初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵的影響

鄧星成，黃治國，2，姚亞林，江 科，鄧 杰，2，任志強，2

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.四川水井坊股份有限公司，四川 成都 610036）

中國白酒釀造是一種傳統(tǒng)的、古老的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，其多樣的釀造原料，多菌復合的酒曲做糖化發(fā)酵劑、開放式固態(tài)發(fā)酵工藝造就了其獨特的酒體風格[1-2]。白酒發(fā)酵過程中，微生物會代謝產(chǎn)生大量有機酸類物質(zhì)[3]。這些酸類物質(zhì)一方面增加酒醅中的酸度，可以一定程度上抑制雜菌生長[4]；另一方面有機酸是白酒中重要的呈味物質(zhì)，適量的有機酸使酒體豐滿協(xié)調(diào)，其中乳酸、乙酸等也是重要的風味前體物質(zhì)[5-6]。

乳酸是一種普遍存在的代謝物，也是一種生長抑制劑，經(jīng)常出現(xiàn)在發(fā)酵食品和飲料的發(fā)酵過程中[7]。乳酸的非解離形式具有親脂性，因此乳酸可以通過簡單擴散透過細胞膜，流入細胞質(zhì)[8]。在近中性的細胞質(zhì)中，乳酸解離，釋放氫離子和乳酸根離子。因為這些離子帶有電荷，它們不能通過疏水的細胞膜脂質(zhì)雙層。這些離子在細胞內(nèi)積累，導致細胞內(nèi)pH的變化，嘌呤堿基的完整性受到影響，導致細胞內(nèi)關(guān)鍵酶的變性，從而抑制了中國白酒發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)生[9]。白酒發(fā)酵過程中有機酸含量具有一定的差異，研究表明，在貴州省醬香型白酒酒醅中檢測出乳酸含量最高可達（36.20±6.2）g/kg[10]，同時王雪山[11]通過超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中，清香型酒醅中有機酸含量最高的也是乳酸（50.24～297.84 mg/kg酒醅），其次是蘋果酸、乙酸等，因此選用乳酸能較好模擬白酒發(fā)酵過程中的酸環(huán)境。

在白酒實際生產(chǎn)中多以配糟的方式控酸，初始酸度的范圍也主要是根據(jù)長期的經(jīng)驗而得，然而酸度對發(fā)酵過程的影響往往是從發(fā)酵菌群演替和代謝及酶活等各個角度去作用的，目前并沒有一個系統(tǒng)的科學闡述。有研究表明酸度推動著白酒發(fā)酵過程中微生物群落的演替[12]，不同的pH環(huán)境條件下，由于各種菌群的復雜代謝以及相互作用，使得微生物體內(nèi)的生理代謝發(fā)生變化以適應(yīng)環(huán)境的生態(tài)因子的改變，其結(jié)果表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物的組成和含量變化[13]。同時釀酒酵母是白酒發(fā)酵產(chǎn)酒階段的主體微生物，在將糖轉(zhuǎn)化成乙醇的過程中會面對各種脅迫和環(huán)境的變化，酵母也會對各種變化做出應(yīng)答[14]。因此為揭示發(fā)酵過程中酸度對釀酒酵母發(fā)酵狀況的影響，本研究以高粱糖化液模擬發(fā)酵環(huán)境，添加乳酸設(shè)置不同初始酸度，排除糟醅原料和其他微生物影響，考察了不同初始酸度條件下釀酒酵母的生長代謝情況，以期說明白酒發(fā)酵過程中初始酸度對發(fā)酵產(chǎn)酒的影響，為探究白酒生產(chǎn)的可控式發(fā)酵提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳高粱：市售；乳酸香精（食品級）：河南燕康公司；糖化酶（50 000 U/g）：江蘇博立生物制品有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。

麥芽汁瓊脂（malt extract agar，MEA）培養(yǎng)基：蛋白胨4.0 g，葡萄糖10.0 g，酵母浸粉3.0 g，麥芽粉10.0 g，瓊脂粉13.0 g，加水至1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至50 ℃，加入0.1 g氯霉素倒平板備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Auper Alcomat高精度數(shù)顯酒精濃度計：優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；1000A多功能粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司；發(fā)酵栓、UV-1200紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；YQ-PJ-8B型自動糖化器：輕工業(yè)部西安輕機所光電公司；7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱糖化液制備

取100 g粳高粱，粉碎至200目，加入200 mL沸水，攪拌均勻，置于100 ℃水浴鍋中攪拌糊化2 h。取出后晾冷至30 ℃左右，加入糖化酶干粉，添加量以糖化酶活力300 U/g糧食干質(zhì)量計，放于30 ℃恒溫糖化24 h。糖化完成后用四層紗布過濾，得到濾液，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。冷卻至常溫后，添加乳酸到糖化液中，使高粱糖化液酸度分別為0（未調(diào)）、5 mmol/100 g、10 mmol/100 g、15 mmol/100 g、20 mmol/100 g、25 mmol/100 g、30 mmol/100 g。

1.3.2 不同初始酸度下釀酒酵母生長情況的測定

從活性干酵母中獲得的酵母菌株在MEA培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600nm值為1.2左右），離心（6 000 r/min、5 min），收集細胞，以磷酸緩沖液（100 mmol/L，pH 6.0）清洗兩次，然后重懸于不同初始酸度（0、5 mmol/100 g、10 mmol/100 g、15 mmol/100 g、20 mmol/100 g、25 mmol/100 g、30 mmol/100 g）的MEA培養(yǎng)基中，接種量為1%，置于28 ℃、150 r/min有氧培養(yǎng)48 h。每3 h測定樣品的OD600nm值，到24 h后再每6 h測定。以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 不同初始酸度下釀酒酵母發(fā)酵質(zhì)量損失的測定

分裝100 mL高粱糖化液于發(fā)酵栓，接種1%的酵母菌培養(yǎng)液，振蕩均勻，密封，靜置培養(yǎng)，每隔12 h稱質(zhì)量一次，直到發(fā)酵結(jié)束，測定CO2質(zhì)量損失。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物的測定

發(fā)酵結(jié)束（CO2質(zhì)量損失恒定）后，取發(fā)酵液通過固相微萃取結(jié)合GC-MS法測定發(fā)酵產(chǎn)物。固相微萃取條件：取5 mL發(fā)酵液于頂空瓶中，加入1.5 g NaCl，20 μL 2-辛醇（內(nèi)標，0.45 g/L），70 ℃預熱10 min，萃取30 min，解吸10 min。

氣相色譜條件：J&W 122-7062毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；手動進樣，不分流；進樣口溫度230 ℃；程序升溫為初始溫度50 ℃，維持2 min，然后以6 ℃/min升溫至120 ℃，維持4 min，再以15 ℃/min升溫至230 ℃，維持4 min；載氣為高純氦氣（He），流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，全掃描，質(zhì)量掃描范圍為35～350 amu。

定性、定量：將色譜峰質(zhì)譜結(jié)果與美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）2017譜庫中數(shù)據(jù)比對，與譜庫中某化合物匹配度達到700以上時，認為該峰代表此化學物質(zhì)，實現(xiàn)定性。根據(jù)2-辛醇（內(nèi)標）的峰面積和濃度可實現(xiàn)半定量。

1.3.5 酒精度的測定

取對數(shù)期的釀酒酵母，以1%的接種量接種到200 mL高粱糖化液中，靜置密封，發(fā)酵直至質(zhì)量損失不變。將全部發(fā)酵液用于蒸餾得100 mL餾出液，平衡至20 ℃，采用酒精濃度計測定酒精度。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析，采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始酸度對釀酒酵母生物量的影響

釀酒酵母是生產(chǎn)酒精的主要微生物，同時白酒生產(chǎn)的發(fā)酵環(huán)境中存在著多種影響因素，如溫度、水分、氧氣、pH等[15-16]，隨白酒釀造發(fā)酵生酸，釀酒酵母不可避免的受到弱有機酸引起的低pH脅迫，并對其生長代謝產(chǎn)生影響[14]。本試驗研究了不同初始酸度對釀酒酵母生長的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同初始酸度對釀酒酵母生長的影響Fig.1 Effect of different initial acidity on the growth of Saccharomyces cerevisiae

由圖1可知，對照組（0）在培養(yǎng)3h時進入對數(shù)期，15h進入對數(shù)中期，24 h進入穩(wěn)定期；在初始酸度為5～15 mmol/100 g培養(yǎng)條件下釀酒酵母于30 h進入穩(wěn)定期，相比于對照組，穩(wěn)定期滯后6 h，且在該酸度范圍內(nèi)，釀酒酵母生長變化趨勢大致相同，最終細胞生長量基本一致；初始酸度在20 mmol/100 g、25 mmol/100 g和30 mmol/100 g時延滯期明顯延后，且最終細胞生長量顯著低于對照組（P＜0.05）。DENG N等[7]研究發(fā)現(xiàn)，白酒發(fā)酵中乳酸脅迫對畢赤酵母和釀酒酵母的生長均具有顯著影響，與本研究結(jié)果相符。綜上，初始酸度對釀酒酵母的生長有影響，隨初始酸度的增加，釀酒酵母生長所受抑制作用逐漸增強。

2.2 初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵質(zhì)量損失的影響

釀酒酵母通過發(fā)酵糖類生成乙醇，然而一定酸度條件下會抑制釀酒酵母的發(fā)酵，從而影響乙醇的生成。以釀酒酵母發(fā)酵的累計質(zhì)量損失來表征其發(fā)酵情況，不同初始酸度條件下發(fā)酵的質(zhì)量損失結(jié)果見圖2。由圖2可知，在發(fā)酵前12 h，質(zhì)量損失較小，在12～48 h內(nèi)變化明顯，當釀酒酵母處于較低初始酸度（5～15 mmol/100 g）時，樣品質(zhì)量損失變化比對照組略快，即代謝活動更強烈，但累計質(zhì)量損失均在48 h時達到最大；處于較高初始酸度（25～30 mmol/100 g）時，樣品質(zhì)量損失變化較對照組更緩慢，且初始酸度達到30 mmol/100 g時，酵母的生命活動明顯被抑制。說明較低的初始酸度（0～15 mmol/100 g）對酵母糖代謝有一定促進作用，在較高初始酸度下酵母生命活動受到抑制，發(fā)酵強度明顯降低。最終酵母質(zhì)量損失累計量降低，但仍有質(zhì)量損失積累，猜測可能是在高酸度下釀酒酵母可能產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)以增強自身耐受性，如細胞質(zhì)酸化，細胞質(zhì)膜H+-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine 5'-triphosphate，ATP）酶活性增強[17]，以保證酵母細胞的存活率，推測酵母代謝產(chǎn)物變化也會符合上述規(guī)律。

圖2 不同初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵質(zhì)量損失的影響Fig.2 Effect of different initial acidity on the mass loss of Saccharomyces cerevisiae fermentation

2.3 初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)風味物質(zhì)的影響

對釀酒酵母的發(fā)酵液進行揮發(fā)性風味物質(zhì)的定性檢測，檢測結(jié)果見表1。由表1可知，隨初始酸度的增加，發(fā)酵液中檢測到的酯和醇的種類數(shù)量先增后減，在初始酸度為15 mmol/100 g時風味物質(zhì)種類、酯類、醇類數(shù)量最多，表明低酸（0～15 mmol/100 g）環(huán)境可能會促進風味物質(zhì)的生成。這可能是因為在酸性環(huán)境中，酵母的生理形態(tài)有一定變化，胞內(nèi)代謝物質(zhì)也會發(fā)生改變。尚磊[18]也對不同pH（3、5）條件下進行代謝的酵母胞內(nèi)物質(zhì)進行提取，發(fā)現(xiàn)低pH條件下生成的醇和酯的相對含量更高，加速了糖代謝，糖類物質(zhì)減少。

表1 不同初始酸度下酵母發(fā)酵產(chǎn)物風味物質(zhì)種類數(shù)量Table 1 Number of flavor substance types in yeast fermentation products under different initial acidity

乙醇是釀酒酵母發(fā)酵的主要產(chǎn)物，也是白酒產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎(chǔ)。不同初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力的影響見圖3。由圖3可知，隨初始酸度增加，發(fā)酵液的酒精度呈先升后降的變化趨勢，低初始酸度（0～10 mmol/100 g）發(fā)酵時的酒精度顯著高于對照組，當初始酸度為5 mmol/100 g時達到最高，且與其他試驗組呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。而初始酸度在（15～30）mmol/100 g條件下，釀酒酵母酒精度顯著低于對照組（P＜0.05），表明初始酸度影響著釀酒酵母的乙醇代謝，較高的初始酸度會抑制釀酒酵母的乙醇生成，調(diào)節(jié)適宜的初始酸度可能會促進白酒發(fā)酵產(chǎn)酒。劉興艷等[14]以不同pH條件通過模擬合成培養(yǎng)基發(fā)酵體系中培養(yǎng)三株釀酒酵母，發(fā)現(xiàn)在低pH和高pH的乙醇得率具有顯著差異，與本研究結(jié)果相符合。

圖3 不同初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵液酒精度的影響Fig.3 Effects of different initial acidity on alcohol content of fermentation broth of Saccharomyces cerevisiae

2.4 不同初始酸度對發(fā)酵結(jié)束時釀酒酵母關(guān)鍵風味成分的影響

風味物質(zhì)是影響白酒質(zhì)量的重要因素之一，根據(jù)相關(guān)文獻[5，19-20]報道，選取乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇作為釀酒酵母發(fā)酵液風味成分的關(guān)鍵指標，研究了初始酸度對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)主要香氣成分的影響，結(jié)果見圖4。

乙酸乙酯具有果香風味特征，其主要是由釀酒酵母產(chǎn)生的醇乙?；D(zhuǎn)移酶和乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，Ac-CoA）共同催化合成的，對白酒風味的組成也有著重大影響，因此產(chǎn)乙酸酯的釀酒酵母選育也很重要[21-22]。由圖4A可知，隨著發(fā)酵初始酸度的增加，乙酸乙酯含量呈先升后降的變化趨勢，在初始酸度為20 mmol/100 g培養(yǎng)條件下累積生成量達到最高為（4.49±0.04）mg/L，顯著高于其他初始酸度條件（P＜0.05）。

乙酸苯乙酯呈花香、蜂蜜味，作為乙酸酯類風味物質(zhì)，與乙酸乙酯合成機制相似。由圖4B可知，發(fā)酵結(jié)束時，其含量隨酸度增加整體呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢，當初始酸度為25～30 mmol/100 g時檢測不到乙酸苯乙酯。

乳酸乙酯呈水果香，是白酒中酯類最基礎(chǔ)的重要化合物，也是清香型白酒的基本骨架。由圖4C可知，乳酸乙酯含量隨初始酸度增加，呈先升后降的趨勢，在5 mmol/100 g的初始酸度培養(yǎng)條件下含量達到最高（17.69±1.73）mg/L，顯著高于其他初始酸度時的含量（P＜0.05）。

異丁醇、異戊醇這些醇類是白酒重要的呈香物質(zhì)，對于賦予白酒醇甜風味及酒體醇厚感具有重要作用[23]。由圖4D及4E可知，發(fā)酵結(jié)束時異丁醇、異戊醇的含量變化趨勢大致相同，隨初始酸度增加呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的變化趨勢，在5 mmol/100 g初始酸度培養(yǎng)條件下含量達到最高分別為（4.72±0.29）mg/L、（48.49±12.7）mg/L。但也有研究表明，異丁醇、異戊醇也是高級醇的主要成分，占高級醇的40%～70%[24]，如果含量過高會使人產(chǎn)生頭痛、頭暈等癥狀[19]。

圖4 不同初始酸度對發(fā)酵末期釀酒酵母關(guān)鍵風味物質(zhì)生成的影響Fig.4 Effects of different initial acidity on the formation of key flavor substances in Saccharomyces cerevisiae at the end of fermentation

β-苯乙醇是一種芳香族化合物，具有玫瑰花香，同時也是米香型的典型風味，是釀酒酵母合成的主要高級醇類物質(zhì)[25]，發(fā)酵過程中苯乙醇主要由釀酒酵母通過莽草酸途徑或埃爾利希途徑從頭合成[26]。由圖4F可知，β-苯乙醇含量整體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在5 mmol/100 g的初始酸度培養(yǎng)條件下含量達到最高為（101.99±5.00）mg/L，顯著高于其他初始酸度（P＜0.05），釀酒酵母的β-苯乙醇合成在較高的初始酸度（10～30 mmol/100 g）培養(yǎng)條件下被抑制。

綜上，初始酸度對發(fā)酵末期關(guān)鍵風味物質(zhì)生成的影響具有一定差異，其中乳酸乙酯、苯乙醇、異丁醇和異戊醇含量隨酸度增加呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，在酸度為5 mmol/100 g時達到最高，在較高酸度時（20 mmol/100 g）更有利于乙酸乙酯的生成，乙酸苯乙酯的生成隨酸度增加逐漸被抑制。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，初始酸度對釀酒酵母的生長代謝和乙醇生成存在影響，初始酸度的增加抑制了釀酒酵母的生長，低初始酸度（0～15 mmol/100 g）環(huán)境更利于酵母發(fā)酵產(chǎn)物的生成，此時釀酒酵母發(fā)酵力更強，加快了CO2釋放和糖代謝速率，較高的初始酸度（15～30 mmol/100 g）會抑制釀酒酵母乙醇的生成；在初始酸度為15 mmol/100 g時的總揮發(fā)性物質(zhì)種類、酯類、醇類最多。初始酸度對發(fā)酵末期關(guān)鍵風味物質(zhì)生成的影響具有一定差異，其中乳酸乙酯、苯乙醇、異丁醇和異戊醇含量隨酸度增加呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，在酸度為5 mmol/100 g時達到最高，在較高酸度（20 mmol/100 g）時更有利于乙酸乙酯的生成，乙酸苯乙酯的生成隨初始酸度增加逐漸被抑制。綜上，控制初始酸度為15 mmol/100 g左右發(fā)酵效果較好。研究結(jié)果為白酒發(fā)酵中初始酸度范圍的控制提供了理論依據(jù)，為解析酸度對白酒發(fā)酵產(chǎn)酒的影響機制做了初步研究，未來針對釀酒酵母的關(guān)鍵風味的代謝機理和調(diào)控還有待進一步探索。