陳秋岑, 孫治中, , 吳偉, , 黃龐寧, 吳輝,

心血管疾病是全球致死率最高的疾病, 隨著我國人口老齡化加劇, 生活方式的改變, 我國心血管疾病的發(fā)生率逐年升高, 心血管疾病的最主要病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化[1］。動脈粥樣硬化是一種主要發(fā)生在中大動脈的慢性炎癥, 在內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤、平滑肌增殖遷移等因素的共同作用下形成粥樣斑塊, 斑塊的不斷進展增大導(dǎo)致的動脈管腔狹窄或由于斑塊不穩(wěn)定破裂引起的動脈血流中斷, 是心血管疾病的主要原因。目前針對動脈粥樣硬化的治療主要是使用他汀類的藥物降脂穩(wěn)斑, 以及抗血栓治療。中醫(yī)藥治療動脈粥樣硬化相關(guān)的心血管疾病具有良好的療效良好且毒副作用更小, 在臨床應(yīng)用日益廣泛。清熱活血方是廣東省名中醫(yī)吳偉教授, 在陳可冀院士創(chuàng)立的冠心病2號方（川芎、赤芍、降香、紅花、丹參）的基礎(chǔ)上, 結(jié)合嶺南地區(qū)氣候濕熱, 心血管病人病機多為熱毒血瘀的基礎(chǔ)上加上黃芩、毛冬青所創(chuàng)。研究表明清熱活血方對于冠狀動脈粥樣硬化性疾病的多種分型具有良好的臨床效果[2-3］。相較于傳統(tǒng)基礎(chǔ)研究, 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這種“多成分-多靶點”的研究模式更適合于探究中醫(yī)藥治療疾病機制。本研究于2020年12月至2021年2月擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法, 探究清熱活血方治療動脈粥樣硬化的分子機制。

1 資料與方法

1.1 清熱活血方成分及靶點搜集在BAT-MAN數(shù)據(jù)庫的中藥模塊對清熱活血方中7味中藥分別進行檢索, 獲取中藥的活性成分。并使用網(wǎng)站內(nèi)置分子匹配系統(tǒng), 設(shè)置（P＜0.05, score＞20）作為匹配篩選條件, 獲取活性成分對應(yīng)的預(yù)測靶點, 并使用Excel2019進行匯總整理。

1.2 粥樣硬化靶點搜集并篩選核心節(jié)點使用“atherosclerosis”作為檢索詞, 在Gencards數(shù)據(jù)庫中查找與動脈粥硬化相關(guān)的靶點, 并使用Excel進行整理, 作為動脈粥樣硬化的相關(guān)靶點。

1.3 藥物疾病共同靶點及核心節(jié)點的篩選使用Excel數(shù)據(jù)分析中重復(fù)值標記功能, 將清熱活血方的預(yù)測靶點與動脈粥樣硬化的相關(guān)靶點在去除重復(fù)值后取交集進行標記, 即得到清熱活血方治療動脈粥樣硬化的相關(guān)靶點。將這些靶點導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫, 選擇物種為“人”, 獲取這些靶點之間的相互作用關(guān)系, 并以Excel的格式導(dǎo)出。使用Cytoscape 6.1軟件打開, 得到靶點之間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò), 然后使用軟件內(nèi)置數(shù)據(jù)分析功能, 計算出網(wǎng)絡(luò)中每個靶點的拓撲參數(shù)值, 使用連接度（degree）的2倍中位數(shù)作為條件, 選擇出大于2倍中位數(shù)的點作為核心節(jié)點。并構(gòu)建核心節(jié)點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖使用核心靶點在清熱活血方成分靶點對應(yīng)Excel中反向找出對應(yīng)的成分, 將對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 6.1, 構(gòu)建清熱活血方治療動脈粥樣硬化的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖, 并計算網(wǎng)絡(luò)中活性成分的拓撲參數(shù), 依據(jù)degree值選取主要的活性成分。

1.5 基因本體論（GO）與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析使用DAVID網(wǎng)站對核心靶點進行GO和KEGG通路富集分析, 將原始分析數(shù)據(jù)導(dǎo)出。依據(jù)Omicshare要求的格式分別對GO分析的結(jié)果和KEGG的結(jié)果進行整理。使用富集圈圖對GO富集結(jié)果進一步分析并繪制富集圈圖。使用高級氣泡圖對KEGG富集結(jié)果進一步分析繪制高級氣泡圖。

1.6 分子對接選degree值排名前五的核心靶點與degree排名前10的活性成分進行分子對接。首先在PDB數(shù)據(jù)庫中查詢靶點的三維結(jié)構(gòu)并保存。運用Auto Dock Vina對活性成分和靶點進行分子對接, 逐一記錄結(jié)合能。使用Grahpad對分子對接結(jié)果進行處理分析繪制熱圖, 并選取出結(jié)合能最高的兩組進行分子對接三維結(jié)構(gòu)展示。

2 結(jié)果

2.1 清熱活血方成分靶點的搜集經(jīng)過檢索清熱活血方7味中藥的活性成分結(jié)果如下：黃芩17個, 毛冬青2個, 川芎78個, 丹參37個, 紅花20個, 赤芍3個, 降香2個匯總排除重復(fù)值后, 共得到149個活性成分。對149個活性成分的靶點進行搜集匯總, 排除重復(fù)值得到1 241個預(yù)測靶點。

2.2 藥物疾病共同靶點及核心節(jié)點的篩選通過Genecards共檢索到與動脈粥樣硬化相關(guān)的靶點4 683個, 通過Excel與清熱活血方的預(yù)測靶點取交集, 共得到614個清熱活血方治療動脈粥樣硬化相關(guān)的靶點。通過String數(shù)據(jù)庫獲取614個靶點之間的相互作用關(guān)系, 然后導(dǎo)入Cytoscape 6.1進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析, 以大于degree值的2倍中位數(shù)篩選出116個核心靶點, 依據(jù)degree值的大小設(shè)置靶點的面積和顏色, degree值越大點的面積越大顏色越深, 見圖1。主要的靶點包括蛋白激酶B1（Akt1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、載脂蛋白E1（APOE1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）。

圖1 清熱活血方治療動脈粥樣硬化核心靶點蛋白作用關(guān)系圖

2.3 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖將116個核心點對應(yīng)的活性成分找出, 共得到107個對應(yīng)的活性成分, 將對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 6.1進行成分靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。并選出degree值排名前十的成分列舉出二維結(jié)構(gòu), 與動脈粥樣硬化關(guān)系比較密切的活性成分是丹參酮Ⅱ、丹參醌B、γ-谷甾醇、丹參酚醌、咖啡酸二甲醚、黃芩苷、香葉烯、川芎內(nèi)酯、共軛亞油酸、鐵銹醇, 見圖2。

圖2 清熱活血方治療動脈粥樣硬化連接度（degree）值排名前十個成分

2.4 GO富集分析依據(jù)DAVID對116個核心節(jié)點的GO富集結(jié)果, 根據(jù)富集基因數(shù)目作為篩選條件, 并排除無特異性的基本生物代謝過程, 選取前20條通路。其中BP包含7條：平滑肌細胞增殖的積極調(diào)節(jié)、趨化因子生物合成過程的積極調(diào)控、內(nèi)皮細胞增殖的積極調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、一氧化氮合酶活性的積極調(diào)節(jié)、脂肪細胞分化的負調(diào)節(jié)、內(nèi)皮細胞遷移的積極調(diào)節(jié)；CC包含6條：蛋白質(zhì)復(fù)合物、溶酶體、細胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、內(nèi)吞囊泡腔、乳糜微粒；MF包含7條：細胞因子活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、核因子κB（NF-κB）結(jié)合、載脂蛋白A-I受體結(jié)合、脂蛋白顆粒結(jié)合、載脂蛋白結(jié)合、膽固醇轉(zhuǎn)運體活性。見表1。整理格式后使用Omicshare繪制富集圈圖, 見圖3。

表1 GO富集分析通路名稱

圖3 清熱活血方治療動脈粥樣硬化基因本體論（GO）富集分析圈圖

2.5 KEGG富集分析對核心節(jié)點的KEGG富集分析結(jié)果顯示共有117條通路, 經(jīng)過排除疾病、感染等無關(guān)通路后, 篩選后的通路共11條, 并使用Omicshare進行高級氣泡圖繪制, 見圖4。清熱活血方治療動脈粥樣硬化的主要通路為：TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、VEGF信號通路、AMPK信號通路、Jak-STAT信號通路、調(diào)節(jié)脂肪細胞中的脂肪分解、PPAR信號通路。

圖4 清熱活血方治療動脈粥樣硬化京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集高級氣泡圖

2.6 分子對接對degree值前5個核心靶點與degree值前10的活性成分進行分子對接, 來驗證結(jié)論的可信度, 結(jié)果顯示, 超過-5 kcal/mol結(jié)合能的對接組合有35組, 表明整體結(jié)合情況良好, 見圖5。結(jié)果可信度較高, 其中結(jié)合能最高的是丹參酮Ⅱ和TGFβ1（-9.1 kcal/mol）與黃芩苷和TNF（-9.3 kcal/mol）, 見圖6。

圖5 清熱活血方治療動脈粥樣硬化連接度（degree）值前5個核心靶點與degree值前10的活性成分的分子對接驗證結(jié)果

圖6 清熱活血方治療動脈粥樣硬化結(jié)合能最高的兩組對接信息：6A為丹參酮Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）；6B為黃芩苷和腫瘤壞死因子（TNF）

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ), 是現(xiàn)代臨床高發(fā)病、常見病。在中醫(yī)理論中并沒有確切對應(yīng)的病名, 近年來結(jié)合斑塊形成的病理發(fā)展過程, 中醫(yī)學(xué)者提出“脈癰”這一名詞來對應(yīng)動脈粥樣硬化[4］, 主張動脈粥樣硬化也是由于痰濁氣血瘀滯, 最終聚而化熱, 熱瘀肉腐而在脈上形成類似癰瘡的斑塊。吳偉教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗認為, 由于嶺南地區(qū)多濕多熱的氣候特點, 現(xiàn)代人飲食多肥甘厚味, 嶺南地區(qū)動脈粥樣硬化的主要病因病機是熱毒血瘀, 基于冠心病的二號方加減出清熱活血方。方中黃芩、毛冬青清熱解毒, 丹參、川芎、紅花、降香行氣活血止痛, 赤芍清熱涼血, 全方共奏清熱解毒, 行氣活血之效。

基于成分分析結(jié)果, 清熱活血方治療動脈粥樣硬化的主要成分是丹參酮Ⅱ、黃芩苷、川芎內(nèi)酯、亞油酸等。丹參酮Ⅱ作為丹參的主要提取物, 近年來, 其在動脈粥樣硬化方面的有效性也不斷被證實, 孫維梁等[5］通過26周的對照實驗發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以有效改善高脂飼養(yǎng)Apo E-/-小鼠的頸動脈斑塊的進展。研究表明丹參酮Ⅱ可以減低血漿纖維蛋白原及C反應(yīng)蛋白水平, 能保護血管內(nèi)皮, 減少內(nèi)皮的氧化應(yīng)激反應(yīng), 可以下調(diào)MAPK與NF-κB等炎癥通路表達[6-7］。黃芩苷對內(nèi)皮細胞具有保護作用, 動物實驗發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以有效降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性, 抑制血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）及其他κB表達, 從而實現(xiàn)抗動脈粥樣硬化作用[8］；辛來運等指出黃芩苷的保護機制還包括抑制巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞, 抑制平滑肌遷移, 同時, 黃芩苷在纖溶系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面也有積極作用[9］。川芎內(nèi)酯可以促進內(nèi)皮細胞修復(fù)、減少氧化應(yīng)激, 此外川芎內(nèi)酯還可以通過抑制TNF表達來發(fā)揮抗炎效應(yīng)[10］。共軛亞油酸可以改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝水平, 降低膽固醇, 減少斑塊形成[11］。

核心靶點中主要有Akt、TNF、APOE1、IL6、TGFβ1、NOS等。TGF-β1是重要的免疫調(diào)節(jié)因子之一, 可以抑制炎癥反應(yīng), 來抑制粥樣硬化的發(fā)生[12］。Akt的激活會參與內(nèi)皮細胞的破壞、炎癥反應(yīng)[13］。TNF是一種重要的炎性因子, 研究表明TNF可以損傷內(nèi)皮細胞、促進炎癥細胞的聚集、激活炎癥細胞釋放更多細胞因子, 在動脈粥樣硬化炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[14-16］。APOE1是高密度脂蛋白的主要成員占比超過70%, 是將低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運至肝臟的主要載體, 對于抑制斑塊的形成起著十分關(guān)鍵的作用[17］。IL-6是一種多種炎癥細胞均可以分泌的細胞因子, IL-6除可以加劇斑塊局部的炎癥之外, 還有研究表明IL-6可以誘導(dǎo)平滑肌的增生與遷移, 并且可以促進金屬蛋白酶的釋放導(dǎo)致斑塊轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定斑塊[18］。NOS磷酸化后會產(chǎn)生NO, NO是體內(nèi)最強的血管擴張劑, 同時NO可以抑制炎癥反應(yīng), 并能抑制平滑肌增生[19］。

前期動物實驗通過丹參多酚酸鹽干預(yù)治療動脈粥樣硬化模型大鼠, 發(fā)現(xiàn)藥物治療組大鼠的TNFα、IL-6、P-selectin水平均下降, 信號通路TLR4、MyD88以及NF-κB的表達均減少, 同時還提出藥物的劑量可能與NF-κB的表達呈現(xiàn)負相關(guān)[20］。證實了丹參提取物可以明顯降低高脂大鼠TNF以及IL-6表達水平, 抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定粥樣斑塊, 從而實現(xiàn)對動脈粥樣硬化病的有效治療。實驗所使用的藥物, 與清熱活血湯的主要藥物成分丹參相一致, 實驗結(jié)果中TNF-α、IL-6同時也是清熱活血湯的主要作用靶點之一, 證實清熱活血湯在抗動脈粥樣硬化方面的作用是真實有效的。

GO富集的結(jié)果中BP分析主要集中在內(nèi)皮細胞的增生與保護, 抑制炎癥反應(yīng)與平滑肌增生, 同時調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝過程；CC分析主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白合成的調(diào)節(jié), 溶酶體的合成等于細胞凋亡及κB合成相關(guān)的方面；MF分析的結(jié)果集中在脂質(zhì)代謝, NO的生成等。KEGG富集分析的通路包括炎癥相關(guān)通路、內(nèi)皮生成通路及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路。其中Toll樣信號受體通路中的TRL4是激活NF-κB通路的重要因子, NF-κB是多種炎癥的激活因子[21］, 能激活TNF等相關(guān)通路, 引起內(nèi)皮功能破壞、炎癥細胞聚集加劇炎癥反應(yīng), 此外TRL4本身也能促進巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)變[22］。TNF可以激活Jak-STAT 引發(fā)炎癥反應(yīng), 可以破壞內(nèi)皮功能, 引起內(nèi)皮細胞凋亡[23-24］。MAPK通路是一種炎癥通路, 參與多個炎癥過程的發(fā)生, 還可以激活平滑肌細胞的增殖, 加劇動脈粥樣硬化[25］。VEGF是血管生成的主要通路, 促進內(nèi)皮的增殖修復(fù)。PPAR通路是促進白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)變的通路, 促進脂肪的燃燒代謝, 從而檢索斑塊中脂肪積聚[26］。

綜上所述, 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多成分-多靶點分析結(jié)果顯示, 清熱活血方抗動脈粥樣硬化的機制是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進內(nèi)皮細胞的增殖以及改善脂質(zhì)代謝與運輸?shù)确矫娴墓餐饔?；結(jié)合清熱活血湯的現(xiàn)代臨床試驗結(jié)果, 充分證明了清熱活血湯對治療動脈粥樣硬化性疾病的科學(xué)性和有效性。最后, 分子對接的結(jié)果提示, 本研究的結(jié)果可信度較好, 為今后開展相關(guān)基礎(chǔ)實驗可以提供一定參考依據(jù)。