馬秋冉，于曉輝，王 雷，楊 星，顧進(jìn)華

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

獸藥中的水分包括結(jié)晶水和吸附水，水分含量的多少，對(duì)獸藥的穩(wěn)定性、理化性質(zhì)及藥效作用等均有影響。有效控制獸藥水分可預(yù)防獸藥吸潮、霉變、水解、氧化等[1]，因此，在獸藥研發(fā)與生產(chǎn)中需采用準(zhǔn)確可靠的水分檢查法。目前，三部藥典均收載水分測(cè)定法通則或附錄。本文比較分析了《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典[2-4]的水分測(cè)定法，以期為相關(guān)研究提供借鑒，也為《中國(guó)獸藥典》水分測(cè)定法的修訂提供參考。

1 《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典水分測(cè)定法概況

《中國(guó)獸藥典》2020年版收載5種水分測(cè)定法，分別為費(fèi)休氏法(容量滴定法和庫(kù)侖法)、甲苯法、氣相色譜法、烘干法和減壓干燥法，其中費(fèi)休氏法收錄在一部，甲苯法和氣相色譜法在一部和二部中均有收錄，烘干法和減壓干燥法收錄在二部?！睹绹?guó)藥典》2022年版收載3種測(cè)定法，分別為滴定法(直接滴定法、剩余滴定法和庫(kù)倫滴定法)、甲苯共沸蒸餾法和重量分析法?！队?guó)藥典》2022年版收載3種測(cè)定法，分別為半微量水分測(cè)定法(直接滴定法和剩余滴定法)，甲苯蒸餾法，微量水分測(cè)定法(庫(kù)倫滴定法)。三部藥典中水分測(cè)定法可歸納為4類，即費(fèi)休氏法(直接滴定法、剩余滴定法和庫(kù)倫滴定法)、重量分析法(烘干法、減壓干燥法和干燥失重法)、甲苯法和氣相色譜法?！吨袊?guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典水分測(cè)定法匯總見(jiàn)表1。

表1 三國(guó)藥典水分測(cè)定法比較Tab 1 Comparison table of water determination methods in three pharmacopoeia

2 《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典水分測(cè)定法簡(jiǎn)介及對(duì)比分析

2.1 費(fèi)休氏法

2.1.1 方法介紹 卡爾·費(fèi)休氏法是Karl Fischer 在1935年提出的水分測(cè)定方法，簡(jiǎn)稱費(fèi)休氏法。根據(jù)碘的來(lái)源，分為容量法和庫(kù)侖法，容量法按滴定方式不同可分為直接滴定法和剩余滴定法。直接滴定法根據(jù)碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中與水定量反應(yīng)的原理來(lái)測(cè)定水分。剩余滴定法通過(guò)向樣品中加入過(guò)量已標(biāo)定的費(fèi)休氏滴定液，再利用已標(biāo)定的水標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴剩余的費(fèi)休氏滴定液，由消耗水標(biāo)準(zhǔn)溶液的量計(jì)算水分[5]。庫(kù)侖滴定法中的碘，由陽(yáng)極電解液電解產(chǎn)生，當(dāng)所有水被反應(yīng)完時(shí)，電極極化，反應(yīng)停止，根據(jù)法拉第定律，產(chǎn)生的碘量與通過(guò)的電量成正比，可以通過(guò)測(cè)量總電量計(jì)算水分。

三種滴定方法根據(jù)測(cè)定原理不同，分別適用于測(cè)定不同樣品。直接滴定法適用范圍最廣，可以直接測(cè)定樣品中的游離水和結(jié)晶水，特別適用于測(cè)定遇熱易破壞、引濕性強(qiáng)的樣品。剩余滴定法適用于結(jié)晶水釋放緩慢，造成直接滴定法測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)的樣品。庫(kù)侖法適用于含微量水分(0.0001%～0.1%)的樣品，特別適用于測(cè)定化學(xué)惰性物質(zhì)如烴類、醇類和酯類中的水分。

2.1.2 對(duì)比分析 《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典費(fèi)休氏法差異見(jiàn)表2。

表2 費(fèi)休氏法對(duì)比表Tab 2 Comparison table of Karl Fischer method

2.1.2.1 收載情況 由于中藥成分復(fù)雜，干擾反應(yīng)的因素較多，因此,《中國(guó)獸藥典》僅一部中收載了費(fèi)休氏法?！睹绹?guó)藥典》將三種測(cè)定方法合并歸在滴定法項(xiàng)下，并分別進(jìn)行闡述。《英國(guó)藥典》根據(jù)樣品含水量的不同，將直接滴定法和剩余滴定法歸在半微量水分測(cè)定項(xiàng)下，將庫(kù)侖滴定法單獨(dú)歸在微量水分測(cè)定項(xiàng)下。

2.1.2.2 費(fèi)休氏滴定液的制備 《中國(guó)獸藥典》和《美國(guó)藥典》分別規(guī)定了費(fèi)休氏滴定液制備方法，但兩者在具體操作上略有不同，具體方法見(jiàn)表2?！队?guó)藥典》未規(guī)定費(fèi)休氏滴定液制備方法。考慮到容量法測(cè)定水分時(shí)，均需標(biāo)定費(fèi)休氏滴定液，且實(shí)際測(cè)定過(guò)程中多采用商品化費(fèi)休氏滴定液，因此筆者認(rèn)為各國(guó)藥典制備方法無(wú)需統(tǒng)一。

2.1.2.3 樣品 樣品量直接影響水分測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性，《中國(guó)獸藥典》和《美國(guó)藥典》庫(kù)侖法樣品量要求一致，均為0.5～5 mg。容量法中，《美國(guó)藥典》直接給出樣品含水量范圍，但范圍較寬，指導(dǎo)意義不強(qiáng)，但明確要求當(dāng)樣品為膠囊或片劑時(shí)，應(yīng)取不小于4個(gè)/片的樣品進(jìn)行測(cè)定，取樣更具代表性。《中國(guó)獸藥典》以消耗滴定液體積為標(biāo)準(zhǔn)更具實(shí)際意義，實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)所用費(fèi)休氏滴定液的F值計(jì)算出合適的樣品量?！队?guó)藥典》未對(duì)樣品量進(jìn)行規(guī)定。

2.1.2.4 費(fèi)休氏試液標(biāo)定 通過(guò)對(duì)比可知，《中國(guó)藥典》標(biāo)定方法單一，均采用純化水?！睹绹?guó)藥典》更靈活，可根據(jù)水分大小，選用更合適的標(biāo)定方法?！队?guó)藥典》標(biāo)定方法范圍更大，分析人員可根據(jù)實(shí)際情況自由選擇。

2.1.2.5 方法適用性 《中國(guó)獸藥典》和《美國(guó)藥典》未對(duì)測(cè)定方法適用性進(jìn)行要求?！队?guó)藥典》則更加嚴(yán)謹(jǐn)，要求對(duì)水分測(cè)定法準(zhǔn)確性進(jìn)行確認(rèn)，只有水分測(cè)定回收率符合要求，才能認(rèn)為方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 重量分析法

2.2.1 方法介紹 重量分析法是基于測(cè)定樣品失去水分前后重量差異的水分測(cè)定法。三部藥典中重量分析法共包括烘干法、減壓干燥法和干燥失重法。根據(jù)測(cè)定條件不同，烘干法適用于不含或少含揮發(fā)性成分的中藥，減壓干燥法適用于含有揮發(fā)性成分的貴重藥物，以及其他在高溫下易分解、變質(zhì)的樣品，干燥失重適用范圍較廣，但作為水分測(cè)定法時(shí)，應(yīng)確保樣品中不含其他揮發(fā)性成分。

2.2.2 對(duì)比分析 《中國(guó)獸藥典》與《美國(guó)藥典》重量分析法差異見(jiàn)表3，《英國(guó)藥典》未收載重量分析法。

表3 重量分析法對(duì)比Tab 3 Comparison table of gravimetric

2.2.2.1 收載情況 《中國(guó)獸藥典》二部收載烘干法和減壓干燥法，一部未收載重量分析法，但在附錄0661 熱分析法中介紹熱重法可用于藥物的水分測(cè)定，并且確保樣品中不含有其他揮發(fā)性成分。《美國(guó)藥典》方法III為重量分析法，其中分別規(guī)定了化學(xué)藥品、生物制品、植物藥的測(cè)定法?！队?guó)藥典》未在水分測(cè)定法下收載重量分析法，而是單獨(dú)列在附錄IX D 干燥失重法項(xiàng)下，并且未對(duì)干燥溫度、時(shí)長(zhǎng)、停止條件等進(jìn)行規(guī)定。

2.2.2.2 樣品 《中國(guó)獸藥典》中烘干法樣品量為2～5 g，減壓干燥法樣品量為0.5～1 g?！睹绹?guó)藥典》中干燥失重取樣量為1～2 g，植物藥取樣量為10 g。對(duì)比可知，中美兩部藥典烘干法取樣量差異較大，但均能滿足測(cè)定需求。

2.2.2.3 干燥溫度和停止條件 《中國(guó)獸藥典》和《美國(guó)藥典》干燥溫度基本一致，但停止條件不同。其中《中國(guó)獸藥典》以連續(xù)兩次稱重的差值不大于5 mg為限度，《美國(guó)藥典》以不超過(guò)0.25%為限度。結(jié)合樣品量計(jì)算，《中國(guó)獸藥典》停止條件相當(dāng)于兩次稱重之差在0.25%～0.1%，較《美國(guó)藥典》要求更為嚴(yán)格。

2.3 甲苯法

2.3.1 方法介紹 甲苯法利用水與甲苯沸點(diǎn)不同，密度不同且相互不溶等物理性質(zhì)，將樣品與甲苯混合蒸餾，水、揮發(fā)性成分可隨甲苯一同餾出。根據(jù)水在一定溫度時(shí)的相對(duì)密度和水分測(cè)定管水的體積讀數(shù)，可測(cè)得樣品的含水量。甲苯法適用于含揮發(fā)性成分且成分復(fù)雜的樣品，主要用于中藥水分測(cè)定。

2.3.2 對(duì)比分析 《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典甲苯法差異見(jiàn)表4。

表4 甲苯法對(duì)比Tab 4 Comparison table of gravimetric

《中國(guó)獸藥典》和美、英兩國(guó)藥典收載甲苯法內(nèi)容基本一致，均包括儀器，測(cè)定法，試劑等內(nèi)容，但在細(xì)節(jié)方面略有差異。在儀器方面，《美國(guó)藥典》不但介紹了儀器裝置的各組成部分，并且對(duì)尺寸也有明確要求，介紹的更為細(xì)致，能夠更好地規(guī)范測(cè)定法。在取樣量方面，《中國(guó)獸藥典》樣品量相當(dāng)于含水量1～4 mL，《美國(guó)藥典》的樣品量相當(dāng)于含水量2～4 mL，《英國(guó)藥典》的樣品量相當(dāng)于含水量2～3 mL,三部藥典雖略有差異，但均能保證讀數(shù)的準(zhǔn)確性。在試劑方面，均要求使用水飽和的甲苯，分析人員應(yīng)特別注意。

2.4 氣相色譜法 氣相色譜法是利用水蒸氣與乙醇在載氣和固定相間分配系數(shù)不同而分離，再以外標(biāo)法，按水峰峰面積計(jì)算樣品水分。氣相色譜法適用于氣體樣品、易揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)物質(zhì)的液體和固體的水分測(cè)定。目前，《中國(guó)獸藥典》2020年版僅有二部中辛夷采用該法測(cè)定水分。《美國(guó)藥典》和《英國(guó)藥典》在水分測(cè)定法下均未收載氣相色譜法。

3 建議與小結(jié)

3.1 建議費(fèi)休氏法引入方法確認(rèn) 現(xiàn)三部藥典均已收載費(fèi)休氏法，該方法具有專屬性強(qiáng)、分析速度快、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)?！吨袊?guó)獸藥典》《美國(guó)藥典》和《英國(guó)藥典》均對(duì)測(cè)定原理、儀器組成、操作方法、適用范圍等進(jìn)行闡述，但確保水分測(cè)定準(zhǔn)確的思路不同。《中國(guó)獸藥典》和《美國(guó)藥典》通過(guò)規(guī)范費(fèi)休氏滴定液制備方法、要求樣品含有一定量水分和準(zhǔn)確標(biāo)定費(fèi)休氏滴定液等方式使水分測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，而《英國(guó)藥典》通過(guò)調(diào)整方法關(guān)鍵參數(shù)，使回收率符合要求的方式保證水分測(cè)定準(zhǔn)確。近幾年工作中，多次遇到水分含量較低的樣品，對(duì)于這種樣品，盡管已使用市售F值最低的費(fèi)休氏試滴定液測(cè)定，也不能滿足消耗體積大于1 mL，但測(cè)定結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證是準(zhǔn)確可靠的。因此，筆者認(rèn)為通過(guò)調(diào)整方法關(guān)鍵參數(shù)，使回收率符合要求，進(jìn)而保證水分測(cè)定準(zhǔn)確的思路更為科學(xué)，而不應(yīng)該本末倒置，過(guò)分追求費(fèi)休氏滴定液消耗體積。

3.2 建議進(jìn)一步細(xì)化具體要求 《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典相比，收載測(cè)定法最多，分類最細(xì)，適用范圍最廣，但在細(xì)化要求方面仍有優(yōu)化空間。例如甲苯法中，建議增加儀器裝置具體規(guī)格，進(jìn)而更好指導(dǎo)分析人員選擇合適裝置；烘干法中，適用范圍為“不含或少含揮發(fā)性成分的中藥”，建議明確揮發(fā)性成分的限量，幫助分析人員選擇合適的測(cè)定法。

3.3 建議適當(dāng)引入新方法 近年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步與完善，許多新技術(shù)被應(yīng)用于水分測(cè)定。熱重法[6]是在程序控制溫度下，測(cè)量物質(zhì)質(zhì)量與溫度關(guān)系的技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，《美國(guó)藥典》2022年版已將此法用于亞胺培南等藥品的水分測(cè)定。微波法[7]是利用微波干燥樣品時(shí)，含水樣品引起能力消耗遠(yuǎn)大于干樣品引起的損耗，通過(guò)測(cè)定微波能量損耗即可求出樣品含水量，方法測(cè)定時(shí)間短，操作方便，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，目前主要用于糧食、石油等產(chǎn)品水分測(cè)定。紅外光譜法[8]是根據(jù)水分對(duì)某一波長(zhǎng)紅外光的吸收程度與其在樣品中含量存在一定的關(guān)系測(cè)定水分的方法。上述新方法可作為現(xiàn)有水分測(cè)定法的重要補(bǔ)充，也為獸藥中水分測(cè)定提供新的解決思路。

水分含量不僅是藥物研發(fā)階段的重要研究?jī)?nèi)容，也是評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。本文介紹了《中國(guó)獸藥典》與美、英兩國(guó)藥典中的水分測(cè)定法的收載情況以及測(cè)定原理，對(duì)比分析了三部藥典在儀器裝置、試劑、取樣量、方法適用性等方面的異同點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)我國(guó)獸藥水分測(cè)定法仍存在優(yōu)化和探討的空間，《中國(guó)獸藥典》可在上述方面對(duì)水分測(cè)定法進(jìn)行修訂。