硫苷介導的白菜抵御甜菜夜蛾幼蟲取食脅迫的分子機制

郝嬌嬌，馬永華，陸彥池，許麗愛，朱祝軍，郁有健

（浙江農(nóng)林大學 園藝科學學院 浙江省山區(qū)農(nóng)業(yè)高效綠色協(xié)同生產(chǎn)創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 311300）

白菜Brassica campestrisssp.chinensis是十字花科Brassicaceae蕓薹屬Brassica2年生草本植物，因成熟周期短、適應力強、營養(yǎng)價值高等特點，在中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[1]。硫代葡萄糖苷簡稱硫苷，是十字花科植物中的一類含硫、氮次生代謝產(chǎn)物，基于衍生氨基酸的差異可分為脂肪族、吲哚族和芳香族三大類[2?3]。硫苷的生物合成可分為側鏈延伸、核心結構形成和側鏈修飾等3步，涉及大量的基因、酶和轉錄調(diào)節(jié)因子[4]。已有研究表明：硫苷不僅在抗癌[5]、十字花科植物特殊風味的產(chǎn)生[6?7]及硫元素的調(diào)節(jié)[8]中發(fā)揮著重要的作用，而且是十字花科植物抵御生物脅迫的主要防御物質(zhì)[9?10]。研究表明：硫苷可以有效影響害蟲的生長發(fā)育及產(chǎn)卵[11]，但不同類型的硫苷對不同種群植食性昆蟲抗性不同[12?13]。如甘藍夜蛾Mamestra brassicae幼蟲在取食脂肪族和吲哚族硫苷含量較高的植物后生長緩慢，取食吲哚族硫苷含量較高的植物后發(fā)育時間也會延長[14]。作為一種防御相關植物次生代謝產(chǎn)物，硫苷存在于植物的整個生命周期中[15?16]，植食性昆蟲的取食會使其含量顯著提高[17?18]，硫苷含量的改變被證明與害蟲脅迫下硫苷的合成、轉運及降解相關基因的激活相關[19]。MEWIS等[20]發(fā)現(xiàn)擬南芥Arabidopsis thaliana受桃蚜Myzus persicae、甘藍蚜Brevicoryne brassicae和甜菜夜蛾Spodoptera exigu幼蟲取食后，脂肪族硫苷含量顯著增加，AtMAM1和AtCYP79F1基因轉錄水平也顯著上調(diào)。此前，KOORNNEEF等[21]發(fā)現(xiàn)特定硫苷生物合成基因的存在或缺失可以賦予某些植物特殊的抗性，如擬南芥Ler生態(tài)型AtMAM2的存在，使得其對甜菜夜蛾幼蟲的抗性高于缺乏AtMAM2的擬南芥Col生態(tài)型。同樣，蚜蟲侵襲會使擬南芥吲哚族硫苷含量增加3倍[22]，PFALZ等[23]通過數(shù)量性狀基因位點(QTL)定位結合轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)吲哚族硫苷合成相關基因AtCYP81F2的表達有助于擬南芥抵抗桃蚜，但不能抵御小菜蛾Plutella xylostella、歐洲粉蝶Pieris brassicae、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、甜菜夜蛾等鱗翅目Lepidopteran害蟲。在進化過程中，昆蟲為應對植物硫苷-黑介子酶防御系統(tǒng)的防御作用，也形成了以解毒酶——細胞色素P450s和谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)等為基礎的適應性機制[24?25]。

本研究以白菜為研究對象，通過高效液相色譜法(HPLC)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)，探究白菜硫苷質(zhì)量摩爾濃度及組分在甜菜夜蛾幼蟲取食脅迫下的變化與潛在的分子調(diào)控機制，并通過檢測取食前后甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的變化，探究白菜硫苷質(zhì)量摩爾濃度的提高對幼蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響，以期為白菜等十字花科作物應對害蟲脅迫抗性的提高、品質(zhì)和產(chǎn)量的改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用白菜品種為‘美都黑油筒’B.campestrisssp.chinensis‘Meiduheiyoutong’，培養(yǎng)條件為光照(28 ℃/14 h，30 000 lx)與黑暗(26 ℃/10 h)循環(huán)。挑選長勢一致的“八葉一心”時期白菜的第5、6片真葉進行接蟲處理。研究所用甜菜夜蛾3齡幼蟲由浙江農(nóng)林大學植物保護課題組提供，接蟲前將甜菜夜蛾3齡幼蟲饑餓處理4 h，每片葉接蟲1頭。

1.2 取樣方法

剪取白菜葉片，去除大葉脈，于液氮中冷凍后放入?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?接蟲葉片在取樣前用酒精棉將接蟲葉片上的排泄物擦拭干凈)。將取食后1、24、48和72 h的甜菜夜蛾幼蟲放置在冰上凍僵，用解剖針取其中腸，保存在?20 ℃冰箱中備用。

1.3 硫苷的提取及 HPLC 檢測

參考KRUMBEIN等[26]經(jīng)過ZHU等[27]修改的方法提取硫苷。稱0.25 g樣品粉末，加入75 ℃預熱的體積分數(shù)為70%甲醇溶液4 mL，同時加入200 μL 5 mmol·L?1的2-丙烯基硫苷作為內(nèi)標，混勻后放在75 ℃水浴鍋中水浴10 min，間隔震蕩；6 000 r·min?1離心10 min收集上清液，剩余沉淀則繼續(xù)加入2次3 mL 75 ℃預熱的體積分數(shù)為70%的甲醇提取、渦旋、離心，將3次收集的上清液合并倒入10 mL容量瓶中定容；濾紙進行粗過濾，取5 mL過濾液裝載到DEAE Sephadex A25固相萃取柱，待濾液全部流完后，加6 mL純凈水清洗柱子，再加入250 μL硫酸酯酶，30 ℃反應12 h，5 mL純凈水洗脫，洗脫液用0.45 mm濾膜過濾后在?20 ℃下保存。HPLC分析進樣量20 μL，C-18反相柱柱溫30 ℃，流動相為超純水和乙腈，1 mL·min?1，0～45 min內(nèi)乙腈質(zhì)量濃度線性梯度0%～20%，檢測波長為229 nm。

1.4 硫苷合成相關基因的定量分析

1.4.1 總RNA的提取及cDNA的獲得 采用Trizol法提取白菜總RNA，提取過程中防止RNase污染。具體步驟為：取0.2 g植物組織材料快速研磨至粉末狀，迅速將其移入裝有1 mL預冷Trizol的離心管中，間隔震蕩。4 ℃ 12 000 r·min?1離心10 min，取1 mL上清液，加入200 μL預冷氯仿，振蕩混勻，冰上靜置 3 min；4 ℃ 12 000 r·min?1離心 10 min，取 500 μL 上清液，加入 100 μL 預冷氯仿，振蕩混勻，冰上靜置3 min；4 ℃ 12 000 r·min?1離心10 min，取400 μL上清液至新的離心管，加入等體積預冷的異丙醇，顛倒混勻，?20 ℃冰箱中靜置30 min。4 ℃ 12 000 r·min?1離心10 min，棄上清液，加入1 mL預冷的體積分數(shù)為75%乙醇；4 ℃ 13 000 r·min?1離心5 min，棄上清液，加入20 μL 預冷的體積分數(shù)為0.1%的無核酸酶水溶解沉淀，?20 ℃保存?zhèn)溆?。用NanoDrop 2000檢測RNA樣品的濃度后，用質(zhì)量濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的質(zhì)量。cDNA第1鏈的合成參照Takara公司的反轉錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)的說明書進行。

1.4.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)分析 以反轉錄獲得的cDNA為模板，引物由Primer 5軟件設計，以白菜BcUBC10基因[28]作為內(nèi)參，基因的定量引物見表1。熒光定量PCR擴增體系為：2×SYBR Premix Ex-TaqTM10 μL，10 ng·μL?1cDNA 1 μL，上下游引物各 0.3 μL，無核酸酶雙蒸水 (RNase free ddH2O) 補足至15 μL。反應循環(huán)條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復性34 s，共40個循環(huán)，每份3次重復。用 2???Ct法計算其相對表達量[29]，瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物。

表1 實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)表達分析引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR analysis

1.5 GSTs 活性測定

根據(jù)GSTs試劑盒說明書（南京建成生物有限公司）進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2020進行數(shù)據(jù)整理與分析，所有數(shù)據(jù)均是至少3次生物學重復的平均值±標準誤；采用SPSS 22.0進行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 甜菜夜蛾幼蟲取食對白菜硫苷質(zhì)量摩爾濃度的影響

在白菜中共檢測到8種硫苷組分(表2)，其中：脂肪族3種、吲哚族4種、芳香族1種。如表3所示：甜菜夜蛾幼蟲取食不同時間點(1、24、48、72 h)白菜硫苷質(zhì)量摩爾濃度呈顯著增加趨勢(P＜0.05)，取食1和48 h時增幅最大，72 h達峰值(2.03 μmol·g?1)，是對照的1.8倍；吲哚族和脂肪族硫苷占總硫苷比例最高。甜菜夜蛾幼蟲取食后兩者顯著增加(P＜0.05)，并分別在取食48和72 h時達到峰值，是對照的1.6和2.4倍；取食1和24 h時芳香族硫苷質(zhì)量摩爾濃度也呈顯著(P＜0.05)上升趨勢。這一結果表明甜菜夜蛾幼蟲的取食能夠誘導白菜硫苷的合成，其中吲哚族硫苷變化最為劇烈，說明吲哚族硫苷可能在抵御鱗翅目昆蟲甜菜夜蛾幼蟲取食過程中發(fā)揮重要的作用。3-吲哚基甲基硫苷(GBC)和1-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷(NEO)在甜菜夜蛾幼蟲取食后不斷增加，在取食72 h時達峰值，分別是對照的4.7和4.9倍；而4-戊稀基硫苷(GBN)、4-羥基吲哚-3-甲基硫苷(4OH)、2-羥基-3-丁烯基硫苷(PRO)和4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷(4ME)則呈先增后減趨勢，其中GBN對甜菜夜蛾幼蟲取食的響應最為強烈，48 h達峰值，是對照的1.9倍；3-丁烯基硫苷(GNA)和2-苯乙基硫苷(NAS)變化不明顯，僅在初始時間點有所增加。

表2 白菜硫苷組分Table 2 Components of glucosinolate in B.campestris ssp. chinensis

表3 甜菜夜蛾幼蟲取食對白菜硫苷質(zhì)量摩爾濃度的影響Table 3 Effects of feeding on the content of glucosinolate in B.campestris ssp. chinensis by S.exigua larvae

2.2 甜菜夜蛾幼蟲取食對白菜硫苷合成相關基因表達的影響

通過RT-qPCR對甜菜夜蛾幼蟲取食后白菜硫苷合成相關基因表達情況進行分析。結果(圖1)表明：甜菜夜蛾幼蟲取食后，脂肪族硫苷合成相關基因BcBCAT4、BcMAM1、BcCYP83A1、BcMYB28、BcSUR1的表達量表現(xiàn)出相同的規(guī)律，即取食1 h其表達量顯著上調(diào)(P＜0.05)，48 h基因表達水平達到最高，而白菜吲哚族硫苷合成相關基因BcCYP83B1表現(xiàn)出相反的變化趨勢；脂肪族硫苷合成相關基因BcAOP2和吲哚族硫苷合成相關基因BcSOT16隨取食時間的延長表達量逐漸增加，72 h達最高，分別是對照的4.2和3.7倍。此外，硫苷合成過程中的直接硫供體谷胱甘肽(GSH)合成相關基因BcAPK2轉錄水平呈顯著增加趨勢，72 h時比對照增加了4.7倍。

圖 1 甜菜夜蛾幼蟲取食對白菜硫苷代謝關鍵基因表達模式的影響Figure 1 Effects of S.exigua larvae feeding on expression patterns of key genes related to glucosinolates metabolism in B.campestris ssp.chinensis

2.3 甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi) GSTs 活性的變化

由圖2表明：甜菜夜蛾幼蟲取食后，幼蟲體內(nèi)GSTs活性產(chǎn)生顯著變化，取食1 h時酶活性增強不顯著(P＞0.05)，但在隨后的時間點酶活性顯著增強(P＜0.05)，24 h增幅最為劇烈，72 h達峰值，為63.6 μmol·mg?1·min?1，比對照升高了1.5倍?？梢姡撞肆蜍召|(zhì)量摩爾濃度的增加誘導了甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)解毒酶GSTs活性的提高。

圖 2 取食白菜后甜菜夜蛾幼蟲GSTs活性的變化Figure 2 Changes of GSTs activity in S.exigua larve after feeding on B.campestris ssp.chinensis

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)：不同擬南芥群體硫苷的種類和含量有所差異，而這種差異影響著擬南芥對不同種群植食性昆蟲的抗性[30?33]，如甘藍夜蛾和菜青蟲Pieris rapae在取食脂肪族和吲哚族硫苷含量較高的植株時，生長緩慢，取食吲哚族硫苷含量較高的植株時，發(fā)育時間也會增加[34]。隨后，在研究擬南芥脂肪族硫苷的抗蟲機制中，發(fā)現(xiàn)GS-Elong、GS-AOP、TGGs等位點與脂肪族硫苷的抗蟲性相關[35?38]。SONTOWSKI等[19]發(fā)現(xiàn)：擬南芥被甜菜夜蛾幼蟲取食后，GS-Elong位點硫苷合成相關基因AtMAM1、AtMAM2、AtMAM3轉錄水平顯著增加，同時相關脂肪族硫苷含量也顯著上升，說明脂肪族硫苷參與了擬南芥對甜菜夜蛾幼蟲的防御反應。本研究發(fā)現(xiàn)：白菜被甜菜夜蛾幼蟲取食后，脂肪族硫苷GS-Elong位點相關基因BcBCAT4、BcMAM1顯著上調(diào)，脂肪族硫苷的合成也顯著增加，GBN的響應尤為強烈，說明脂肪族硫苷尤其是GBN參與了白菜對甜菜夜蛾幼蟲的防御反應。然而，BcBCAT4、BcMAM1的表達水平與相應脂肪族硫苷的質(zhì)量摩爾濃度存在一定差異，說明除了硫苷生物合成基因的直接影響外，可能還涉及其他機制來參與十字花科蕓薹屬作物次級代謝產(chǎn)物硫苷的生物合成和積累。此外，吲哚族的4OH、NEO、GBC在甜菜夜蛾幼蟲取食過程中顯著增加，說明吲哚族硫苷可能在白菜抵御甜菜夜蛾幼蟲取食過程中發(fā)揮著重要的作用。KUMAR等[39]在研究害蟲的質(zhì)量與芥菜Brassica juncea中硫苷各組分的關系時，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲Helicoverpa armigera幼蟲的增重與芥菜中GNA和GBN的含量呈負相關，而斜紋夜蛾Spodoptera litura幼蟲的增重與GNA、GBN和黑介子硫苷酸鉀(SIN)的含量呈負相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)硫苷介導的芥菜對棉鈴蟲和斜紋夜蛾的抗性差異與BjuMYB28同源物在芥菜葉片中的差異表達相關。本研究中，甜菜夜蛾幼蟲取食脅迫下，白菜4OH、NEO、GBC的增加與幼蟲體內(nèi)解毒酶GSTs活性及白菜硫苷合成相關基因BcSOT16呈正相關，說明BcSOT16活性的提高可能是甜菜夜蛾幼蟲取食下白菜吲哚族硫苷合成增加的原因，進而提高了白菜對甜菜夜蛾的抗性。需進一步驗證BcSOT16的生物學功能，以明確BcSOT16在白菜抵御甜菜夜蛾幼蟲取食脅迫過程中所起到的重要作用。

在長期進化過程中，為抵御植食性昆蟲的取食，植物形成了多種防御機制，如產(chǎn)生各種次級代謝物[40]。硫苷及其降解產(chǎn)物對昆蟲具有阻食、影響其生長發(fā)育及繁殖，甚至毒殺的作用[11]，然而，硫苷也能誘導昆蟲體內(nèi)細胞色素P450s和GSTs等主要解毒酶系基因的表達，增強昆蟲對硫苷等植物次生物質(zhì)的代謝能力[23?24,41]。如草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda幼蟲的細胞色素P450s活性可以被吲哚族硫苷降解產(chǎn)物吲哚-3-甲醇所誘導[42]；食用含硫苷、異硫氰酸酯的飼料或直接取食十字花科植物時，桃蚜體內(nèi)GSTs活性會被誘導增加[24]；與對照相比，取食含硫苷的桃蚜，食蚜蠅GSTs活性亦有所提高[43]。本研究中甜菜夜蛾幼蟲取食白菜后，其體內(nèi)GSTs活性不斷增強，與白菜中總硫苷及吲哚類硫苷質(zhì)量摩爾濃度增加趨勢的一致性，表明了硫苷對甜菜夜蛾幼蟲GSTs活性的誘導作用，也說明吲哚族硫苷可能在白菜抵御雜食性害蟲甜菜夜蛾幼蟲取食過程中發(fā)揮更為重要的作用。

4 結論

甜菜夜蛾幼蟲取食能上調(diào)白菜BcSOT16、BcBCAT4、BcMAM1等硫苷合成關鍵基因的表達，從而促進白菜硫苷質(zhì)量摩爾濃度的增加，提高白菜對甜菜夜蛾幼蟲取食脅迫的抗性，吲哚族的4OH、NEO、GBC和脂肪族的GBN的反應尤為強烈，但硫苷質(zhì)量摩爾濃度的升高又會誘導甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)GSTs活性的增強，提高甜菜夜蛾幼蟲對硫苷的解毒能力。