?；ǚ鄣氖诰芰?。至今為止，用有機溶劑長期保存花粉的技術還鮮有報道。

4.2 低壓保存方法

通過提高CO2濃度，降低O2濃度有利于植物花粉的保存[11]，王金祥等[45]通過研究在不同分壓CO2和O2條件下，水稻、玉米和狼尾草花粉的活力，得出含2×104PaCO2的氣體條件有利于3種花粉的貯藏。李瑞嘉等[46]進行杏花粉的低壓保存研究，得出在5℃±2℃和79.7 kPa的低壓環(huán)境下可有效保存花粉1年。

4.3 低溫保存方法

低溫能夠明顯的延長花粉的壽命，低溫可以降低花粉呼吸強度和酶活性，一般來說，溫度越低，花粉保存的時間越長[11]。楊帆等[47]研究得出澳洲堅果花粉在4℃冰箱中保存30天，其萌發(fā)率仍然有10.79%。陳雅等[28]采用低溫(4℃)儲藏油茶“三華系列”花粉30天以上，花粉活力保持在40%～70%。胡君燕等[22]得出4℃冰箱干燥保存利于保持銀杏花粉生活力。陶麗等[48]研究澳洲堅果花粉的儲藏方式，認為4℃、濕度50%人工氣候箱貯藏花粉5天后的花粉萌發(fā)率與對照相當，貯藏效果最好。小麥花粉在3～4℃低溫環(huán)境下保存兩周后依然有很好的授粉結實率。而張保才等[49]認為低溫干燥法有利于保持辣椒花粉的活力，在4±1℃低溫環(huán)境下，干燥處理較未干燥處理延長20天左右。

4.4 超低溫保存方法

目前普遍認為最長久保存花粉的方法是超低溫保存。1922年KNOWLTON等[2]最早報道了將金魚草花粉儲藏在超低溫(-180℃)后仍然具有一定的活力。江雨生等[50]首次將桃、梨4個品種的花粉在超低溫儲藏365天，研究花粉的授粉結實率、離體萌發(fā)率等與新鮮花粉進行比較，均無明顯差異。王琳等[51]研究扁桃花粉可在超低溫環(huán)境下保存，且保存后仍具有較高的活力。王彩虹等[52]對杏的兩個栽培種花粉的低溫和超低溫儲藏進行了研究，得出在適宜含水量下兩種溫度保存一年后花粉的授粉結實率變化不大。陳霜瑩等[53]進行了39個樹種包括蘋果、梨和桃等花粉的超低溫保存。張金梅等[54]研究得出桃花花粉在超低溫下可保存至少4年。相關研究報道美國山核桃的花粉可超低溫保存長達10年時間[55]。目前已經實現(xiàn)了鱷梨、巴旦木、桃、梨、杏、李、核桃、葡萄、枇杷、榆葉梅和海棠等果樹作物的花粉超低溫保存。

在農作物花粉的研究中，石思信等[15]得出玉米花粉經超低溫保存1～2年后授粉有結實；孫果忠等[16]研究得出花粉含水量在11.3%～14.7%范圍是玉米花粉超低溫保存成功的關鍵。胡晉等[14]研究水稻花粉超低溫保存7天后依然有一定的活力，得出花粉含水量在9.11%和13.24%含水量較適宜水稻恢復系花粉的超低溫保存。張保才等[49]將辣椒花粉在超低溫貯藏1年后仍具有較高的花粉生活力。李秉玲等[56]研究17個芍藥品種花粉超低溫保存方法，得出花粉在經超低溫保存4年后仍具有較高的萌發(fā)率，用其授粉可獲得種子。常維霞等[57]得出山茶屬3種植物茶梅、攸縣油茶及多齒紅山茶花藥花粉經超低溫保存半年后仍具較高的活力，甚至超過保存前的水平。已見報道的農作物花粉超低溫保存研究還涉及瓜菜、經濟作物、藥用植物和牧草等幾大類物種，包括洋蔥、芹菜、橄欖型油菜、番茄等蔬菜作物；杜仲、鵝掌楸等經濟林木；魔芋、甘蔗、茶樹、諸葛菜、人參、西洋參、枸杞等藥用植物；象草、無芒麥草、等牧草[1,3-10]。

5 展望

近年來，隨著分子生物學和多學科交叉研究技術的迅速發(fā)展，花粉保存技術的研究也在不斷深入。科研工作者前期對植物花粉進行了大量研究，特別是在花粉保存方法和技術程序方面取得了很好的效果，但是依然存在一些問題：

（1）植物花粉不同的保存方法的保存機理研究較少?；ǚ凵盍υ诒４媲昂蟮母淖兣c花粉膜透性、細胞內含物質、植物抗氧化酶系統(tǒng)等之間的關系研究還不夠深入，花粉保存機理研究相對較少，關于花粉細胞學方面的研究報道較少。

（2）不同保存方法保存花粉后生活力的保障是關鍵?；ǚ劢涍^保存后是否保持其原有的生活力是判斷花粉保存方法是否有效的主要衡量指標，目前大多數(shù)花粉活力通過花粉萌發(fā)率來判斷，但是能夠萌發(fā)的花粉有的活力較低，在雜交授粉時不一定能夠結實，故花粉萌發(fā)率不能真實的反映花粉的生活力。而通過染色法檢測花粉生活力的方法快速簡單，主要靠人為觀察顏色，有時受到花粉顏色的干擾存在一定的誤差，也不能很精準的判斷出花粉生活力。因此為了更好的研究不同物種花粉的適宜保存方法和效果，花粉生活力的判斷不僅要結合離體萌發(fā)率測定，也需要結合人工授粉結實率來計算。

（3）超低溫保存技術是進行種質資源保存的一條重要途徑，也將成為花粉保存和研究的重要方向。目前超低溫保存花粉技術已經成功應用于農作物、瓜菜、藥用植物、木本科植物等多種植物中，具有較大的應用價值，但是多數(shù)集中在花粉適宜含水量、花粉復蘇方式等研究上，而關于超低溫保存植物花粉的一套標準操作流程尚未建立[29]，且關于花粉保存前后的生理生化研究及保存后遺傳穩(wěn)定性研究也相對較少。

花粉的長期保存具有重大的應用潛力，尤其解決雜交制種過程中花期不遇、花時不同步、制種用工難、機械化程度低、提高制種產量、父本知識產權保護以及瀕危植物種質資源保護等方面都發(fā)揮著巨大作用。