黃梓泓， 宋鴻志， Edward J. Kennelly, 譚欽剛,*

( 1. 桂林醫(yī)學(xué)院， 中國(guó) 廣西 桂林 541199； 2. 紐約城市大學(xué)， 美國(guó) 紐約 10468 )

絡(luò)石藤作為常見(jiàn)中藥，在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中記載其為夾竹桃科植物絡(luò)石(Trachelospermumjasminoides)的干燥帶葉藤莖(國(guó)家藥典委員會(huì)，2020)。絡(luò)石藤主要含木脂素類(lèi)、三萜類(lèi)等化學(xué)成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒等作用，民間主要用于治療風(fēng)濕熱痹、腰膝酸痛等癥，現(xiàn)代臨床廣泛用于與炎癥和疼痛相關(guān)的疾病，如關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等(李金生等，2016；Zhao et al., 2017)。因民族用藥習(xí)慣不同，所以?？崎艑僦参锏毓?Ficustikoua)的新鮮或干燥地上部分——地瓜藤在不同地區(qū)被用作絡(luò)石藤(宮璐等，2016)。該植物主要含黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)及萜類(lèi)等化學(xué)成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等活性，主要用于清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫等(周芹茹等，2020；楊燁等，2021；Yao et al., 2022)。上述兩種藥材在科屬來(lái)源、化學(xué)成分及臨床應(yīng)用方面存在差異，其抗炎活性及相應(yīng)的化學(xué)成分差異尚未明確。

中藥材化學(xué)成分研究是闡明中藥材藥效物質(zhì)、作用機(jī)制以及臨床療效的先決條件(鄭敏霞等，2011；汪小莉等，2018)，傳統(tǒng)分離方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且消耗大量藥材，利用現(xiàn)代技術(shù)如超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技術(shù)可以為不同樣品間化學(xué)成分差異及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考，如da Silva等(2017)通過(guò)該法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)鑒定了兩大產(chǎn)區(qū)瓜拉納因地理?xiàng)l件不同而有差異的成分。絡(luò)石藤與地瓜藤在性狀上難以鑒別，兩者皆有治療炎癥相關(guān)疾病的記載，為初步探究?jī)煞N藥材抗炎活性及相關(guān)化學(xué)成分的差異，本研究利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的體外細(xì)胞模型探究絡(luò)石藤與地瓜藤對(duì)炎癥因子一氧化氮(nitric oxide，NO)的抑制活性差異，并采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)結(jié)合偏最小二乘法分析法(OPLS-DA)，對(duì)絡(luò)石藤和地瓜藤的差異性成分進(jìn)行分析，進(jìn)而為絡(luò)石藤與地瓜藤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 藥材和試劑

所需藥材于2019年12月采自廣西壯族自治區(qū)，絡(luò)石采自金秀瑤族自治縣，地果采自陽(yáng)朔縣。干燥樣品經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物所黃俞淞副研究員鑒定為絡(luò)石(Trachelospermumjasminoides)的帶葉藤莖(絡(luò)石藤)與地果(Ficustikoua)的地上部分(地瓜藤)。

質(zhì)譜純乙腈、甲醇、水和甲酸(美國(guó)Honeywell公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；脂多糖(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽MTT、二甲基亞砜DMSO、吲哚美辛Indomethacin(北京索萊寶科技有限公司)；一氧化氮測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器

UPLC-Q-TOF-MS/MS系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)，包括ACQUITY UPLC液相色譜儀，Xevo G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀，配有Lockspray接口及電噴霧離子源(ESI)等；數(shù)據(jù)的采集和處理采用MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm, 美國(guó)Waters公司)；S30H-D78224型超聲清洗器(德國(guó)Elma Sonic公司)；AL204型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；3111型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；AC2-4S1 生物安全柜(新加坡ESCO公司)；Infinite M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.3 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 研究方法

2.1 體外NO抑制活性測(cè)試

2.1.1 供試品溶液的制備 分別取絡(luò)石藤及地瓜藤各0.2 g，置于20 mL 80%甲醇-水溶液中室溫下超聲提取2次，每次20 min，合并提取液靜置30 min，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得各樣品甲醇提取物。

2.1.2 細(xì)胞及培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按照1∶2的比例傳代。

2.1.3 絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性考察 將RAW264.7細(xì)胞配置成濃度為6×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板上，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中24 h，設(shè)置對(duì)照組(僅含培養(yǎng)基)和給藥組(含不同濃度絡(luò)石藤醇提物、地瓜藤醇提物)，每組3個(gè)重復(fù)孔。24 h后，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔添加100 μL含有0.5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)基，于孵箱中培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每個(gè)孔中添加100 μL二甲基亞砜。在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸收波長(zhǎng)，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(A給藥/A對(duì)照)×100%

2.1.4 NO釋放量的檢測(cè) 將RAW264.7細(xì)胞配置成濃度為1.5×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板上，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中12 h，設(shè)置空白對(duì)照組(僅含培養(yǎng)基)、LPS模型組(含2 μg·mL-1LPS)和給藥組(2 μg·mL-1LPS、LPS+吲哚美辛、LPS+不同濃度絡(luò)石藤醇提物和LPS+不同濃度地瓜藤醇提物)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。24 h后，收集上清液，并采用Griess法測(cè)定NO含量，用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm下的吸光度。

2.2 差異成分分析處理

2.2.1 色譜檢測(cè)條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm)，采用0.5 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，進(jìn)樣體積設(shè)定為1 μL，樣品濃度為2 mg·mL-1。流動(dòng)相由含有0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)組成，洗脫程序如下：0～1.00 min 5%～18% B；1.00～2.50 min 18%～20% B；2.50～4.50 min 20%～25% B；4.50～5.00 min 25%～70% B；5.00～7.00 min 70%～75% B；7.00～9.50 min 75%～98% B；9.50～11.50 min 98%～5% B；11.50～13.50 min 5% B。

2.2.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 質(zhì)譜儀通過(guò)電噴霧電離(ESI)源連接到UPLC系統(tǒng)，霧化氣為氮?dú)?，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500，累積時(shí)間0.2 s。毛細(xì)管電壓在負(fù)離子模式下為2.42 kV，在正離子模式下為3.00 kV，樣品錐電壓為25 V，提取錐電壓為4 V。對(duì)于MS/MS譜圖，優(yōu)化了不同的碰撞能量(20～50 eV)，以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)解析的最大特征片段數(shù)。氮?dú)庥糜陟F化器和去溶劑化，去溶劑化和錐形氣體流速分別為800、20 L·h-1，去溶劑化溫度為550 ℃，源溫度為120 ℃。數(shù)據(jù)的采集和處理軟件為MassLynx 4.1質(zhì)譜工作站。

2.2.3 OPLS-DA差異性成分分析 以UPLC-Q-TOF-MS/MS采集所得絡(luò)石藤和地瓜藤色譜圖中峰面積量化值為變量，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA分析，絡(luò)石藤和地瓜藤樣品呈現(xiàn)一定分類(lèi)聚集現(xiàn)象。OPLS-DA模型中變量投影重要度(VIP值)越大，表明該指標(biāo)對(duì)區(qū)分絡(luò)石藤和地瓜藤的貢獻(xiàn)越大(崔婷等，2022)，即可能是區(qū)分兩種藥材的差異性成分，確定絡(luò)石藤與地瓜藤間的差異性化學(xué)成分。利用MassLynx 4.1色譜工作站得到化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量及化合物碎片信息，參照對(duì)照品并查閱相關(guān)文獻(xiàn)(范明松等，2005；袁珊琴等，2010；景玲等，2012；Liu et al., 2015; Zhao et al., 2017; Zhou et al., 2018; Murugesu et al., 2021; Song et al., 2022; Yao et al., 2022)結(jié)合Progenesis QI軟件，鑒定絡(luò)石藤與地瓜藤的差異性成分。

3 結(jié)果與分析

3.1 絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較，絡(luò)石藤醇提物(ethanol extract of the stems with leaves inTrachelospermumjasminoides，TJ)和地瓜藤醇提物(ethanol extract of the aerial parts inFicustikoua，F(xiàn)T)質(zhì)量濃度在80 mg·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，質(zhì)量濃度小于80 mg·L-1的各給藥組對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用，結(jié)果如圖1所示。以無(wú)毒質(zhì)量濃度設(shè)計(jì)40、20、10 mg·L-1為高、中、低劑量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差， n=3)， 與對(duì)照組比較， *P<0.05。 n=3), compared with the control group, *P<0.05.圖 1 絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響Fig. 1 Cytotoxicity of ethanol extracts of the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides and Ficus tikoua to RAW264.7 cells

3.2 絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物對(duì)LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響

從表1結(jié)果可以看出，絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物均可一定程度抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO炎癥因子，并且各組的藥效呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。其中，絡(luò)石藤醇提物的NO釋放抑制作用稍強(qiáng)于地瓜藤醇提物。

表 1 絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響Table 1 Effects of ethanol extracts of the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides and Ficus tikoua on NO secretion by RAW264.7 cells

3.3 絡(luò)石藤與地瓜藤差異性成分鑒定

OPLS-DA分析結(jié)果表明，模型對(duì)X變量的可解釋性R2X為0.84，模型對(duì)Y變量的可解釋性R2Y為0.999，模型預(yù)測(cè)能力Q2為0.993，說(shuō)明對(duì)模型的評(píng)估良好。從得分圖(圖2)可以看出，絡(luò)石藤和地瓜藤醇提物樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)區(qū)分明顯，表明絡(luò)石藤在化學(xué)成分上與地瓜藤有明顯區(qū)別。按照該模型X變量對(duì)Y變量的解釋能力(variable influence on projection，VIP)大小進(jìn)行排序，從采集所得絡(luò)石藤和地瓜藤色譜圖(圖3)中共鑒定出絡(luò)石藤中21個(gè)顯著差異性成分(表2)，包括木脂素類(lèi)10個(gè)、苯丙酸類(lèi)4個(gè)、黃酮類(lèi)2個(gè)、三萜類(lèi)2個(gè)、其他類(lèi)3個(gè)。地瓜藤中10個(gè)顯著差異性成分(表3)，包括黃酮類(lèi)7個(gè)、木脂素類(lèi)1個(gè)、苯丙酸類(lèi)1個(gè)、三萜類(lèi)1個(gè)。

圖 2 經(jīng)OPLS-DA 分析的得分圖Fig. 2 Score chart of OPLS-DA analysis

表 2 絡(luò)石藤的差異性化學(xué)成分鑒定Table 2 Identification of differential chemical constituents from the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides

表 3 地瓜藤的差異性化學(xué)成分鑒定Table 3 Identification of differential chemical constituents from the aerial parts in Ficus tikoua

圖 3 絡(luò)石藤(A)和地瓜藤(B)的BPI色譜圖Fig. 3 Base peak chromatograms of the medicinal parts in Trachelospermum jasminoides(A) and Ficus tikoua(B)

3.3.1 木脂素類(lèi)化合物分析 從表2可以看出，在負(fù)離子模式下，化合物1-4的準(zhǔn)分子離子峰為m/z697.236 1 [M-H]-，去除兩分子葡萄糖殘基(-162 Da×2)后得到碎片離子m/z373.127 3；接著，從內(nèi)酯環(huán)上連接2個(gè)取代基的季碳上斷裂取代基(-16-136 Da)(Abe et al.,1986; Liu et al., 2015)后得到碎片離子m/z221.068 2；隨后，內(nèi)酯環(huán)上丟失一分子CO(-28 Da)后，環(huán)內(nèi)形成雙鍵(-2 Da)，得到碎片離子m/z191.056 0。結(jié)合文獻(xiàn)(Liu et al., 2015)及質(zhì)譜斷裂方式，推測(cè)該化合物為去甲絡(luò)石苷元4,4′-di-O-β-D-吡喃葡萄糖苷?；衔?-7與化合物1-8以及化合物1-12與化合物1-13為兩對(duì)同分異構(gòu)體，而同分異構(gòu)體其保留時(shí)間接近且裂解途徑無(wú)明顯差別。在負(fù)離子模式下，化合物1-13的準(zhǔn)分子離子峰為m/z595.204 3 [M+HCOO]-，去除一分子葡萄糖殘基(-162 Da)后得到碎片離子m/z387.144 1，緊接著丟失一分子-OCH3得到碎片離子m/z357.133 9，可以推測(cè)出化合物的結(jié)構(gòu)間母核上的區(qū)別。繼而可推測(cè)，化合物1-4、1-7、1-8的母核皆為去甲絡(luò)石苷元，化合物1-12與化合物1-13的母核為絡(luò)石苷元。同時(shí)，結(jié)合保留時(shí)間與文獻(xiàn)(Liu et al, 2015)上的報(bào)道對(duì)應(yīng)，可以推測(cè)出化合物1-7與化合物1-8為去甲絡(luò)石苷元5′-C-β-葡萄糖苷和去甲絡(luò)石苷，化合物1-12與化合物1-13分別為5′-甲氧基羅漢松脂苷和絡(luò)石苷。

3.3.2 苯丙酸類(lèi)化合物分析 苯丙酸類(lèi)化合物由于結(jié)構(gòu)中含有羧基和酚羥基，其裂解過(guò)程中易丟失水分子和羧酸分子，并且容易在羰基處斷裂形成碎片離子?；衔?-1及化合物1-2在負(fù)離子模式下，二者的準(zhǔn)分子離子峰在m/z353.088 1 [M-H]-左右，可推測(cè)二者的分子式為C16H18O9，它們?cè)诙?jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中因酯鍵斷裂而形成m/z191.055 4、179.025 3，分別對(duì)應(yīng)于奎寧酸片段、咖啡酸片段(雒曉梅等，2019)。根據(jù)文獻(xiàn)(Qi et al., 2009)報(bào)道的保留時(shí)間，可判斷他們分別為綠原酸及隱綠原酸。

3.3.3 黃酮類(lèi)化合物 黃酮苷類(lèi)化合物的裂解通常為糖鏈結(jié)構(gòu)的連續(xù)丟失，如鼠李糖(146 Da)或葡萄糖(162 Da)殘基的丟失，從而可以找到黃酮苷元的碎片離子峰?；衔?-6的準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.092 1 [M-H]-，去除一分子葡萄糖殘基(-162 Da)后得到碎片離子m/z285.039 5，結(jié)合文獻(xiàn)(徐萌伶等, 2022)報(bào)道推測(cè)其為木犀草苷。并且，黃酮類(lèi)化合物裂解過(guò)程中易發(fā)生脫水、環(huán)的逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(RDA)裂解，以及失去CO、CHO等一些中性分子。由于二級(jí)質(zhì)譜中存在m/z285.040 0 [M-H-C12H20O9]-等碎片離子，因此根據(jù)文獻(xiàn)(Qian et al., 2010)報(bào)道可推測(cè)化合物1-5為忍冬苷。

3.3.4 三萜類(lèi)化合物 通常三萜類(lèi)化合物在二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中，主要是糖鍵的連續(xù)性斷裂以及取代基的丟失。化合物1-14的準(zhǔn)分子離子峰為m/z727.394 1 [M+COOH]-，分子去除一個(gè)葡萄糖殘基(-162 Da)后得到碎片離子m/z519.332 6，結(jié)合分子量及文獻(xiàn)(譚興起等，2006)推測(cè)其為絡(luò)石苷B1?；衔?-16的準(zhǔn)分子離子峰為m/z695.364 2 [M-H]-，去除一分子葡萄糖殘基 (-162 Da) 后得到碎片離子m/z517.317 0，隨后因丟失了一分子羧基及羥基(-45-17 Da)而得到碎片離子m/z471.310 5，結(jié)合分子量及文獻(xiàn)(譚興起等，2006)報(bào)道推測(cè)其為絡(luò)石苷F。

4 討論與結(jié)論

絡(luò)石藤是藥典中記載的我國(guó)常用且重要的中藥材，由于其產(chǎn)地和用藥習(xí)慣的不同，因此地瓜藤在民間常被用作絡(luò)石藤替代品。本研究通過(guò)比較絡(luò)石藤與地瓜藤醇提物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響，發(fā)現(xiàn)絡(luò)石藤與地瓜藤皆可抑制該炎癥因子釋放，這初步解釋了地瓜藤可在部分地區(qū)長(zhǎng)期用作絡(luò)石藤的合理性。

本研究通過(guò)OPLS-DA法證實(shí)絡(luò)石藤與地瓜藤的化學(xué)成分存在明顯差異，絡(luò)石藤以二芐基丁內(nèi)酯類(lèi)木脂素類(lèi)成分為主要差異性成分，而地瓜藤則以黃酮類(lèi)化合物居多，兩類(lèi)物質(zhì)均具有抗炎活性。二芐基丁內(nèi)酯類(lèi)木脂素類(lèi)成分具有抗炎、抗腫瘤和平喘等多種作用(毛杰等，2014)，其代表性成分絡(luò)石苷為藥典中評(píng)價(jià)絡(luò)石藤藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)(國(guó)家藥典委員會(huì)，2020)；牛蒡子苷元通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子p65的核移位等途徑，降低了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，進(jìn)一步減少了NO的生產(chǎn)，從而起到抗炎作用(Cho et al., 2002)；Lee等(2010)研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷和羅漢松脂酚不僅抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其調(diào)節(jié)蛋白的激活， 而且能夠潛在地抑制特異性絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活，從而降低炎癥因子iNOS與COX-2的表達(dá)；Song等(2022)研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)二芐基丁內(nèi)酯類(lèi)木脂素成分能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7中NO的產(chǎn)生。劉美平等(2010)通過(guò)紫外分光光度法，發(fā)現(xiàn)絡(luò)石藤提取物中的總木脂素含量超過(guò)80%，證明該類(lèi)成分為絡(luò)石藤的主要化學(xué)成分。地瓜藤中的差異性黃酮類(lèi)成分，如染料木素可降低LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠的炎癥因子表達(dá)(Chen et al., 2018)；懷特酮具有顯著的NO抑制作用(Anh et al., 2016)；8-異戊烯基柚皮素可降低體外炎癥模型的炎癥因子表達(dá)(Paoletti et al., 2009)等。此外，Yao等(2021)從地瓜藤的同屬植物高山榕果實(shí)中分離得到的黃酮類(lèi)化合物也具有抑制NO的作用。

本研究應(yīng)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察絡(luò)石藤與地瓜藤的NO抑制活性差異，發(fā)現(xiàn)絡(luò)石藤對(duì)NO釋放的抑制作用稍?xún)?yōu)于地瓜藤，利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)并結(jié)合OPLS-DA方法，發(fā)現(xiàn)絡(luò)石藤和地瓜藤的主要差異性成分分別是木脂素和黃酮，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)上述兩類(lèi)成分分別為兩種藥材抗炎活性的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為絡(luò)石藤與地瓜藤的質(zhì)量控制以及進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)與利用植物資源提供了理論依據(jù)。