彭思雯， 關(guān)貴文， 張 婷， 魯鳳民， 劉 佳， 陳香梅

北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系暨感染病研究中心， 北京 100191

HBV感染是全球重要公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。但由于對HBV生命周期的認(rèn)識還不夠充分，目前尚缺乏有效治愈慢性乙型肝炎(CHB)的藥物。因此，深入解析HBV復(fù)制的調(diào)控機制，將為抗HBV新藥物研發(fā)提供有效靶點。

HBV屬嗜肝DNA病毒科病毒，基因組為部分雙鏈的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)，其復(fù)制過程有著獨特的逆轉(zhuǎn)錄步驟[3]。研究[4-5]表明，HBV的復(fù)制依賴于肝細(xì)胞的細(xì)胞周期。例如，HBV在靜止肝細(xì)胞中的復(fù)制更為活躍，而在細(xì)胞開始分裂時復(fù)制減慢。細(xì)胞周期素D1(cyclin D1，基因名CCND1)是細(xì)胞周期進(jìn)程的正性調(diào)節(jié)因子，可通過結(jié)合并激活細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)4、6，促進(jìn)細(xì)胞由靜止期(G0)或間期1(G1)進(jìn)入DNA合成期(S)。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，cyclin D1在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中呈異常高表達(dá)，但cyclin D1是否影響HBV復(fù)制目前尚未見報道。本研究通過挖掘公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)以及應(yīng)用HBV復(fù)制細(xì)胞模型，探究cyclin D1對HBV復(fù)制的影響，并對其調(diào)控HBV復(fù)制的可能機制進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2購自美國ATCC數(shù)據(jù)庫，Huh-7細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。pFLEX-cyclin D1-T286A、pGL3-HBV BCP、Actin-Renilla和pGL3-basic質(zhì)粒為本室前期保存構(gòu)建。prcccDNA/pCMV-Cre重組質(zhì)粒系統(tǒng)由prcccDNA質(zhì)粒和pCMV-Cre表達(dá)質(zhì)粒組成[8]，為復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院鄧強教授惠贈。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HepG2和Huh-7細(xì)胞均采用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃和含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1天，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞按1.5×105個/孔接種至12孔板，其中HepG2細(xì)胞接種前需鋪好鼠尾膠原。按照LipofectamineTM2000(購自美國Invitrogen公司)說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞沉淀用于后續(xù)實驗研究。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建 采用同源重組的方法構(gòu)建pCMV-cyclin D1表達(dá)質(zhì)粒，其中擴(kuò)增cyclin D1編碼區(qū)的引物序列為：上游5′-ATTGTACCCGCGGGCCATGGAACACCAGCTCCTGTGC-3′，下游5′-GGATCCCCGCGGCCGCGTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATC-3′。cyclin D1持續(xù)激活突變體表達(dá)質(zhì)粒pCMV-cyclin D1-T286A是在pFLEX-cyclin D1-T286A質(zhì)?；A(chǔ)上，采用雙酶切連接的方法構(gòu)建而成。上述質(zhì)粒DNA的序列均經(jīng)測序驗證[測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成]。

1.4 HBsAg和HBeAg檢測 使用時間分辨免疫熒光法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg，檢測試劑盒購自蘇州新波生物技術(shù)公司。所用檢測設(shè)備為SYM-BIO Anytest時間分辨熒光分析儀(上海新波生物技術(shù)有限公司)。

1.5 HBV DNA定量檢測 細(xì)胞培養(yǎng)上清用3000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清首先進(jìn)行95 ℃加熱10 min，使病毒蛋白變性，然后使用Light Cycle 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀和羅氏2×SYBR Green Mix進(jìn)行HBV DNA相對定量檢測。上游引物序列為5′-CGGCGTTTTATCATMTTCCTCT-3′，下游引物序列為5′-GACAAACGGGCAACATACCTT-3′。

1.6 反轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR(RT-qPCR)實驗 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國羅氏公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL cDNA為模板，使用2×SYBR Green Mix(購自美國羅氏公司)進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HBV mRNA表達(dá)水平，以管家基因ACTIN作為內(nèi)參。HBV RNA檢測所用引物序列如下：3.5 kb HBV RNA上游引物為5′-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3′，下游引物為5′-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTC-3′，可檢測pgRNA和preC mRNA兩種RNA；preC mRNA上游引物為5′-TCTGCGCACCAGCACCATG-3′，下游引物為5′-CAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC-3′。宿主基因APOBEC3G上游引物為5′-GCATCGTGACCAGGAGTATGA-3′，下游引物為5′-GTCAGGGTAACCTTCGGGT-3′；?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)上游引物為5′-AAGGACAAGGTGCCCTATAAAGG-3′，下游引物為5′-TTGAGGACGATCCCTATGGTG-3′；肝細(xì)胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)上游引物為5′-AACACCTCAACAAGGGCACTC-3′，下游引物為5′-CCCCACTTGAAACGGTTCCT-3′；染色體結(jié)構(gòu)維持復(fù)合物5(structural maintenance of chromosome 5, SMC5)上游引物為5′-TCCCGAGAGACCCTTCGTC-3′，下游引物為5′-TTCCATTGGCTCCAACGATCA-3′；叉頭盒轉(zhuǎn)錄基因M1(forkhead box M1, FOXM1)上游引物為5′-ATACGTGGATTGAGGACCACT-3′，下游引物為5′-TCCAATGTCAAGTAGCGGTTG-3′；ACTIN的上游引物為5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，下游引物為5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。

1.7 Western blot實驗 收集細(xì)胞沉淀，加入約細(xì)胞體積3倍的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g、4 ℃離心10 min后取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，按各抗體說明書使用量稀釋后加入適量一抗4 ℃搖床雜交過夜，加入二抗(二抗原液按1∶8000稀釋)室溫孵育2 h。使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LICOR公司)和Odyssey V1.2軟件進(jìn)行雜交膜的掃描和分析。

1.8 雙熒光素酶活性檢測 為了確定cyclin D1對HBV基本核心啟動子(BCP)活性的影響，將帶有HBV BCP區(qū)的pGL3熒光素酶報告載體(pGL3-HBV BCP)與pCMV-cyclin D1或pCMV-cyclin D1-T286A共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，同時共轉(zhuǎn)Actin-Renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參對照。轉(zhuǎn)染48 h后，使用Dual Luciferase Reporter Assay試劑盒中的Passive Lysis Buffer裂解細(xì)胞，吸取25 μL上清檢測螢火蟲和海腎螢光素酶活性，以螢火蟲/海腎的比值表示報告基因的活性。所用設(shè)備為多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司)。

1.9 數(shù)據(jù)下載與分析 在GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE84044和GSE83148[9-10]。GSE84044收錄了124例HBV相關(guān)肝纖維化患者肝組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，GSE83148收錄了122例CHB患者肝組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過limma包[11]，對下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化處理。在分析與HBV DNA相關(guān)的宿主基因時，選擇了GSE84044數(shù)據(jù)集中性別為男性且血清HBV DNA載量大于104拷貝/mL的患者共計59例。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism V5.0、R(v4.1.3)[12]及SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關(guān)性分析時采用Spearman秩相關(guān)，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)<0.05且|r|>0.3被定義為顯著相關(guān)基因。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織CCND1表達(dá)水平與血清HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān) 通過分析GSE84044數(shù)據(jù)集中59例男性HBV相關(guān)肝纖維化患者肝組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共找到了765個表達(dá)水平與患者血清HBV DNA水平顯著相關(guān)的宿主基因(FDR<0.05，|r|>0.3，圖1a)。通過與116個細(xì)胞周期基因(ko04110)取交集，發(fā)現(xiàn)其中有7個基因為細(xì)胞周期相關(guān)基因，且這7個基因在肝臟中的表達(dá)水平均與血清HBV DNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)(FDR<0.05，r值均<-0.3，P值均<0.05)(圖1a、1b)，按相關(guān)性由強到弱排序依次為MYC、TGFB1、CCND1、YWHAZ、HDAC1、YWHAB和E2F3。其中，CCND1是調(diào)控細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子，其表達(dá)水平與HBV DNA載量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.474，P<0.001)(圖1c)。

注：a，GSE84044數(shù)據(jù)集中與患者HBV DNA載量相關(guān)的肝組織宿主基因，樣本按照HBV DNA載量的高低從左到右排列，藍(lán)色代表低表達(dá)，紅色代表高表達(dá)；b，765個與HBV DNA載量顯著相關(guān)基因和116個細(xì)胞周期基因的交集；c，肝組織中CCND1水平與血清HBV DNA載量之間的相關(guān)性分析。

2.2 外源表達(dá)cyclin D1抑制HBV復(fù)制 為探究cyclin D1蛋白對HBV復(fù)制的影響，構(gòu)建了pCMV-cyclin D1和pCMV-cyclin D1-T286A表達(dá)質(zhì)粒，并將上述質(zhì)粒分別與prcccDNA/pCMV-Cre質(zhì)粒體系共同轉(zhuǎn)染至HepG2及Huh-7細(xì)胞中，72 h后收集細(xì)胞沉淀和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。Western blot實驗證實pCMV-cyclin D1和pCMV-cyclin D1-T286A表達(dá)質(zhì)粒均可在兩種細(xì)胞中成功表達(dá)，且cyclin D1和cyclin D1(T286A)過表達(dá)均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)HBV core蛋白水平(圖2a、2b)。與此結(jié)果一致，過表達(dá)cyclin D1和cyclin D1(T286A)亦顯著下調(diào)了兩種細(xì)胞上清液中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平(圖 2c、d)。

注：a、b，外源表達(dá)cyclin D1降低HepG2和Huh-7細(xì)胞HBV core蛋白的水平；c、d，外源表達(dá)cyclin D1下調(diào)HepG2和Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg、HBeAg與HBV DNA水平。

2.3 外源表達(dá)cyclin D1在轉(zhuǎn)錄水平抑制HBV復(fù)制 為了探究cyclin D1蛋白抑制HBV復(fù)制的可能環(huán)節(jié)，采用RT-qPCR方法，在HepG2細(xì)胞中檢測了cyclin D1和cyclin D1(T286A)對HBV RNA水平的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)cyclin D1和cyclin D1(T286A)均可顯著抑制HepG2細(xì)胞中HBV的3.5 kb mRNA及preC mRNA水平(圖3a)。與此一致，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，過表達(dá)cyclin D1和cyclin D1(T286A)均顯著抑制了HBV BCP啟動子活性(圖3b)。

注：a，RT-qPCR檢測cyclin D1和cyclin D1(T286A)過表達(dá)對HepG2細(xì)胞內(nèi)HBV RNA的影響；b，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測過表達(dá)cyclin D1和 cyclin D1(T286A)對HBV BCP啟動子活性的影響。

2.4 cyclin D1通過下調(diào)HNF1α和NTCP表達(dá)抑制HBV復(fù)制 為了進(jìn)一步探究cyclin D1抑制HBV復(fù)制的可能機制，利用GSE83148數(shù)據(jù)集中122例CHB患者的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了CCND1與10個已報道調(diào)控HBV復(fù)制的重要宿主基因的相關(guān)性(圖4a)。結(jié)果顯示，CCND1水平與抑制HBV復(fù)制的APOBEC3G(r=0.575，P<0.001)、SMC5(r=0.341，P<0.001)和FOXM1(r=0.333，P<0.001)表達(dá)呈顯著正相關(guān)，而與HBV進(jìn)入受體NTCP(r=-0.511，P<0.001)和HBV復(fù)制正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子HNF1α(r=-0.430，P<0.001)表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。采用RT-qPCR方法，對與CCND1表達(dá)相關(guān)性較高的APOBEC3G、NTCP、HNF1α、SMC5和FOXM1進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)cyclin D1降低了HNF1α(P<0.001)和NTCP(P<0.01)的 RNA水平，同時也抑制APOBEC3G和SMC5表達(dá)(圖4b)。

注：a，CHB肝組織中CCND1與多個HBV調(diào)控基因的表達(dá)相關(guān)矩陣；b，RT-qPCR方法檢測cyclin D1對HepG2細(xì)胞內(nèi)APOBEC3G、NTCP、HNF1α、SMC5和FOXM1表達(dá)的影響。

3 討論

病毒需要依附活細(xì)胞才能完成其生命周期，故病毒與宿主細(xì)胞之間存在大量互作調(diào)控。已有研究[4]報道，HBV復(fù)制依賴于細(xì)胞周期，肝細(xì)胞的快速增殖可以抑制HBV復(fù)制，但其機制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白cyclin D1可以抑制HBV復(fù)制，機制上可能與cyclin D1抑制HNF1α和NTCP表達(dá)有關(guān)。

已有研究[4]發(fā)現(xiàn)，HBV感染能使原代肝細(xì)胞富集于G2/M期，同時促HBV復(fù)制的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如PPARA、RXRA和CEBPB等也在HBV感染時上調(diào)，表明HBV復(fù)制可能更易在增殖抑制的肝細(xì)胞中復(fù)制。在增殖旺盛的肝癌組織中，HBV cccDNA及HBV復(fù)制水平則顯著低于癌旁組織，進(jìn)一步證實增殖的肝細(xì)胞不利于病毒復(fù)制[13]。與上述發(fā)現(xiàn)一致，本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，有7個細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)與患者血清HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，分別為MYC、TGFB1、CCND1、YWHAZ、HDAC1、YWHAB和E2F3。其中，已有文獻(xiàn)報道MYC[14]及TGFB1[15]可以通過不同機制抑制HBV的復(fù)制，這與本研究的分析結(jié)果相符合。HDAC抑制劑[5]如FK228/SAHA以及敲減HDAC1基因，均可通過上調(diào)p21誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)HBV復(fù)制。但CCND1、YWHAZ、YWHAB和E2F3是否影響HBV復(fù)制目前未見報道。

CCND1基因編碼的蛋白產(chǎn)物為cyclin D1。cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子。cyclin D1可與CDK4/6形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)使RB蛋白磷酸化，并使后者失去對轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制，進(jìn)而上調(diào)cyclin E、cyclin A的表達(dá)，從而啟動細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)換。cyclin D1主要經(jīng)泛素-蛋白酶體系降解，其出核主要由出核運輸?shù)鞍證RM1介導(dǎo)[16]，CRM1與cyclin D1結(jié)合依賴于cyclin D1第286位蘇氨酸(T286)磷酸化[17]。當(dāng)T286A突變導(dǎo)致該磷酸化基序丟失時，突變cyclin D1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，可促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)外源cyclin D1及cyclin D1(T286A)突變體均能顯著抑制HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平，以及細(xì)胞內(nèi)HBV RNA和HBV core蛋白水平，表明cyclin D1能抑制HBV復(fù)制。HBV BCP啟動子主要調(diào)控3.5 kb mRNA的轉(zhuǎn)錄，其中pgRNA既可作為mRNA翻譯合成病毒core蛋白和P蛋白，也可作為反轉(zhuǎn)錄的模板在核衣殼內(nèi)合成rcDNA，而preC mRNA則主要翻譯外泌的HBeAg。本研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1能顯著抑制BCP區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性，提示cyclin D1可在轉(zhuǎn)錄水平抑制HBV復(fù)制。筆者團(tuán)隊也注意到，cyclin D1及cyclin D1(T286A)突變體對HBV復(fù)制的抑制作用未見明顯不同，且二者對HepG2和Huh7細(xì)胞增殖的影響也不大，可能與本研究采用的HBV復(fù)制模型是增殖速度較快的肝癌細(xì)胞株有關(guān)，未來需要在原代肝細(xì)胞中加以驗證。

目前認(rèn)為，細(xì)胞周期影響HBV復(fù)制的機制主要有3個方面：(1)抑制HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的功能性受體NTCP表達(dá)，從而抑制HBV的從頭感染[13,18]；(2)影響HBV復(fù)制調(diào)控分子的表達(dá)，如HNF4α、RXRA和CEBPB等[4]，從而抑制HBV基因的轉(zhuǎn)錄；(3)影響HBV的成熟和釋放[19-20]。本研究通過對數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CHB患者肝組織中的CCND1與APOBEC3G、SMC5和FOXM1呈顯著正相關(guān)，而與NTCP和HNF1α呈顯著負(fù)相關(guān)。筆者團(tuán)隊的前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，cyclin D1可抑制NTCP表達(dá)，提示cyclin D1也能抑制HBV對肝細(xì)胞的從頭感染。HNF1α能夠調(diào)控cccDNA的大部分調(diào)控元件(包括preS1啟動子[21]、核心啟動子[22]和增強子Ⅱ[23])，在HNF1α缺失的情況下HBV復(fù)制能力顯著降低[24]。本研究進(jìn)一步證實過表達(dá)cyclin D1能夠抑制HNF1α和NTCP的表達(dá)，提示cyclin D1抑制HBV復(fù)制可能與其對HNF1α和NTCP的調(diào)控有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白cyclin D1可通過抑制HBV基因轉(zhuǎn)錄來抑制病毒復(fù)制，可為進(jìn)一步闡明細(xì)胞周期調(diào)控HBV復(fù)制的分子機制提供理論依據(jù)，并為抗HBV新藥研發(fā)提供潛在的分子靶點。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：彭思雯、關(guān)貴文負(fù)責(zé)實驗，撰寫修改論文；張婷負(fù)責(zé)實驗和論文的撰寫及修改；魯鳳民、劉佳、陳香梅負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。鼓思雯與關(guān)貴文對本文貢獻(xiàn)等同，同為第一作者。