董譯滟,王 聰,任晨洋,文雪霞*,張 瑩*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院/東北畜禽疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽(yáng) 110866;2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司,北京 100070)

土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis,Ft)是一種可引起急性、熱性、高度接觸性人畜共患病病原。該病原于1911年在美國(guó)加利福尼亞州圖萊里縣首次分離,可感染包括哺乳動(dòng)物、原生動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥類及魚類在內(nèi)的至少300種動(dòng)物[1]。Ft是一種革蘭氏陰性需氧菌,具有多形性,無芽孢、鞭毛,營(yíng)胞內(nèi)寄生。Ft易于傳播、宿主范圍廣泛、感染劑量低、且能夠誘發(fā)致命疾病,這些特性使其成為潛在的生物戰(zhàn)病原體[2]。根據(jù)致病力與地理分布,Ft可分為4個(gè)亞種,即土拉亞種(F.tularensistularensis)、全北美區(qū)亞種(F.tularensisholarctica)、新殺手亞種(F.tularensisnovicida)和中亞亞種(F.tularensismediasiatica)[3]。土拉亞種(A型)致病性最強(qiáng),通過呼吸道或皮膚途徑感染10～50個(gè)細(xì)菌即可引起嚴(yán)重疾病。A型又可進(jìn)一步分為A1a、A1b和A2共3種亞型,在小鼠感染模型中,A1b亞型毒力最強(qiáng)[4]。目前,尚未發(fā)現(xiàn)該菌可分泌外毒素,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)也不具有內(nèi)毒素活性[5]。因此,毒素并非該菌的毒力因子。已有的研究表明,Ft毒力與其從吞噬小體中逃逸并在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的能力密切相關(guān),且受到許多因素如分子信號(hào)傳導(dǎo),基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾等的影響。Ft最重要的毒力因子包括莢膜、LPS、外膜囊泡(out membrane vehicle,OMV)和分泌系統(tǒng),尤其是由毒力島(Francisellapathogenicity island,FPI)編碼的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅵ secretion system,T6SS)。本文主要就Ft被細(xì)胞攝取、從吞噬小體中逃逸、對(duì)宿主氧化防御的拮抗、對(duì)先天性免疫的抑制等方面對(duì)Ft的致病機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 攝取機(jī)制

Ft可感染多種類型細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等吞噬細(xì)胞,肝細(xì)胞、肺泡Ⅱ型細(xì)胞等組織細(xì)胞,但主要靶細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。在早期的攝取階段,Ft憑借自身的Ⅳ型菌毛黏附在宿主細(xì)胞表面[6],并分泌許多形狀非典型的納米管狀OMV,其中含有許多毒力因子和抗原如脂肪酶FtlA(Francisellatularsislipase A)有利于OMV附著在宿主細(xì)胞膜[7-8]。

黏附于細(xì)胞表面之后,Ft在受體的介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞。巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體(mannose receptor,MR)、C型凝集素受體、補(bǔ)體受體(complement receptors,CR)3/4,樹突狀細(xì)胞上的CR3/4,中性粒細(xì)胞上的CR1/3,B細(xì)胞上的CR1/2、B細(xì)胞受體以及清道夫受體A(scavenger receptor A,SRA)、Fc-γ受體均參與Ft的攝取與內(nèi)化過程[9-10]。介導(dǎo)細(xì)胞攝取Ft的主要受體取決于細(xì)菌是否經(jīng)過血清或抗體調(diào)理。未經(jīng)調(diào)理的Ft,巨噬細(xì)胞主要通過MR攝取;調(diào)理后的細(xì)菌則依靠CR3、SRA與Fc-γ受體攝取[11]。IgM識(shí)別Ft的莢膜與LPS上的O抗原后可通過C1q啟動(dòng)經(jīng)典補(bǔ)體激活途徑,促進(jìn)C3對(duì)Ft的調(diào)理和之后的吞噬[10]。相反,在無C3的人血清中,巨噬細(xì)胞對(duì)Ft Schu S4菌株的攝取顯著減少。但是,在無C1q的人血清中,巨噬細(xì)胞對(duì)Schu S4株的攝取與正常人血清并無差異,提示補(bǔ)體激活旁路途徑在該過程中也發(fā)揮了作用[12]。

2 吞噬小體逃逸機(jī)制

巨噬細(xì)胞攝取的細(xì)菌進(jìn)入吞噬小體,隨后在吞噬小體與溶酶體融合形成的吞噬溶酶體中被降解。Ft可修飾早期內(nèi)體抗原1(early endosome antigen-1,EEA-1)、溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein,LAMP)-1/2/3和Rab5/7,在進(jìn)入細(xì)胞1～4 h內(nèi)降解吞噬體膜從而進(jìn)入胞漿[13]。Ft FPI編碼的T6SS與其從吞噬小體逃逸密切相關(guān)。T6SS分泌的IglC、IglD、IglE、IglI、IglJ蛋白可識(shí)別巨噬細(xì)胞LAMP-1或LAMP-2并與之結(jié)合,從而抑制吞噬小體的功能。此外,IglE還可阻止動(dòng)力蛋白和微管組織中心介導(dǎo)的宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),從而抑制Ft向溶酶體運(yùn)輸;IglI、IglJ則可阻止吞噬小體與溶酶體融合。migR、PigR、MglA 是T6SS的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)控部分毒力蛋白的表達(dá)。PdpB、PdpC和PdpD是參與吞噬小體破裂的T6SS效應(yīng)因子,這些因子的缺失可導(dǎo)致Ft吞噬小體逃逸缺陷[14-17]。

3 拮抗宿主氧化防御機(jī)制

當(dāng)病原微生物入侵時(shí),巨噬細(xì)胞的代謝會(huì)從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒?三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚匝?reactive oxygen species,ROS)或其他抗菌代謝物。因此,線粒體在防御微生物和調(diào)節(jié)炎癥因子等方面發(fā)揮重要作用。在感染Schu S4菌株的巨噬細(xì)胞中,細(xì)菌莢膜通過電子傳輸鏈(electron transport chain,ETC)復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ增強(qiáng)感染細(xì)菌的細(xì)胞中線粒體的代謝功能,阻止細(xì)胞向有氧糖酵解轉(zhuǎn)變,從而抑制細(xì)胞凋亡和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。由于線粒體的免疫功能被抑制,細(xì)菌可在胞內(nèi)大量復(fù)制,最終導(dǎo)致細(xì)胞脹亡[18]。

宿主的ROS與活性氮(reactive nitrogen species,RNS)在免疫防御中發(fā)揮重要作用。Ft可表達(dá)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SODs)、過氧化氫酶(catalase,KatG)、谷胱甘肽過氧化物酶、有機(jī)氫過氧化物、烷基過氧化氫還原酶(alkyl-hydroperoxide reductase,AhpC)和MoxR-ATP酶對(duì)ROS和RNS進(jìn)行代謝和中和[19]。硫氧還蛋白TrxA1,膜融合蛋白EmrA1和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OxyR、osrR均可調(diào)控Ft對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的拮抗。硫氧還蛋白TrxA1調(diào)節(jié)OxyR的表達(dá)[20],進(jìn)而促進(jìn)過氧化氫及SODB、KatG和AhpC的分泌[21]。膜融合蛋白EmrA1通過促進(jìn)SODB和KatG的分泌而有助于抗氧化。osrR 屬于AraC/XylS轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族,特異性地調(diào)控Ft對(duì)宿主氧化應(yīng)激反應(yīng)的拮抗作用。osrR可通過調(diào)節(jié)Emr MEP(major facilitator superfamily type Emr multidrug efflux pump)基因、FPI基因及新陳代謝相關(guān)基因等的表達(dá)從多方面參與拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。由此可見osrR在Ft致病機(jī)制中發(fā)揮的重要作用[22]。

NADPH氧化酶復(fù)合體是宿主氧化防御的關(guān)鍵。該復(fù)合體由多種酶組成,可以催化分子氧轉(zhuǎn)化為超氧陰離子。Ft也進(jìn)化出多種機(jī)制來阻斷中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶活性。在血清調(diào)理后的攝取過程中,Ft可通過調(diào)控膜結(jié)合細(xì)胞色素b558、降低多種PKC底物如p47Phox的磷酸化水平等抑制NADPH氧化酶復(fù)合物的形成。此外,Ft還可抑制NADPH氧化酶功能的發(fā)揮,從而阻礙中性粒細(xì)胞的活化,降低ROS產(chǎn)生,干擾宿主防御機(jī)制[23]。

4 抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制

Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一類分布于細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRR),它們主要通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)。與其他革蘭氏陰性菌相同,Ft細(xì)胞壁主要成分為L(zhǎng)PS,由錨定在外膜上的類脂A、附著在類脂A上的核心低聚糖和O抗原組成。大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的類脂A包含6個(gè)長(zhǎng)度為12～14個(gè)碳的酰基鏈及可與TLR-4相互作用的磷酸基團(tuán),而Ft類脂A為四?；粚?duì)稱的、比正常脂肪酸更長(zhǎng)的脂肪酸鏈(16～18個(gè)碳);且其葡萄糖主鏈上磷酸鹽缺失或被半乳糖胺保護(hù)。這些差異使脂多糖結(jié)合蛋白無法識(shí)別Ft的LPS,因此,Ft感染機(jī)體后,宿主細(xì)胞TLR-4信號(hào)通路無法激活[24]。

根據(jù)識(shí)別PAMPs的結(jié)構(gòu)特征,PRR可分為視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptor,RLR)、NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)和AIM2(absent in melanoma 2)樣受體。Nlrp3(nacht LRR and PYD domains containing protein 3)屬于NLR家族,被激活時(shí)可與ASC和酶原proaspase-1組裝形成炎癥小體。研究發(fā)現(xiàn),Ft感染敲除Nlrp3的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的磷酸化IκB(Inhibitor of NF-κB)、ERK1/2和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB) 水平顯著升高,表明Ft可激活Nlrp3炎癥小體,通過調(diào)控NF-κB與絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)來抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[25-26]。Gerard等研究發(fā)現(xiàn)Ft基因ybeX編碼帶有DXD基序的糖基轉(zhuǎn)移酶,可與自身的GdcA (glycosyltransferase domain containing protein A)相互作用,阻斷NF-κB激活,并對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有協(xié)同致死作用[27]。E3連接酶TRAF6和TRAF3復(fù)合物調(diào)控PRR通路的激活。Ft T6SS可通過抑制K63連接的多聚泛素化,阻礙TRAF6和TRAF3復(fù)合物形成,從而同時(shí)抑制多個(gè)PRR通路如TLR、RLR和胞質(zhì)DNA信號(hào)傳遞,抑制先天性免疫反應(yīng)[28]。

巨噬細(xì)胞受體CR3可介導(dǎo)Ft感染后對(duì)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制。該過程因Ft是否經(jīng)血清補(bǔ)體C3調(diào)理而異。對(duì)于C3調(diào)理后的菌株,CR3與其結(jié)合可抑制早期ERK1/2、p38 MAPK和NF-κB的活性,參與調(diào)控吞噬過程中和吞噬后不久的免疫抑制。同時(shí),在C3調(diào)理的Schu S4菌株-CR3吞噬過程中,Ras GTP酶激活蛋白活性增加,MAPK/ERK的激活被抑制,導(dǎo)致早期炎癥小體激活途徑上游的Ras-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)減少,從而抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[29]。未經(jīng)C3調(diào)理的菌株,感染后促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和MAPK的激活依賴于TLR2信號(hào)通路,而CR3介導(dǎo)的信號(hào)通路上調(diào)了Lyn激酶和Akt的激活以及MKP-1的表達(dá),從而限制了TLR2介導(dǎo)的促炎反應(yīng)[30]。除此之外,Ft可下調(diào)PI3K p85α和AKT通路,拮抗宿主的免疫防御機(jī)制[19]。

5 維持自身穩(wěn)定的機(jī)制

宿主不斷進(jìn)化以清除侵入機(jī)體內(nèi)的病原菌,而后者必須保持自身蛋白結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定才能得以存活。Ft編碼的二硫鍵形成蛋白A (disulfide bond formation protein A,DsbA)同時(shí)具有氧化還原酶和異構(gòu)酶活性,能夠氧化底物中復(fù)雜的二硫鍵并使其異構(gòu)化,從而修復(fù)受損的蛋白,是該菌毒力的重要組成部分。Hoang等發(fā)現(xiàn)DsbA的底物多達(dá)50余種,包括外膜蛋白、毒力因子等[31]。Ivona等通過分析缺失DsbA菌株蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)gapA基因編碼的甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬于DsbA底物。該蛋白存在于胞漿、細(xì)胞表面與細(xì)胞外,除了在糖酵解中發(fā)揮作用外,還參與DNA的修復(fù)過程,影響其他蛋白的亞細(xì)胞分布,結(jié)合如纖溶酶原、纖維蛋白原和纖維連接蛋白等胞外血清蛋白[32-33]。細(xì)菌細(xì)胞壁可維持細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和膜的完整性,主要由肽聚糖(peptidoglycan,PG)組成。細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性菌通過回收和修復(fù)受損的PG來保護(hù)自己免受巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺傷。研究發(fā)現(xiàn)Ft編碼的PG循環(huán)酶L,D-羧肽酶A(L,D-carboxypeptidase A,LdcA)也是DsbA的底物。該酶亦具有L,D-內(nèi)肽酶活性,可將PG四肽或五肽轉(zhuǎn)化為三肽,對(duì)細(xì)菌維持形態(tài)和膜完整性至關(guān)重要[34]。DsbA的另一底物D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶在維持膜完整性和細(xì)胞形態(tài)方面也發(fā)揮作用,該蛋白可提高Ft對(duì)低pH、高溫和高滲透壓的耐受[35]。

除了DsbA的作用外,Ft還可通過編碼蛋白或者釋放含有不同蛋白的OMV維持自身穩(wěn)定,提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[36-37]。如可溶性的溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶,是新兇手亞種在低pH條件下正常生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的必需因子,該蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致其在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制減少[36]。在42 ℃和低pH條件下,Ft的OMV形成率增加數(shù)倍,其內(nèi)的蛋白質(zhì)組分含量也發(fā)生顯著變化,且包含與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸有關(guān)的毒力因子[37]。

6 展望

自Ft首次被報(bào)道至今,已有一個(gè)多世紀(jì)。經(jīng)過不斷研究,對(duì)該病原生物學(xué)特性和與宿主相互作用的機(jī)制等的理解也逐漸深入。盡管如此,人們?nèi)晕赐耆U釋Ft的致病機(jī)理和免疫逃逸機(jī)制。Ft感染后在宿主細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖是其生命周期中的核心,也是感染后引起宿主發(fā)病的關(guān)鍵。這涉及到一系列生物學(xué)過程,包括對(duì)先天性免疫的抑制、被巨噬細(xì)胞攝取、從吞噬小體中逃逸、對(duì)宿主氧化防御的拮抗、胞漿內(nèi)的增殖等。這些過程的變化均有可能引起Ft特性的改變甚至毒力的減弱。因此,對(duì)這些科學(xué)問題的進(jìn)一步探究和闡釋至關(guān)重要,將為疫苗、藥物或者新療法的研制提供靶點(diǎn)。