郭巨先，李桂花，符 梅，劉縣明，羅文龍，駱善偉，劉玉濤

（1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2韶關(guān)甜寶農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，廣東韶關(guān) 5125002；3廣州國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣州 510520）

0 引言

芋頭[Colocasia esculenta(L.)Schott]，俗稱芋艿，或毛芋，原產(chǎn)于中國、馬來西亞、印度等國家，是一種糧菜兼用的作物，具有較高的食療和醫(yī)療價(jià)值，同時(shí)具有多種生物活性、抗氧化，以及降低膽固醇和血糖、提高免疫力等作用[1-2]。中國是世界芋頭主產(chǎn)國之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，到2019年，中國芋頭收獲面積達(dá)到9.85萬hm2，產(chǎn)量1954.8萬t，世界芋頭品種有700多個(gè)，中國有400多個(gè)品種[3]。隨著粵港澳大灣區(qū)“菜籃子工程”的建設(shè)，芋頭作為市場流通的主要大宗農(nóng)副產(chǎn)品之一，芋頭已被列為擬開發(fā)的14種特色蔬菜之一[4]，可見芋頭在蔬菜中的地位越來越高。在中國芋頭種植區(qū)域主要以珠江流域和臺灣為主，長江及淮河流域次之?！坎綑壚葡阌蟆菑V東省廣州市花都區(qū)炭步鎮(zhèn)的特產(chǎn)之一，具有個(gè)頭大、淀粉含量較高、有粉而香的優(yōu)點(diǎn)[5-7]。2014年，‘炭步檳榔香芋’已入選國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保產(chǎn)品目錄，遠(yuǎn)銷香港、澳門、新加坡、新西蘭、加拿大等地[4]。隨著科技的迅速發(fā)展，芋頭的栽培技術(shù)也在不斷提高。其中，基肥和膨大肥是芋頭種植過程中兩個(gè)最重要的施肥環(huán)節(jié)，對芋頭植株生長發(fā)育及其最終產(chǎn)量影響至關(guān)重要。已有研究表明，施加有機(jī)肥能顯著增加芋頭單株子芋產(chǎn)量和數(shù)量[8]。近年來，微生物有機(jī)肥已得到逐漸重視。微生物有機(jī)肥的使用可明顯減少化肥施用量，降低環(huán)境污染，并且通過微生物與植物根系間的互作加速植物對養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高蔬菜產(chǎn)量和抗病能力[9-11]。研究表明，施用光合細(xì)菌有機(jī)肥不僅能夠顯著增加番茄的株高、地徑和品質(zhì)，還可有效調(diào)節(jié)土壤的pH，促進(jìn)園藝作物對土壤中速效氮磷鉀的吸收，改良土壤中有機(jī)質(zhì)含量[12]。微生物有機(jī)肥可有效改善土壤結(jié)構(gòu)，并且優(yōu)化土壤微生物菌群。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，微生物組學(xué)已被廣泛應(yīng)用到土壤微生物菌群分布和根際微環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)中來。微生物多樣性研究主要針對于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行分析的。王濤等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，施加微生物有機(jī)肥可有效緩解黃瓜連作問題，且能有效優(yōu)化連作土壤微生物菌群分布，改善連作土壤理化特性，進(jìn)而提高土壤酶活性。微生物有機(jī)肥可緩解設(shè)施菜地因單一的種植方式或者過量施肥而導(dǎo)致的土壤板結(jié)等問題。馬慧媛等[14]的研究表明，施用微生物菌肥可改善設(shè)施茄子土壤營養(yǎng)狀況，大幅增加土壤微生物數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)茄子營養(yǎng)生長，增加茄子的最終產(chǎn)量。高逸等[15]的研究表明，在設(shè)施生菜施用微生物有機(jī)肥后，可富集有益菌種類，改變土壤微生物比例，降低生菜發(fā)病率，提高生菜產(chǎn)量。然而，微生物有機(jī)肥對芋頭產(chǎn)量品質(zhì)以及土壤菌群的影響仍缺少系統(tǒng)研究。為此，本試驗(yàn)以‘炭步檳榔香芋’為材料，研究不同微生物有機(jī)肥效應(yīng)以及幾種施肥模式對香芋品質(zhì)和產(chǎn)量的影響，并利用微生物組學(xué)方法，分析微生物有機(jī)肥對土壤根際微生物種群的影響，并嘗試提出微生物有機(jī)肥通過根際微生物互作提高芋頭品質(zhì)性狀的分子機(jī)制，以期為芋頭提質(zhì)節(jié)本增效栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)在廣東省韶關(guān)市始興縣羅壩鎮(zhèn)上營村芋頭種植示范基地進(jìn)行，東經(jīng)24.8533°，北緯114.1533°，海拔190 m，年降水量1825 mm，年平均氣溫19.6℃，無霜期296天，屬熱帶亞熱帶季風(fēng)氣候。沙壤土，肥力中等，地勢平坦。土壤pH 6.97，有機(jī)質(zhì)29.9 g/kg，堿解氮134.01mg/kg，有效磷98.03mg/kg，速效鉀124.05mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)芋頭品種為‘炭步檳榔香芋’，微生物有機(jī)肥由廣東省微生物研究所提供（芽孢桿菌有效活菌數(shù)＞2億/g，含有約40%煙沫，有機(jī)質(zhì)＞60%）。硫酸鉀肥（K2O含量50%）和發(fā)酵腐熟的花生麩有機(jī)肥購于始興縣頓鎮(zhèn)鎮(zhèn)順景農(nóng)資經(jīng)營部（有機(jī)質(zhì)＞45%）。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2020年2月25日整地施基肥起壟。3月2日栽植芋頭，栽培密度為40 cm×40 cm，單壟種植，4月17日（發(fā)棵期）和6月17日（膨大期）分別追肥2次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)施肥處理（表1），T1：微生物有機(jī)肥基肥+復(fù)合肥+硫酸鉀=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+75 kg/hm2；T2：微生物有機(jī)肥基肥+復(fù)合肥+硫酸鉀=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+112.5 kg/hm2；T3：微生物有機(jī)肥基肥+復(fù)合肥+硫酸鉀=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+150 kg/hm2；對照(CK)：發(fā)酵腐熟的花生麩基肥+復(fù)合肥+硫酸鉀=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+75 kg/hm2。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)種1畦地(30 m2)。12月28日測定母芋、子芋重等芋頭產(chǎn)量指標(biāo)，同時(shí)取芋頭鮮樣分成兩部分，一部分鮮樣測定相關(guān)抗氧化物活性或含量以及Vc，一部分鮮樣烘干后測定芋頭總糖、總酚、總黃酮、直鏈淀粉、支鏈淀粉和粗纖維等芋頭的營養(yǎng)指標(biāo)。同時(shí)采用五點(diǎn)采樣法，取處理T1和CK的根際土壤樣品放-80℃冰箱，測定土壤微生物多樣性。

表1 香芋種植的施肥方案 kg/hm2

1.4 抗氧化物酶活性和營養(yǎng)成分檢測方法

丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的測定均采用試劑盒測定方法（索萊寶試劑盒）；抗壞血酸(Vc)的含量測定采用2,6-二氯靛酚滴定法(GB/T 5009.86—2016)；采用酸水解苯酚-硫酸比色法測總糖含量(GB/T 15672—2009)；福林酚比色法測定總酚的含量(GB/T 15672—2009)；硝酸鋁鹽比色法測定總黃酮[16]；利用雙波長比色法測定芋頭的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量[17]；利用范式洗滌法測定芋頭的粗纖維含量[18]；全氮的含量采用凱氏定氮法測定，全磷的含量采用鉬銻抗比色法測定，全鉀含量測定采用火焰光度法測定[19]。

1.5 土壤微生物組學(xué)分析

為比較基肥期施加微生物有機(jī)肥的效應(yīng)，我們在12月28日提取土壤樣品（約1 g），測定土壤微生物組學(xué)。處理組和對照組CK各6次生物學(xué)重復(fù)。樣品收集后液氮冷凍保存，采用Trizol法提取樣品DNA，并通過Illumina Hiseq2500 PE250測序儀進(jìn)行測序[15]。首先，使用Trimmomatic v0.32軟件對微生物組學(xué)測序得到的raw reads進(jìn)行過濾；然后利用cutadapt 1.9.1軟件對引物序列進(jìn)行識別和去除，獲得無引物序列的高質(zhì)量Reads。使用FLASH v1.2.7軟件，對每個(gè)樣本的高質(zhì)量Reads進(jìn)行重疊拼接。然后使用UCHIME v4.2軟件，識別并去除嵌合體序列以獲得最終的有效數(shù)據(jù)?；贠TUs和ASVs等特征的分析結(jié)果，對樣本進(jìn)行分類分析，得到各樣本在門、綱、目、科、屬信息，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和分類樹狀圖。以Alpha多樣性為參數(shù)，分析微生物有機(jī)肥處理下的物種多樣性程度，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的Ace、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)，繪制樣品稀釋曲線和等級豐度曲線。最后通過功能預(yù)測分析樣本中的基因功能或表型預(yù)測并計(jì)算功能基因或者表型豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生物有機(jī)肥施肥方式對香芋產(chǎn)量的影響

如表2所示，相對于對照(CK)，T1～T3對‘炭步檳榔香芋’的單株母芋和子芋的質(zhì)量無顯著影響；各處理在田間可收獲健康芋頭的比例在80.2%～96.0%，產(chǎn)量在15436～21392 kg/hm2，T1～T3的產(chǎn)量極顯著大于對照，說明微生物有機(jī)肥能顯著提高芋頭的田間抗病性；另外，追肥期間增加硫酸鉀肥對母芋和子芋重均無顯著影響，對子芋和母芋密度也無顯著影響，說明基肥期間，施加適量微生物有機(jī)肥對芋頭的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要促進(jìn)作用。

表2 不同施肥方式對香芋產(chǎn)量的影響

2.2 不同微生物有機(jī)肥施肥方式對香芋營養(yǎng)品質(zhì)的影響

各處理的‘炭步檳榔香芋’營養(yǎng)品質(zhì)結(jié)果如表3所示。相對于CK，T1～T3處理對Vc、總酚、直鏈淀粉和粗纖維均有不同程度的促進(jìn)作用。其中，T1和T3的Vc含量顯著高于CK；T1～T3總酚含量和粗纖維含量隨著硫酸鉀肥量增加而增加，與CK差異顯著，總酚含量比對照上升幅度為12.4%～27.0%，粗纖維含量比對照增加20.1%～38.8%；直鏈淀粉含量比對照增加8.8%～33.7%。T1～T3各處理對總糖、總黃酮和支鏈淀粉含量無顯著影響，甚至對于總糖和支鏈淀粉含量略有降低趨勢。因此，施加微生物有機(jī)肥和適量的硫酸鉀肥可有效提高芋頭的總酚、直鏈淀粉和粗纖維的含量。

表3 不同施肥方式對香芋母芋營養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.3 不同微生物有機(jī)肥施肥方式對香芋活性物質(zhì)的影響

各處理對‘炭步檳榔香芋’活性物質(zhì)的影響結(jié)果如表4所示。相對于CK，各處理僅在一定程度上提高抗氧化活性，SOD活性、CAT活性和MDA含量都呈降—升—降趨勢，POD活性呈先升后降的趨勢。其中T1的POD活性最高，達(dá)到603.75 U/(g FW)，比CK增加48.4%；T2的SOD活性、CAT活性和MDA含量最高，比CK分別增加118.0%、19.0%和58.8%。這些結(jié)果表明施加微生物有機(jī)肥和增加一定量的硫酸鉀肥有利于提高抗氧化物酶活性，提高芋頭植株的抗性。

表4 不同施肥方式對香芋活性物質(zhì)的影響

2.4 不同微生物有機(jī)肥施肥方式對香芋礦質(zhì)元素的影響

各處理對香芋礦質(zhì)元素含量如表5所示。各處理的全N含量呈降—升—降的趨勢，全P含量呈先升后降趨勢，全K含量呈先降后升的趨勢。T2的全N和全P的含量最高，分別達(dá)到18.75 g/kg和2.82 g/kg，比CK增加13.4%和61.1%，較CK差異顯著。T3的全K含量最高，達(dá)到17.99 g/kg，比CK增加29.3%，較CK差異顯著。這些結(jié)果說明施加微生物有機(jī)肥加適量硫酸鉀肥有利于促進(jìn)芋頭根莖中氮、磷和鉀元素的提高。

表5 不同施肥方式對香芋礦質(zhì)元素的影響g/kg DW

2.5 土壤微生物組學(xué)分析

為探究是否土壤微生物菌群會對炭步檳榔香芋根莖磷鉀含量的促進(jìn)作用有影響，本文進(jìn)一步展開了土壤微生物組學(xué)分析。其中，從12個(gè)生物樣品測序中，一共獲得957427對RawReads，經(jīng)過雙端Reads質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生950340條Clean Reads，8個(gè)樣品中，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生76273條Clean Reads，平均產(chǎn)生79195條Clean Read（s表6）。

表6 樣品測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Alpha多樣性反映了單個(gè)樣本的物種豐富度和多樣性，有多個(gè)指標(biāo)：Chao1、Ace、Shannon、Simpson 和Coverage。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度，即物種數(shù)量。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，并受樣本群落中物種豐度和群落均勻度的影響。如表7所示，施加微生物有機(jī)肥并不會顯著增加Chao1、Ace、Shannon、Simpson的指標(biāo)，對于土壤微生物多樣性影響不大。

表7 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

通過比較微生物有機(jī)肥處理下微生物物種的分布，表明微生物有機(jī)肥處理下，芽孢桿菌(Bacillus)、魏氏桿菌(Weissella)和念珠菌嗜酸桿菌(candidatussolibacterium)的豐度顯著高于CK組（圖1）。而根癌桿菌和乳酸菌豐度顯著降低，說明微生物有機(jī)肥可有效改變土壤微生物種群的分布，對于根際微環(huán)境及根系土壤互作有重要影響。

圖1 生物菌肥處理與對照比較下土壤微生物中物種（屬）分布圖

COG(Clusters of Orthologous Groups of protein)是原核生物同源蛋白簇?cái)?shù)據(jù)庫，是原核生物常用的蛋白質(zhì)功能分類數(shù)據(jù)庫。COG的功能預(yù)測分析方法與KEGG基本相同，分析結(jié)果表明（圖2），相對于CK，生物菌肥處理后，可有效增加核苷酸代謝、DNA重組、復(fù)制和修復(fù)效率，提高蛋白翻譯效率，優(yōu)化核糖體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而加速細(xì)胞分裂和染色質(zhì)重組，有利于芋頭氨基酸代謝和產(chǎn)量的累積。相反，微生物有機(jī)肥處理降低了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝（圖2）。

圖2 組間COG功能差異分類統(tǒng)計(jì)圖

3 結(jié)論與討論

芋頭是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，對于提高農(nóng)民收入起到重要的作用。由于芋頭在生產(chǎn)上以無性繁殖為主，長期以來農(nóng)民種植的芋頭種苗都是茬地自留種，加上芋頭生長周期長達(dá)10～12個(gè)月，因此連作問題十分嚴(yán)峻。傳統(tǒng)的茬地育苗方式導(dǎo)致芋頭種苗攜帶病原菌，抗性減弱、品質(zhì)變劣。長期的連作栽培措施導(dǎo)致土壤板結(jié)以及土壤有害微生物數(shù)量增加，農(nóng)民種植芋頭病害發(fā)生嚴(yán)重。尤其是近幾年，廣東省芋頭發(fā)病率高達(dá)到80%以上，福建寧德管理不當(dāng)?shù)奶飰K發(fā)病率甚至達(dá)到95%[7,20]，嚴(yán)重限制了芋頭的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，本研究圍繞特色芋頭生產(chǎn)中提質(zhì)增效的關(guān)鍵技術(shù)問題，探索了微生物有機(jī)肥對于改良土壤特性，優(yōu)化土壤微生物種群，進(jìn)而提高芋頭經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的效應(yīng)機(jī)制。

3.1 微生物有機(jī)肥對芋頭產(chǎn)量品質(zhì)相關(guān)性狀的影響

微生物有機(jī)肥中含有大量的高活性細(xì)菌，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生各種有利于植物生長的代謝物，如赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CTK)和吲哚乙酸(IAA)等。還可以產(chǎn)生各種維生素、氨基酸和各種有機(jī)酸等，這些代謝物可調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。同時(shí)，細(xì)菌還可以直接作用于植物的根部，進(jìn)而對于植物的生長發(fā)育起到調(diào)節(jié)作用[21-22]。本研究也證明通過基肥施加微生物有機(jī)肥，追肥增加硫酸鉀肥可有效減少炭步檳榔香芋子芋質(zhì)量和提高母芋質(zhì)量，同時(shí)提高健康芋頭的比率高達(dá)14.8%～15.8%，說明施加微生物有機(jī)肥對炭步檳榔香芋的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要作用。與本研究報(bào)道相似，肖樹濤等[23-24]的研究表明，施用微生物有機(jī)肥可顯著提高小麥葉片數(shù)、株高、分蘗數(shù)、產(chǎn)量和品質(zhì)。馬惠元等[14]的研究還表明，向茄子施用微生物有機(jī)肥可以改善土壤營養(yǎng)狀況，增加土壤微生物數(shù)量，從而促進(jìn)茄子的營養(yǎng)生長，有利于茄子的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量提高。另外，由于基肥和膨大肥對芋頭植株生長發(fā)育尤其后期影響至關(guān)重要[14]。已有研究表明，在基肥和膨大肥中施加適量有機(jī)肥可顯著增加芋頭單株子芋產(chǎn)量和數(shù)量[8]。本研究表明微生物有機(jī)肥和復(fù)合肥的配合施用也能對芋頭產(chǎn)量提高起到促進(jìn)作用。

另外，本研究也表明施加微生物有機(jī)肥可提高芋頭的品質(zhì)性狀，包括Vc、總酚、總黃酮、直鏈淀粉、粗纖維以及芋頭的N、P、K的含量（表3、5）。當(dāng)追施硫酸鉀肥112.5～150 kg/hm2時(shí)，芋頭的N、P、K的含量都顯著高于CK。田俊嶺等[25]研究也證實(shí)，在煙草中施用微生物有機(jī)肥后，可大幅度提高煙草的硝酸還原酶活性，成熟期煙葉蛋白質(zhì)含量顯著降低，煙葉品質(zhì)提高，煙葉游離脯氨酸含量、成熟時(shí)色素、根、莖、葉等器官鉀含量可顯著增加。

使用微生物有機(jī)肥可同時(shí)減少化肥施用量，降低環(huán)境污染程度，通過微生物與植物的相互作用，加速植物對養(yǎng)分的吸收利用，從而提高蔬菜產(chǎn)量和抗病抗逆能力[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)施加微生物有機(jī)肥配合硫酸鉀肥112.5 kg/hm2可對SOD酶活性、CAT酶活性和MDA酶活性有顯著的提高作用，同時(shí)MDA的含量也達(dá)到最高（表4）。這些結(jié)果說明微生物有機(jī)肥對芋頭的抗氧化物活性的影響因素較復(fù)雜。

3.2 微生物菌肥對土壤微生物菌群的影響

作為土壤養(yǎng)分和能量的“源”和“庫”，土壤微生物在維持不同的生態(tài)系統(tǒng)功能和碳氮循環(huán)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[26-27]。土壤養(yǎng)分的多樣性導(dǎo)致土壤碳源的復(fù)雜多樣化[28]，土壤微生物也是各種碳源降解的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[29]。微生物功能多樣性在保證生態(tài)平衡中的作用機(jī)制尚缺乏研究。本研究分析了施加微生物有機(jī)肥條件下土壤微生物菌群變化趨勢，發(fā)現(xiàn)了該處理并不會顯著提高微生物菌群多樣性。以Alpha、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)為例[30]，微生物有機(jī)肥的促進(jìn)效應(yīng)不足4%（表7），這可能與施氮肥的微生物多樣性的效應(yīng)有較大差異，也可能由于微生物有機(jī)肥處理后有機(jī)物歸還到土壤中的數(shù)量明顯提升，進(jìn)而導(dǎo)致微生物功能多樣性相似的主要原因[31-32]。

芽孢桿菌(Bacillus)和黃桿菌屬(Flavobacterium)是植物根際促生菌的兩大類型[32]。芽孢桿菌具有存活期長、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛分布于不同土壤和植物根際，有的還可侵入植物組織內(nèi)部。該屬中的許多菌株因其高效的固氮能力、對病原菌的極強(qiáng)抵抗力以及對植物的生長促進(jìn)作用而受到研究人員的廣泛關(guān)注[33-34]。值得注意的是，本研究中微生物有機(jī)肥處理下，芽孢桿菌(Bacillus)、魏氏桿菌(Weissella)和念珠菌嗜酸桿菌(candidatussolibacterium)的豐度增加顯著（圖1）。這些菌株的固氮能力及促生能力可能有效提高植物自身的核苷酸代謝以及蛋白翻譯效率，有利于增加芋頭的抗逆能力提高氨基酸代謝和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量（圖2）。與此報(bào)道類似，施入微生物有機(jī)肥有利于改善土壤的微生物分布模式，明顯增加土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，但可能會降低真菌的數(shù)量[35]，說明微生物有機(jī)肥可改變土壤細(xì)菌和真菌比例，刺激植物例如小麥的核苷酸和氨基酸代謝效率，進(jìn)而可能提高植物免疫應(yīng)答能力[24]。

綜上，微生物有機(jī)肥是一種以高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、環(huán)保為目標(biāo)的綠色肥料。既能提高芋頭的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和品質(zhì)，又能提高土壤肥力，可增加土壤中芽孢桿菌等微生物菌群豐度，進(jìn)而有效提高農(nóng)田綜合生產(chǎn)力，為我國綠色農(nóng)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展提供有效保障。