豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗耐熱保護(hù)技術(shù)的研究

趙玉龍，何平有，劉明超，劉 濤,3，焦玉蘭,3*

(1.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine, TGE)和豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是常見的主要侵染豬腸道的高度接觸性傳染病，常發(fā)生在冬春季，是豬的常見病，尤其對(duì)仔豬危害嚴(yán)重[1-2]，臨床表現(xiàn)為哺乳仔豬的急性腸炎、嘔吐、腹瀉和高死亡率[3]。

目前，疫苗免疫仍是防控該類疫病的主要手段[4]。市場(chǎng)化的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒凍干活疫苗，其毒力穩(wěn)定、安全，對(duì)仔豬免疫效力確實(shí)[5]，但在疫苗生產(chǎn)和使用中仍存在一些問題：一是半成品病毒液保存時(shí)間短(-20 ℃保存期僅2個(gè)月)；二是凍干活疫苗保存條件高(需在-20 ℃保存，保存期18個(gè)月)，疫苗儲(chǔ)運(yùn)過程不穩(wěn)定，影響免疫效果[6]。疫苗保護(hù)劑的成分及其制備、凍干工藝是影響疫苗效果的重要因素，對(duì)疫苗保存、運(yùn)輸及免疫效果有很大影響，本研究擬開發(fā)一種新型病毒保護(hù)劑，提高對(duì)病毒保護(hù)效果，提升疫苗質(zhì)量。

本試驗(yàn)通過在常規(guī)保護(hù)劑(明膠、蔗糖)基礎(chǔ)上添加卡波姆、硫酸鋅、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等基質(zhì)，組成新型保護(hù)劑，分別在病毒液保存和疫苗凍干過程添加，通過對(duì)病毒液保存效果和疫苗常規(guī)檢驗(yàn)以及病毒含量、安全性、免疫攻毒保護(hù)效果及耐老化試驗(yàn)等項(xiàng)目的對(duì)比研究，評(píng)價(jià)了新型保護(hù)劑病毒保護(hù)效果。

1 材 料

1.1 病毒液 疫苗毒株為豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)HB08株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)ZJ08株。豬傳染性胃腸炎半成品病毒液500 mL、豬流行性腹瀉半成品病毒液500 mL，均由瑞普公司生產(chǎn)部提供。

1.2 疫苗保護(hù)劑成分 蔗糖、聚乙二醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；明膠、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、硫酸鋅購自默克公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 5日齡豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病毒抗體陰性健康仔豬，購自河北省某養(yǎng)殖場(chǎng)。

2 方 法

2.1 疫苗制備

2.1.1 保護(hù)劑的制備 試驗(yàn)用新型保護(hù)劑配方：10%明膠、50%蔗糖、5%卡波姆、1%硫酸鋅、5%聚乙二醇、5%聚乙烯吡咯烷酮；常規(guī)保護(hù)劑配方：10%明膠、50%蔗糖。

2.1.2 病毒液制備 豬傳染性胃腸炎半成品病毒液、豬流行性腹瀉半成品病毒液均由瑞普公司生產(chǎn)部按照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2323號(hào)》(下文簡(jiǎn)稱《公告2323號(hào)》)半成品操作規(guī)程制備，病毒含量符合公告質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 配苗、分裝及凍干 按表1分組及操作方法進(jìn)行配苗、分裝及凍干。

2.2 保護(hù)劑保存及凍干效果評(píng)估

2.2.1 新型保護(hù)劑對(duì)病毒液保存效果的影響 按照表2分組方法進(jìn)行病毒液保存效果試驗(yàn)。

2.2.2 凍干活疫苗常規(guī)項(xiàng)目及純凈性檢驗(yàn) 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典2020年版三部》(下文簡(jiǎn)稱《中國(guó)獸藥典》)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2.3 凍干活疫苗效力檢驗(yàn)(病毒含量測(cè)定) 按照《公告2323號(hào)》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2.4 凍干活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)(測(cè)定攻毒保護(hù)效果) 按表3分組方法進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。

2.2.5 凍干活疫苗安全試驗(yàn) 按表4分組方法進(jìn)行安全試驗(yàn)。

表1 疫苗分裝、凍干試驗(yàn)操作Tab 1 Experimental operating method of loading and lyophilization

表2 病毒液保存效果試驗(yàn)Tab 2 Experiment on preservation effect of disease venom

表3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)Tab 3 Challenge protection experiment

表4 安全試驗(yàn)Tab 4 Experimental operating method of safety inspection

2.2.6 凍干活疫苗耐老化試驗(yàn) 凍干后各組疫苗隨機(jī)抽取30支，分別置37 ℃保存15 d，分別測(cè)定病毒含量。

2.2.7 凍干活疫苗保存期試驗(yàn) 疫苗保存條件由原來-20 ℃保存改為2～8 ℃保存，常規(guī)保護(hù)劑凍干活疫苗和新型保護(hù)劑凍干活疫苗保存0、6、12、24和36個(gè)月，分別測(cè)定病毒含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒液添加新型保護(hù)劑凍存效果驗(yàn)證 如表5所示，未添加保護(hù)劑的病毒液-20 ℃僅保存2個(gè)月。添加新型保護(hù)劑的病毒液在-20 ℃保存12個(gè)月后，病毒含量均無明顯變化，TGEV病毒含量?jī)H下降0.34個(gè)滴度，PEDV病毒含量?jī)H下降0.54個(gè)滴度。

表5 病毒液保存效果試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Experimental results of preservation effect of disease virus content TCID50/mL

3.2 凍干后常規(guī)項(xiàng)目及純凈性檢驗(yàn)結(jié)果 如表6所示，兩種凍干保護(hù)劑活疫苗，物理性狀、真空度、剩余水分和無菌檢驗(yàn)結(jié)果均符合《中國(guó)獸藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在溶解性方面新型凍干保護(hù)劑活疫苗明顯優(yōu)于常規(guī)保護(hù)劑活疫苗。

表6 常規(guī)項(xiàng)目及純凈性檢測(cè)結(jié)果Tab 6 Routine tests and purity test results

3.3 凍干活疫苗效力試驗(yàn)(病毒含量測(cè)定) 如表7所示，新型保護(hù)劑活疫苗TGEV部分效力較常規(guī)保護(hù)劑活疫苗高0.43個(gè)滴度，PEDV部分效力高0.6個(gè)滴度。

表7 效力試驗(yàn)結(jié)果

3.4 凍干活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)、安全試驗(yàn)結(jié)果 如表8所示，新型保護(hù)劑疫苗保護(hù)效果優(yōu)于常規(guī)保護(hù)劑。新型保護(hù)劑活疫苗可提供9.67/10保護(hù)，常規(guī)保護(hù)劑活疫苗免疫攻毒保護(hù)為8.33/10；對(duì)照組0/10保護(hù)。

表8 攻毒保護(hù)及安全試驗(yàn)結(jié)果Tab 8 Challenge protection and safety test results

3.5 凍干活疫苗耐老化試驗(yàn)結(jié)果 如表9所示，新型保護(hù)劑活疫苗37 ℃保存15 d，其TGEV部分病毒含量降低0.8個(gè)滴度，PEDV部分病毒含量降低0.9個(gè)滴度；而常規(guī)保護(hù)劑活疫苗病毒含量迅速下降，37 ℃保存期不足5 d。

表9 耐老化試驗(yàn)結(jié)果(37 ℃保存)

3.6 凍干活疫苗保存期試驗(yàn)結(jié)果 如表10所示，新型耐熱保護(hù)劑活疫苗2～8 ℃保存36個(gè)月, TGEV部分病毒含量降低0.3個(gè)滴度，PEDV部分病毒含量降低0.5個(gè)滴度，且病毒含量高于農(nóng)業(yè)部公告質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(≥5.0 lg(TCID50/頭份)，在冷藏條件下保存期可長(zhǎng)達(dá)36個(gè)月；常規(guī)保護(hù)劑活疫苗2～8 ℃保存期僅為6個(gè)月。

表10 保存期試驗(yàn)結(jié)果(2～8 ℃保存)

4 結(jié)論與討論

高效價(jià)的半成品病毒液是生物制品穩(wěn)定生產(chǎn)的基礎(chǔ)。多年的生產(chǎn)實(shí)踐證明，-20 ℃左右低溫保存的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉半成品的效價(jià)保存期僅為2個(gè)月，對(duì)后期成品生產(chǎn)及質(zhì)量影響很大。近年來本課題組試圖查閱文獻(xiàn)，尋找解決辦法。所閱文獻(xiàn)多為-20 ℃以下保存，-15 ℃及以上保存的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過在半成品保存環(huán)節(jié)添加新型冷凍保存液，使半成品保存期在-15 ℃～-18 ℃環(huán)境下由原來的2個(gè)月延長(zhǎng)到12個(gè)月，確保實(shí)現(xiàn)常溫化苗，提升了病毒穩(wěn)定性和活性、為生產(chǎn)調(diào)度贏得了時(shí)間。

選用合適的保護(hù)劑對(duì)疫苗的質(zhì)量和長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性至關(guān)重要[7]。市場(chǎng)上現(xiàn)有的腹瀉二聯(lián)活疫苗通常為蔗糖、明膠等保護(hù)劑，組方簡(jiǎn)單、保護(hù)功能差，2～8 ℃可以冷藏運(yùn)輸、但-15 ℃以下保存期是其兩倍[8]，說明其冷藏保存穩(wěn)定性尚待進(jìn)一步研究。

本研究在原有明膠、蔗糖基礎(chǔ)上添加了PEG、聚乙烯吡咯烷酮等基質(zhì)，可有效減小病毒在凍干過程中凍干損失，較常規(guī)保護(hù)劑提升了0.4～0.6個(gè)滴度，大分子冷凍保護(hù)劑與小分子冷凍保護(hù)劑聯(lián)合使用，顯著提升了病毒活性與穩(wěn)定性。同時(shí)，醫(yī)藥級(jí)PEG[9-10]和聚乙烯吡咯烷酮溶解性能良好，可與多種藥物相溶，提高生物利用度。聚乙烯吡咯烷酮還具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[11]。本試驗(yàn)保護(hù)劑中通過添加PEG和聚乙烯吡咯烷酮，充分利用了二者優(yōu)異的溶解性和熱穩(wěn)定，加速了疫苗溶解度，保護(hù)了病毒的抗原性，提高了產(chǎn)品在保存和使用中的穩(wěn)定性。

本研究在組方中添加PEG、卡波姆和硫酸鋅等制備的疫苗具有良好的耐熱效果，在2～8 ℃環(huán)境保存36個(gè)月，效價(jià)僅下降0.3個(gè)滴度。研究者認(rèn)為，卡波姆與PEG對(duì)冠狀病毒具有良好的保護(hù)作用，二者在凍干過程中可形成獨(dú)特的雙層結(jié)構(gòu)，包裹在病毒表面形成一種天然屏障，有效阻隔冷凍過程冰晶對(duì)病毒囊膜的損傷，另一方面內(nèi)側(cè)的疏水區(qū)結(jié)構(gòu)與病毒嵌合增加病毒自身的穩(wěn)定性，有效保存病毒的活性。李晏[12]表明卡波姆作為一種高分子聚合物，可促進(jìn)冷凍干燥過程中的升華，使懸浮于耐熱保護(hù)劑中的病毒在冷凍干燥過程中能保持存活狀態(tài)；硫酸鋅也具有增強(qiáng)病毒自身穩(wěn)定性的功能。侯若鑫等[13-14]表明鋅是機(jī)體多種酶的重要組成成分和激活因子，能夠參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和代謝增殖，在細(xì)胞生長(zhǎng)、免疫功能和營(yíng)養(yǎng)代謝等生理或病理過程中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本試驗(yàn)在半成品病毒液儲(chǔ)存時(shí)加入含卡波姆等基質(zhì)的新型保護(hù)劑, 可有效延長(zhǎng)半成品保存期，保證半成品病毒在常溫狀態(tài)下生物學(xué)活性的維持，實(shí)現(xiàn)了常溫直接融化疫苗半成品，生產(chǎn)工序更簡(jiǎn)化，且降低了能耗。同時(shí)降低了病毒保存和凍干過程中的損傷，采用新型保護(hù)劑制備的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗，實(shí)現(xiàn)了儲(chǔ)運(yùn)過程中疫苗冷藏保存，提升了疫苗運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性；且保存期由原來-20 ℃保存24個(gè)月延長(zhǎng)到2～8 ℃保存36個(gè)月。