郗蒙雪，沈丹，石一凡，李春梅

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心，南京 210095

0 引言

【研究意義】我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)主要以集約化、封閉式為主，在帶來(lái)可觀經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也出現(xiàn)了不少亟待解決的問(wèn)題[1]。雞舍內(nèi)空氣污染問(wèn)題是近些年來(lái)養(yǎng)殖人員和科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。雞舍空氣細(xì)顆粒物（fine particles matters, PM2.5）是影響舍內(nèi)空氣質(zhì)量的主要因素之一[2]，其污染嚴(yán)重、成分復(fù)雜、毒性大，易誘發(fā)雞呼吸道炎癥，成為健康養(yǎng)雞生產(chǎn)的巨大風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。因此，闡明雞舍細(xì)顆粒物引起的雞肺炎癥損傷及緩解作用機(jī)制對(duì)于安全高效養(yǎng)雞生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期研究表明，雞舍內(nèi)空氣PM2.5不僅濃度高，而且含有多種重金屬離子和內(nèi)毒素，并攜帶多種有害細(xì)菌和真菌[4]。另外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雞舍PM2.5可誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[5]。飼料添加劑特丁基對(duì)苯二酚（tert-Butylhydroquinone, TBHQ）具有抗氧化[6]和抗炎[7]雙重功效，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生并釋放抗氧化酶，清除過(guò)多的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS），保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激的損傷[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)TBHQ對(duì)PM2.5誘導(dǎo)雞肺損傷的緩解作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。雞胚作為毒理學(xué)領(lǐng)域的經(jīng)典研究模型，具有血管網(wǎng)豐富且發(fā)育迅速、線粒體含量多等特點(diǎn)，常用于抗炎、抗應(yīng)激等方面作用的研究，是十分成熟的氧化應(yīng)激模型[11-12]。此外，雞胚與細(xì)胞相比更接近于機(jī)體的生長(zhǎng)環(huán)境，與機(jī)體直接暴露PM2.5相比更容易精準(zhǔn)把控染毒劑量，是 PM2.5毒性作用研究的成熟模型[13]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)以雞胚為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)建立雞舍PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺組織損傷模型，探討 TBHQ的緩解作用及相關(guān)機(jī)制，為預(yù)防或緩解雞舍PM2.5污染引起的雞呼吸道健康問(wèn)題提供理論依據(jù)和解決對(duì)策。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年5月至2020年12月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家畜環(huán)境控制與智慧生產(chǎn)研究中心完成。

SPF雞胚，購(gòu)自江蘇省南京市特有機(jī)有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）（是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（是生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，常用來(lái)反映機(jī)體氧化程度）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）（反映機(jī)體各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平）試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；RNA isolater試劑購(gòu)自 Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；雞舍PM2.5，采集于江蘇省某標(biāo)準(zhǔn)集約化養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.2 主要儀器

大氣顆粒物采樣器（BTPM-HS1）購(gòu)自丹東百特生物儀器有限公司；酶標(biāo)儀、渦旋儀購(gòu)自 Thermo公司；超聲波震蕩儀購(gòu)自江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司；梯度PCR熱循環(huán)儀購(gòu)自TaKaRa公司；光學(xué)顯微鏡（Nikon YS100）購(gòu)自Nikon公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI SteoOnePlus公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺損傷模型的建立 將PM2.5儲(chǔ)備液（1 mg·mL-1）用生理鹽水稀釋終濃度為0、0.25、0.5、1 mg·mL-1。14日齡雞胚的小頭端酒精消毒后打孔，1 mL注射器垂直注入雞胚卵白處，進(jìn)針長(zhǎng)度約1 cm，每只雞胚注射50 μL，每個(gè)濃度的試劑注射5個(gè)雞胚，重復(fù)3次試驗(yàn)。孵化箱溫度設(shè)定為37.5 ℃，濕度設(shè)定為68%，連續(xù)孵育5 d，每天觀察雞胚存活情況并記錄。

1.3.2 TBHQ對(duì)PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺損傷的緩解試驗(yàn) 據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取濃度為 0.25 mg·mL-1PM2.5以及0.1 μg·mL-1TBHQ（根據(jù)課題組前期研究結(jié)果）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。60只14日齡雞胚隨機(jī)分為4組（15只雞胚/組）：對(duì)照組（100 μL生理鹽水）、TBHQ組（100 μL 0.1 μg·mL-1TBHQ）、PM2.5組（100 μL 0.25 mg·mL-1PM2.5）以及 PM2.5和 TBHQ 組（50 μL 0.25 mg·mL-1PM2.5+ 50 μL 0.1 μg·mL-1TBHQ）。操作步驟同 1.3.1。

1.3.3 樣品采集 雞胚孵育至19日齡，采集肺組織樣本，記錄蛋重、胚胎重以及肺組織重量并及時(shí)整理。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 PM2.5的收集 將大氣顆粒采樣器（BTPMHS1）放置雞舍中央，采樣器流量為16.67 L·min-1，采樣時(shí)間為2019年6月早7:00到晚22:00，連續(xù)采樣30 d。

1.4.2 PM2.5的提取 根據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法，將采集有PM2.5的石英膜用塑料剪刀剪成約1 cm×3 cm大小，放置盛有去離子水的100 mL燒杯中。超聲波震蕩儀調(diào)至80 Hz，將燒杯放入其中，震蕩15 min后用塑料小鑷子取出石英膜，將懸濁液用六層紗布過(guò)濾至錐形瓶中。過(guò)濾完成的懸濁液分裝至離心管中，將其放入離心機(jī)中，4 ℃、12 000 ×g離心30 min。棄去上清，留約0.5 mL的液體，將其放置真空冷凍干燥儀中干燥過(guò)夜。干燥完畢的離心管放置干燥器中干燥6 h后，用生理鹽水重新溶解顆粒物，將其制成1 mg·mL-1母液，滅菌后放置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 雞胚肺組織切片 肺組織在4%多聚甲醛中固定。固定好后，用不同濃度的酒精進(jìn)行脫水處理。脫水完畢后，依次進(jìn)行透明處理，組織透蠟。修整制作好的蠟塊，放入石蠟切片機(jī)中切片，切片厚度設(shè)定為5 μm。蘇木素和伊紅染色后封片，虛擬顯微鏡下觀察切片。

1.4.4 雞胚肺組織中氧化應(yīng)激參數(shù)測(cè)定 取約0.2 g組織，預(yù)冷的生理鹽水沖洗去掉血液，濾紙擦干后放入燒杯，加入組織重量9倍的生理鹽水，勻漿后離心，吸取上清，制備10%組織勻漿液。取適量勻漿液，按照T-SOD、MDA、T-AOC試劑盒說(shuō)明書(shū)中詳細(xì)步驟進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，記錄并計(jì)算。

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取約20 mg組織放入離心管，加1 mL RNA isolater，裂解組織。4 ℃ 12 000×g離心15 min后，取上清，加入等體積的異丙醇，4 ℃靜置10 min，4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，加入75%乙醇輕輕洗滌，4 ℃ 12 000×g離心5 min，棄上清，放入通風(fēng)櫥晾干。約30 min后，加入DEPC水，溶解沉淀。從NCBI上獲取目的基因的核酸序列，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

測(cè)得總RNA濃度后，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行。調(diào)整cDNA濃度進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為20 μL：2×T 5 Fast qPCR Mix 10 μL，上下游引物均為0.8 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃反應(yīng)1 min，循環(huán)次數(shù)為1次；95 ℃反應(yīng)10 s，循環(huán)40次；60 ℃反應(yīng)10—15 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后，觀察溶解曲線判斷可行性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Tukey法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，采用GraphPad Prism 6.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺損傷模型的建立

2.1.1 PM2.5對(duì)雞胚存活率的影響 如表2所示，對(duì)照組與濃度為0.25、0.5、1 mg·mL-1的PM2.5各組中雞胚均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

表2 不同濃度PM2.5對(duì)雞胚存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of PM2.5 on the survival rate of chick embryos

2.1.2 PM2.5對(duì)雞胚肺組織的形態(tài)影響 如圖1所示，與對(duì)照組相比，0.25 mg·mL-1PM2.5組的雞胚肺泡中可見(jiàn)浸潤(rùn)的少量炎癥細(xì)胞，而0.5、1 mg·mL-1PM2.5組的雞胚肺泡中出現(xiàn)嚴(yán)重的肺水腫現(xiàn)象。因此，選取PM2.5濃度為0.25 mg·mL-1進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖1 不同濃度PM2.5對(duì)雞胚肺組織形態(tài)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PM2.5 on the morphology of chick embryo lungs

2.2 TBHQ對(duì)PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺組織損傷的影響

2.2.1 TBHQ或PM2.5對(duì)雞胚胚胎重量、肺組織重量及相關(guān)指數(shù)的影響 由表3可知，在各組蛋重?zé)o顯著差異條件下，PM2.5或 TBHQ各組的雞胚胚胎重量、肺組織重量、胚蛋比以及肺胚比與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。

表3 TBHQ或PM2.5對(duì)雞胚胚胎重量、肺組織重量及相關(guān)指數(shù)的影響Table 3 Effects of TBHQ or PM2.5 on embryo weight, lung tissue weight and related indexes of chick embryos

2.2.2 TBHQ對(duì)PM2.5處理雞胚肺組織形態(tài)的影響 如圖2所示，與對(duì)照組相比，TBHQ組的雞胚肺組織形態(tài)無(wú)明顯變化，PM2.5組肺泡中有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，PM2.5和 TBHQ共處理組的肺泡中可見(jiàn)少量的炎癥細(xì)胞。

圖2 TBHQ對(duì)PM2.5處理雞胚肺組織形態(tài)的影響Fig.2 Effects of TBHQ on the morphology of chick embryo lungs damage induced by PM2.5

2.2.3 TBHQ對(duì)PM2.5處理雞胚肺組織氧化應(yīng)激參數(shù)的影響 如圖3所示，與對(duì)照組相比，各組的雞胚肺組織中MDA濃度，T-AOC水平以及T-SOD活性均無(wú)顯著性變化。然而，PM2.5和TBHQ共處理組與PM2.5組相比，MDA濃度具有下降趨勢(shì)。

圖3 TBHQ對(duì)PM2.5處理雞胚肺組織氧化應(yīng)激參數(shù)的影響Fig.3 Effects of TBHQ on oxidative stress parameters of lung tissue after PM2.5-induced lung injury in chick embryos

2.2.4 TBHQ對(duì)PM2.5處理雞胚肺組織細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因表達(dá)的影響 由表 4可知，與PM2.5組相比，PM2.5和TBHQ共處理組的IL-18、IL-1β、RIPK1、MLKL表達(dá)顯著下降，而RIPK3表達(dá)顯著上升，NLRP3表達(dá)水平無(wú)明顯變化，各組的Caspase-1表達(dá)水平與對(duì)照組相比均顯著上調(diào)。

表4 TBHQ對(duì)PM2.5處理雞胚肺組織細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 4 Effects of TBHQ on the expression of pyroptosis and necroptosis related genes in lung tissues after PM2.5- induced lung injury in chick embryos

3 討論

3.1 雞舍PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)

外部刺激對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，可導(dǎo)致機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡。在本研究中，PM2.5雖對(duì)雞胚存活率無(wú)影響，但對(duì)雞胚肺組織造成了不同程度的炎癥損傷，出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肺水腫現(xiàn)象。相似地，大氣顆粒物、香煙煙霧顆粒物、汽車尾氣顆粒物等會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸系統(tǒng)淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞聚集和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[14-16]。原因可能是顆粒物的刺激激活了相關(guān)的炎癥因子和一系列相關(guān)的編碼轉(zhuǎn)錄因子[17-18]。

3.2 TBHQ對(duì)PM2.5誘導(dǎo)雞胚肺損傷的緩解作用

細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死是基因編碼的兩種細(xì)胞死亡方式，可保護(hù)宿主免受微生物病原體的危害，參與多種肺部疾病的發(fā)生與發(fā)展，并伴隨炎癥因子的釋放[19-20]。在本試驗(yàn)中，PM2.5上調(diào)了雞胚肺組織中細(xì)胞焦亡（NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18）和細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因（RIPK1、RIPK3、MLKL）的表達(dá)，說(shuō)明 PM2.5可通過(guò)細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死兩條途徑導(dǎo)致雞肺炎癥損傷。TBHQ具有高效抗氧化性，但其濃度較高時(shí)可能具有一定的致毒作用[21-22]。在本試驗(yàn)中，TBHQ誘導(dǎo)Caspase-1和RIPK3基因上調(diào)，而且，與PM2.5單獨(dú)暴露相比，PM2.5和TBHQ共同處理顯著上調(diào)雞胚肺組織中Caspase-1和RIPK3表達(dá)。這可能是因?yàn)門(mén)BHQ能夠誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，形成細(xì)胞質(zhì)空泡，線粒體釋放細(xì)胞色素 c，激活 Caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死相關(guān)基因RIPK3表達(dá)水平上升[23]。相反，TBHQ可顯著降低 PM2.5誘導(dǎo)的雞胚肺組織中IL-1β、IL-18、RIPK1、MLKL的表達(dá)，且對(duì) PM2.5誘導(dǎo)的肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象具有一定的緩解作用，但TBHQ無(wú)法完全治愈肺組織中炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象，可能和選擇的TBHQ濃度相關(guān)，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。這些結(jié)果說(shuō)明TBHQ能夠通過(guò)抑制PM2.5誘導(dǎo)的雞胚肺組織細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生減緩炎癥反應(yīng)，保護(hù)雞肺組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

MDA是氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，反映機(jī)體氧化損傷程度。在氧化應(yīng)激過(guò)程中，機(jī)體遭受刺激產(chǎn)生ROS或活性氮自由基，氧化與抗氧化失衡，引起多種反應(yīng)[24-25]。ROS可損壞脂質(zhì)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化[26-27]，產(chǎn)生大量MDA，參與多種方式的細(xì)胞死亡。最近研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭可通過(guò) ROS-NLRP3通路介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，誘導(dǎo)小鼠肝毒性[28]。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，線粒體ROS促進(jìn)RIPK1的自磷酸化，誘導(dǎo)RIPK3招募到壞死體，發(fā)生細(xì)胞程序性壞死[29]。在本試驗(yàn)中，TBHQ降低了PM2.5誘導(dǎo)的雞胚肺組織中MDA濃度，推測(cè)這可能是由于TBHQ可特異性激活Nrf2，引起下游抗氧化酶的合成與釋放，清除ROS，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[30]，降低 MDA濃度，從而減少細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。因此，推測(cè) ROS介導(dǎo)了雞舍PM2.5引起的雞胚肺組織細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死，而TBHQ能夠通過(guò)清除ROS緩解雞舍PM2.5誘導(dǎo)的雞胚肺損傷。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功建立了雞舍 PM2.5誘導(dǎo)的雞胚肺損傷模型，并利用該模型研究發(fā)現(xiàn)，TBHQ能夠通過(guò)抗氧化途徑降低雞胚肺組織細(xì)胞焦亡和細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，緩解由雞舍 PM2.5引起的雞胚肺組織炎癥損傷。