陳康, 邢基, 張?jiān)讫? 程帆

膀胱癌是全球第十大常見腫瘤[1］, 發(fā)病率和病死率高[2］。膀胱癌90%為尿路上皮癌, 其中約75%為非肌層浸潤性癌, 25%為肌層浸潤性或轉(zhuǎn)移性膀胱癌[3］。非肌層浸潤性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%, 可發(fā)展為肌層浸潤性膀胱癌, 肌層浸潤性膀胱癌預(yù)后差, 5年總生存率小于50%, 一次切除后易復(fù)發(fā)[4］。以順鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療是局部晚期肌肉浸潤性膀胱癌的推薦療法[5］。然而, 大多數(shù)膀胱癌病人最終會(huì)產(chǎn)生順鉑耐藥性, 癌細(xì)胞會(huì)通過使凋亡因子失活并增強(qiáng)對抗凋亡信號的存活途徑而對化療產(chǎn)生抗性[6］。

隨著對腫瘤生物學(xué)認(rèn)識的進(jìn)步, 靶向治療已成為包括泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的各種惡性腫瘤的一線或二線治療選擇。此外, 越來越多的數(shù)據(jù)表明, 聯(lián)合使用靶向藥物是增強(qiáng)傳統(tǒng)化療抗腫瘤效果的一種很有前途的策略[7-8］。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號軸是一條主要的生存途徑, 其異常激活經(jīng)常參與包括浸潤性膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9］。此外, 一些研究已經(jīng)觀察到在腫瘤中, 抑制PI3K/AKT/mTOR通路可以增加順鉑的敏感性[10-11］。一些研究已經(jīng)評估和證明了PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑在臨床前或臨床環(huán)境下對膀胱癌的抗腫瘤作用[12-13］。然而, 很少有研究詳細(xì)檢驗(yàn)順鉑和PI3K/AKT/mTOR通路抑制抑制劑在人類膀胱癌中的協(xié)同作用。我們在2020年1月1日至2021年5月30日研究了口服生物利用咪唑喹啉衍生物PI3K/mTOR雙重抑制劑BEZ235協(xié)同順鉑對膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料人膀胱癌5637細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命研究所, RPMI-1640、胎牛血清磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自美國Hyclone公司, 其他化學(xué)品購自美國Corning公司, 抗體均購自美國Abcam公司。蛋白質(zhì)印跡法化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（gibco）和青霉素-鏈霉素（100 U/mL）的RPMI-1640中, 在37 ℃, 5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法細(xì)胞活力測定 用96孔板按每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種5637細(xì)胞, 在接種后24 h、48 h、72 h和96 h, 將CCK-8溶液按1∶10比例加入96孔板, 用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度。細(xì)胞生存率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.3 聯(lián)合用藥指數(shù)（combination index, CI）的計(jì)算 采用 CompuSyn（1.0.1）軟件分析兩藥的CI, CI小于1表示兩藥協(xié)同, 等于1表示兩藥效相加, 大于1表示兩藥拮抗。

1.2.4 細(xì)胞劃痕和細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 當(dāng)細(xì)胞在6孔板中達(dá)到90%融合時(shí), 用200 μL的吸管尖端劃傷細(xì)胞層。劃痕的圖像是在0、24和48 h拍攝的。24 h后, 觀察相同位置的劃痕傷口愈合情況, 并比較空白組、正常對照組和siRNA組的愈合情況。通過測量多個(gè)位置的劃痕寬度, 計(jì)算劃痕傷口愈合的平均速率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬×100%。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中, 收集3 000個(gè)轉(zhuǎn)染的人膀胱癌細(xì)胞（5637細(xì)胞）并轉(zhuǎn)移到上transwell小室。上室加入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基, 下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。48 h后用結(jié)晶紫染色, 熒光顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 集落形成試驗(yàn) 獲得藥物處理后的對數(shù)生長期的5637細(xì)胞, 將其中的500個(gè)均勻接種到六孔板中每兩天進(jìn)行換液。隨后, 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)10 d。當(dāng)形成肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí), 取出平板, 然后用PBS沖洗細(xì)胞兩次, 并用甲醇固定15 min。廢棄固定液后, 用結(jié)晶紫染色, 計(jì)算細(xì)胞的集落形成數(shù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法 蛋白酶抑制劑（Beyotime：貝約提姆, 中國）以1∶100的比例加入到總蛋白提取試劑（Solarbio, 中國）中, 并與培養(yǎng)的細(xì)胞混合。BCA法用于測量蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品與加載緩沖液混合, 并加載到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析, 將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上, 用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h；加入兔抗人上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）和波形蛋白單克隆抗體和鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）, 4 ℃反應(yīng)過夜；等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次后加入二抗, 并在室溫下以1∶5000的濃度孵育1 h。TBST洗膜3次后, 免疫印跡帶使用電化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒（中國蛋白科技）進(jìn)行可視化, 在Bio-Rad凝膠成像儀中觀察蛋白條帶。用Image Lab軟件分析蛋白條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示, 兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)的方法, 多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析, 多組間兩兩比較SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BEZ235和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合使用對5637細(xì)胞活性的影響CCK-8法檢測BEZ235和順鉑對膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用。用不同濃度BEZ235和順鉑處理5637細(xì)胞, 分別于0、1、2、3和4 d檢測細(xì)胞活力。如表1, 2所示, BEZ235和順鉑對5637細(xì)胞均以時(shí)間和劑量依賴的方式發(fā)揮抑制作用（均P＜0.05）。BEZ235和順鉑分別作用3 d后, 當(dāng)5637細(xì)胞的生長抑制率為50%時(shí), BEZ235和順鉑的濃度分別為98 nmol/L和1.1 μmol/L, 為了計(jì)算方便, 后續(xù)我們將使用100 nmol/L BEZ235和1 μmol/L順鉑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨后, 5637細(xì)胞分別經(jīng)25、50、100和200 nmol/L BEZ235以及0.1、0.5、1.0和2.0 μmol/L順鉑聯(lián)合處理, 計(jì)算聯(lián)合用藥的CI值, 結(jié)果如表3所示, 當(dāng)100 nmol/L BEZ235和0.1 μmol/L順鉑聯(lián)合用藥時(shí), CI值最小, 即兩藥的協(xié)同作用最強(qiáng)。

表1 順鉑對膀胱癌細(xì)胞5637的影響/±s

表1 順鉑對膀胱癌細(xì)胞5637的影響/±s

注：①與0 μmol/L組相比,P＜0.05。②與0.1 μmol/L組相比,P＜0.05。③與1.0 μmol/L組相比,P＜0.05。

順鉑濃度0 μmol/L 0.1 μmol/L 1.0 μmol/L 5.0 μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)9 999細(xì)胞活性（490 nm處吸光度）24 h 0.31±0.03 0.29±0.04 0.28±0.03 0.26±0.02 1.37 0.32 48 h 0.58±0.05 0.56±0.03①0.49±0.04①②0.25±0.03①②③46.78＜0.001 72 h 1.03±0.06 0.95±0.04①0.52±0.03①②0.23±0.02①②③260.6＜0.001 96 h 1.35±0.05 1.31±0.03①0.47±0.03①②0.21±0.01①②③922.46＜0.001

表3 BEZ235和順鉑對膀胱癌5637細(xì)胞的聯(lián)合用藥指數(shù)

2.2 BEZ235聯(lián)合順鉑可協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞的平板克隆形成BEZ235 和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理 5637細(xì)胞后, 應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的集落形成能力。結(jié)果如圖1顯示, 集落形成數(shù)：對照組為（207±9）個(gè), BEZ235單藥處理組為（146±10）個(gè), 順鉑單藥處理組為（179±11）個(gè), 兩藥聯(lián)合處理組為（103±9）個(gè)（F=76.81,P＜0.001）；BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理的5637細(xì)胞集落形成數(shù)顯著少于對照組（均P＜0.05）, 兩藥聯(lián)合處理的5637細(xì)胞集落形成數(shù)顯著少于各單藥處理組（均P＜0.05）。

圖1 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測BEZ235和順鉑聯(lián)合或單藥對膀胱癌5637 細(xì)胞集落形成能力的影響

2.3 BEZ235聯(lián)合順鉑可協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理 5637細(xì)胞后, 應(yīng)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果見圖2, 細(xì)胞遷移率：對照組為（70±5）%, BEZ235單藥處理組為（52±6）%, 順鉑單藥處理組為（53±4）%, 兩藥聯(lián)合處理組為（39±6）%（F=17.17,P＜0.001）；BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理的5637細(xì)胞的遷移率顯著少于對照組（均P＜0.05）, 兩藥聯(lián)合處理的5637的遷移率少于各單藥處理組（均P＜0.05）。

圖2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測BEZ235和順鉑聯(lián)合或單藥對膀胱癌5637 細(xì)胞遷移能力的影響

表2 BEZ235對膀胱癌細(xì)胞5637的影響/±s

表2 BEZ235對膀胱癌細(xì)胞5637的影響/±s

注：①與0 nmol/L組相比,P＜0.05。②與10 nmol/L組相比,P＜0.05。③與100 nmol/L組相比,P＜0.05。

BEZ235濃度0 nmol/L 10 nmol/L 100 nmol/L 500 nmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9細(xì)胞活性（490 nm處吸光度）24 h 0.28±0.02 0.26±0.03 0.25±0.04 0.24±0.03 0.93 0.47 48 h 0.52±0.04 0.47±0.05①0.28±0.02①②0.25±0.02①②③44.57＜0.001 72 h 0.88±0.05 0.74±0.03①0.42±0.02①②0.26±0.01①②③275.38＜0.001 96 h 1.26±0.07 0.86±0.04①0.46±0.02①②0.25±0.01①②③342.33＜0.001

2.4 BEZ235聯(lián)合順鉑可協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理5637細(xì)胞后, 應(yīng)用transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果如圖3顯示, 侵襲細(xì)胞數(shù)：對照組為（346±36）個(gè), BEZ235單藥處理組為（193±38）個(gè), 順鉑單藥處理組為（254±27）個(gè), 兩藥聯(lián)合處理組為（133±23）個(gè)（F=24.81,P＜0.001）；BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理5637細(xì)胞后, 穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組（均P＜0.05）, 兩藥聯(lián)合處理組穿過基質(zhì)膜的5637細(xì)胞數(shù)顯著少于各單藥處理組（均P＜0.05）。

圖3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測BEZ235和順鉑聯(lián)合或單藥對膀胱癌5637 細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色×200）

2.5 BEZ235和順鉑的聯(lián)合作用可調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理5637細(xì)胞后, 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的E-cadherin、Ncadherin和波形蛋白蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如表4所示, BEZ235和順鉑單藥及兩藥聯(lián)合處理5637細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平均高于對照組（均P＜0.05）, N-cadherin和波形蛋白的表達(dá)水平均低于對照組均P＜0.05）。兩藥聯(lián)合處理組的5637細(xì)胞中 E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著高于各單藥處理組（均P＜0.05）, N-cadherin和波形蛋白的表達(dá)水平均顯著低于各單藥處理組（均P＜0.05）。

表4 蛋白質(zhì)印跡法檢測BEZ235和順鉑聯(lián)合或單藥對膀胱癌5637細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白N-cadherin、E-cadherin和波形蛋白表達(dá)的影響/±s

表4 蛋白質(zhì)印跡法檢測BEZ235和順鉑聯(lián)合或單藥對膀胱癌5637細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白N-cadherin、E-cadherin和波形蛋白表達(dá)的影響/±s

注：N-cadherin為神經(jīng)鈣黏素, E-cadheri為上皮鈣黏素。①與對照組相比,P＜0.05。②與BEZ235組相比,P＜0.05。③與順鉑組相比,P＜0.05。

組別對照組BEZ235順鉑BEZ235+順鉑F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 N-cadherin 0.57±0.07 0.32±0.04①0.44±0.03①0.21±0.03①②③34.75＜0.001 E-cadherin 0.38±0.06 0.56±0.06①0.28±0.04①0.59±0.05①②③23.18＜0.001波形蛋白1.02±0.04 0.61±0.02①0.68±0.03①0.57±0.05①②③68.49＜0.001

3 討論

癌細(xì)胞的侵襲和隨后的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因[14］。許多研究表明, 與單一療法相比, 接受聯(lián)合療法的病人在治療腫瘤轉(zhuǎn)移等方面表現(xiàn)出良好的生存結(jié)果, 這使得聯(lián)合療法在癌癥治療方面有巨大潛力[15-16］。在很多腫瘤中, PI3K/Akt/mTOR通路被異常激活, 該通路抑制劑在不同腫瘤中被廣泛研究[17］。目前對晚期和轉(zhuǎn)移性尿路上皮膀胱癌病人的治療標(biāo)準(zhǔn)是基于順鉑的聯(lián)合化療, 但順鉑的耐藥性常限制了其使用[18］。

本研究通過CCK-8法驗(yàn)證了BEZ235 和順鉑單獨(dú)用藥時(shí)能抑制膀胱癌5637細(xì)胞的增殖, 當(dāng)不同濃度的BEZ235和順鉑聯(lián)用時(shí), 多種濃度組合均表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用, 當(dāng)100 nmol/L BEZ235與0.1 μmol/L順鉑聯(lián)用時(shí), 兩者的聯(lián)合用藥指數(shù)CI值最小, 表明此時(shí)兩者的協(xié)同作用能力最強(qiáng)。為了驗(yàn)證BEZ235和順鉑的協(xié)同作用, 在接下來的實(shí)驗(yàn)中, 我們使用100 nmol/L BEZ235與0.1 μmol/L順鉑單獨(dú)或者聯(lián)合作用于5637細(xì)胞。平板克隆形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, BEZ235聯(lián)合順鉑可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示, BEZ235聯(lián)合順鉑可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

為了探究BEZ235和順鉑協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的具體機(jī)制, 我們進(jìn)一步研究了BEZ235和順鉑與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的潛在關(guān)聯(lián), 例如上皮標(biāo)志物：E-cadherin, 間質(zhì)標(biāo)志物：N-cadherin和波形蛋白。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞失去極性而成為間質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)過程, 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化會(huì)賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力, 使惡性腫瘤細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移傾向[19-20］。E-cadherin蛋白表達(dá)與細(xì)胞的黏附力有關(guān), E-cadherin蛋白的高表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[21］, 而N-cadherin和波形蛋白的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[22］。本研究發(fā)現(xiàn), BEZ235和順鉑兩藥聯(lián)合時(shí)可顯著抑制N-cadherin和波形蛋白的表達(dá), 并能顯著上調(diào)E-cadherin的表達(dá), 表明BEZ235聯(lián)合順鉑可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述, BEZ235和順鉑能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲, 并且兩種藥物能夠協(xié)同通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲, 使抗腫瘤效果更為顯著。本研究為臨床膀胱癌病人的靶向治療提供了聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ), 也為解決順鉑在膀胱癌中的耐藥難題提供新的思路。