孟 雨,王 雪,陳 放,路鈞澤,王 嫚,劉聞聞

(1. 山東省耳鼻喉醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,山東大學(xué),山東 濟(jì)南 250022;2. 山東省耳鼻喉研究所,山東 濟(jì)南 250022)

耳聾是人類最常見的感官缺陷疾病之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì),全世界有超過4.66億人患有聽力損失[1],并有發(fā)展為抑郁和癡呆等相關(guān)共病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。感音神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss,SNHL)的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,其主要的病理改變是耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的功能異常和損傷,然而這些細(xì)胞均為終末分化細(xì)胞,損傷后難以修復(fù)再生,由此導(dǎo)致SNHL一旦發(fā)生即為永久性[3,4]。目前,SNHL的治療尚無有效藥物,主要基于助聽器和人工耳蝸植入等替代療法恢復(fù)部分聽力,但因可能引起異物反應(yīng)和急慢性炎癥,影響其長期療效[5]。

外泌體來源廣泛、數(shù)量多并且穩(wěn)定存在于幾乎所有體液中;同時(shí)具有其親本細(xì)胞的某些特征,參與多種生理和病理過程[6-8],有望成為多種疾病早期診斷的生物標(biāo)志物[9],因此被稱為"液體活檢"。不僅如此,外泌體還綜合了細(xì)胞藥物遞送和納米技術(shù)的優(yōu)勢,被認(rèn)為是極具潛力的新型生物載體。本文主要對外泌體在感音神經(jīng)性聾發(fā)生發(fā)展中的作用和潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 外泌體

外泌體是一種由細(xì)胞內(nèi)多囊體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性囊泡,其直徑在50 ～ 150 nm,電鏡下呈凹半球狀。外泌體由幾乎所有器官來源的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,并且半衰期長,可以穩(wěn)定存在于幾乎所有的生物體液中。其脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可以有效保護(hù)內(nèi)容物穿過血-腦屏障等生物屏障而不被體液中的酶類降解。膜內(nèi)可以攜帶其來源細(xì)胞的遺傳物質(zhì)如RNA、DNA、mRNA、microRNA,還含有蛋白質(zhì)、脂類和代謝物等[9]。與病毒和非病毒遞送系統(tǒng)相比,外泌體具有包裝容量大、生物相容性、非免疫原性和先天跨過包括屏障生物膜的能力等優(yōu)點(diǎn),能夠更好地在細(xì)胞間傳遞遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)等成分,促進(jìn)細(xì)胞間的通信和信息傳遞[10,11]。機(jī)體微環(huán)境導(dǎo)致外泌體的異質(zhì)性,改變外泌體數(shù)量及大小、內(nèi)容物含量及功能,不同細(xì)胞來源的外泌體差異很大。研究表明,外泌體的生物發(fā)生有兩種方式:一是通過質(zhì)膜或跨高爾基體網(wǎng)的內(nèi)出芽,形成早期內(nèi)體并成熟為晚期內(nèi)體,最后成為細(xì)胞內(nèi)多囊體。轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜后,多囊體與質(zhì)膜融合導(dǎo)致外泌體釋放到細(xì)胞外。另一種機(jī)制是質(zhì)膜重排導(dǎo)致微囊泡從細(xì)胞膜上出芽。根據(jù)來源不同,外泌體可參與生理或病理生理過程并發(fā)揮著不同的作用。例如,抗凋亡[12,13]、抗纖維化[14～16]、促血管生成[17,18]和免疫調(diào)節(jié)[19,20]作用。

2 外泌體作為內(nèi)耳遞送載體

外泌體通過轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、核酸和代謝物等內(nèi)容物介導(dǎo)細(xì)胞間通訊可能存在多種機(jī)制。不同來源的外泌體優(yōu)先與特定類型的細(xì)胞特異性結(jié)合。這種特異性識別大部分是通過外泌體膜蛋白與靶細(xì)胞表面特異性受體識別并特異性結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)信號;或者外泌體膜蛋白可被細(xì)胞外的蛋白酶切割。切割后的片段可以作為可溶性配體與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合,這一機(jī)制反過來激活靶細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng);抑或外泌體與靶細(xì)胞膜融合,以非選擇性的方式釋放其內(nèi)容物于受體靶細(xì)胞內(nèi)[21]。

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)載體是目前直接體內(nèi)基因治療的主力,但AAV載體作為有效的基因轉(zhuǎn)移載體穿過體內(nèi)生物屏障仍然存在障礙,如內(nèi)耳血-迷路屏障;同時(shí)存在轉(zhuǎn)基因大小容量(～4.7 kb)限制問題,許多基因超過了AAV載體的包裝能力。有研究利用外泌體相關(guān)AAV (Exo-AAV)將基因高效遞送至內(nèi)耳,用于聽力和平衡障礙的基因治療。證明了Exo-AAV與傳統(tǒng)AAV載體相比,在抗AAV抗體逃避和向新生小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞遞送基因的性能等方面更具有優(yōu)勢,提高了不易被傳統(tǒng)AAV有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移率。即使存在抗AAV抗體,Exo-AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力也顯著增強(qiáng)。并且觀察到外泌體內(nèi)和外泌體表面有多個(gè)衣殼,可以將不同的AAV載體衣殼包裝到同一外泌體中,提高多組分載體系統(tǒng)的效率[10,11]。

3 外泌體作為內(nèi)耳疾病生物標(biāo)志物

迄今為止,臨床上仍然沒有一種手段進(jìn)行內(nèi)耳組織活檢或血液檢測以確定病理來源、診斷SNHL的亞型,也使我們無法理解聽力損失的主動(dòng)過程,限制了內(nèi)耳疾病靶向治療的發(fā)展,突出了開發(fā)內(nèi)耳疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的必要性[22,23]。因?yàn)閮?nèi)耳位置深在且結(jié)構(gòu)復(fù)雜,直到2018年,才首次報(bào)道內(nèi)耳來源的外泌體[24],研究者發(fā)現(xiàn)大鼠原代培養(yǎng)的內(nèi)耳細(xì)胞釋放的外泌體有可能被用作反映內(nèi)耳狀態(tài)的生物標(biāo)志物。隨后,對出生后不同發(fā)育階段的耳蝸組織進(jìn)行外泌體含量分析發(fā)現(xiàn),外泌體具有與內(nèi)耳和聽覺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的特異性miRNA和蛋白質(zhì)組圖譜[25]。2021年,有研究者首次利用人外淋巴液分離出攜帶毛細(xì)胞特異性蛋白的外泌體[22],不僅證明了外泌體在內(nèi)耳外淋巴液中的存在,也提示毛細(xì)胞是外泌體的潛在來源。盡管該研究提示外泌體可能參與內(nèi)耳發(fā)育,但外泌體在成人內(nèi)耳中是否存在和作用機(jī)制尚不清楚。

目前已有多項(xiàng)研究表明,當(dāng)經(jīng)歷各種應(yīng)激源和病理改變時(shí),外泌體的水平同時(shí)也會(huì)波動(dòng),包括繼發(fā)于耳毒性藥物的SNHL,如順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[24,26,27]和氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[28]所在組的外泌體蛋白水平和顆粒濃度都有所降低。其中一篇報(bào)道進(jìn)一步對順鉑處理小鼠分離的外泌體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析,檢測到外泌體中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)以及內(nèi)耳標(biāo)記物,同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些與SNHL相關(guān)的蛋白質(zhì),如Tmem 33、Pgm1、Cct8等蛋白也具有顯著變化[24]。包裹在外泌體中的 microRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,是血漿中組織損傷的敏感生物標(biāo)志物,目前眾多研究正試圖利用各種體液中的 microRNA對疾病進(jìn)行診斷和預(yù)后評估。外淋巴液的miRNA表達(dá)譜可能與聽力損失的程度相關(guān),有望在細(xì)胞和分子水平上深入了解不同內(nèi)耳病理學(xué)中發(fā)生的情況[23,29,30]。

4 外泌體用于SNHL治療的潛能

獲得性SNHL的主要病理因素包括內(nèi)耳缺血、缺氧、老化、噪聲、耳毒性藥物等,通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號通路、細(xì)胞器應(yīng)激與炎癥相互作用,增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成并抑制耳蝸內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)來破壞細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài),最終導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡或壞死[26,31]。研究表明,外泌體可以清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS,遞送線粒體保護(hù)蛋白,從而提高細(xì)胞的抗氧化能力,增強(qiáng)細(xì)胞活力[32]。

4.1 外泌體對于耳蝸毛細(xì)胞損傷的保護(hù)和聽力修復(fù)作用小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞來源的外泌體通過將miR-182-5p遞送到慶大霉素處理的小鼠耳蝸毛細(xì)胞系細(xì)胞,調(diào)節(jié)miR-182-5p / FOXO3軸,從而改善氧化還原環(huán)境和防御氧化應(yīng)激,發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)和抗炎的作用,保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞對抗慶大霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[33]。臍帶間充質(zhì)基質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stromal cell,UC-MSC)來源外泌體可通過降低腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor -α,TNF -α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表達(dá),上調(diào)神經(jīng)生長因子,發(fā)揮抗炎作用,保護(hù)外毛細(xì)胞修復(fù)聽力損失[34]。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),與一般處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)來源外泌體相比,缺氧預(yù)處理BMSC來源外泌體組缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)表達(dá)上調(diào)。HIF-1α可用于緩解順鉑誘導(dǎo)的耳毒性,增加聽覺敏感性,減少毛細(xì)胞丟失,降低氧化應(yīng)激;SOD1可以降解ROS,降低順鉑誘導(dǎo)的耳毒性,避免毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損害[27]。MicroRNA-21過表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cell,NPC)來源的外泌體通過將miR-21遞送至巨噬細(xì)胞以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,抑制耳蝸內(nèi)的炎癥過程來預(yù)防小鼠缺血再灌注損傷引起的聽力損失[35]。有研究發(fā)現(xiàn),熱休克時(shí),內(nèi)耳橢圓囊釋放攜帶熱休克蛋白70(heat shock 70-kDa protein,HSP70)的外泌體,與毛細(xì)胞上的TLR4受體結(jié)合,對暴露于新霉素的毛細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用,抑制或耗竭攜帶HSP70的外泌體則失去了熱休克的保護(hù)作用[28]。說明HSP70可能是外泌體發(fā)揮保護(hù)作用的介質(zhì)之一,這一機(jī)制強(qiáng)調(diào)了外泌體在氨基糖苷類抗生素致聾環(huán)境中的潛在治療用途。隨后研究發(fā)現(xiàn),MSC與耳蝸外植體共培養(yǎng)導(dǎo)致外泌體中HSP70含量增加,并且能夠保護(hù)外植體免受順鉑誘導(dǎo)的毒性[36]。此外,熱休克預(yù)處理BMSC后衍生的外泌體HSP70降低了順鉑暴露后小鼠內(nèi)耳中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度,增加了抗炎細(xì)胞因子IL-10的濃度[37],減輕了順鉑的耳毒性。

4.2 外泌體對于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用外泌體對于聽覺神經(jīng)元即螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元也具有保護(hù)作用。在體外,MSC來源外泌體對T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)活性;同時(shí),與目前效果最好的神經(jīng)保護(hù)因子BDNF相比, MSC來源外泌體顯著提高了離體螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活率,顯示出強(qiáng)大的保護(hù)作用和神經(jīng)再生能力[38]。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,局部應(yīng)用MSC 來源的外泌體于內(nèi)耳可顯著減輕聽力損失,并保護(hù)聽毛細(xì)胞免受噪聲誘導(dǎo)的體內(nèi)創(chuàng)傷[38]。最新研究發(fā)現(xiàn),位于螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域的微血管的周細(xì)胞釋放含有血管內(nèi)皮生長因子-A (VEGF-A )的外泌體,VEGF-A與VEGFR2 ( Flk1 )結(jié)合表達(dá)于受體細(xì)胞,包括內(nèi)皮細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,控制血管和神經(jīng)元的生長[39]。以人工耳蝸為基礎(chǔ)的電刺激可能是誘發(fā)人工耳蝸植入術(shù)后殘余聽力損失的重要原因[40]。此外,人工耳蝸植入后產(chǎn)生早期和慢性炎癥反應(yīng),促使電極陣列周圍耳蝸內(nèi)纖維化組織沉積以及聽覺毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的丟失,這也會(huì)損害電極阻抗和植入后的聽力結(jié)果[40,41]。目前,首例人類病例報(bào)告了在耳蝸植入過程中局部應(yīng)用同種異體人UC-MSC來源外泌體以減少電極插入引起的炎癥。術(shù)后5天內(nèi)及隨訪24個(gè)月以上,未見發(fā)熱、過敏等急性全身或局部毒性反應(yīng)。最重要的是,語音清晰度在第一年內(nèi)得到改善,并在植入后的第二年保持不變[42]。此報(bào)告的主要缺點(diǎn)是來自單一患者治療的經(jīng)驗(yàn),不足以進(jìn)行關(guān)于安全性、效價(jià)或有效性的全面評估。

綜上,外泌體具有用于臨床診治的潛力,包括作為高效且安全的遞送載體的潛力、作為生物標(biāo)志物檢測各體液中特定蛋白或miRNA的潛力、作為具有強(qiáng)大的抗炎抗氧化作用的內(nèi)耳治療劑的潛力。外泌體的檢測及其蛋白質(zhì)譜的變化可能對耳科病理,特別是內(nèi)耳的治療很有幫助;也可以通過外泌體監(jiān)測耳毒性藥物繼發(fā)的內(nèi)耳損傷;或用于突發(fā)性SHNL患者,以幫助指導(dǎo)臨床治療。目前對不同內(nèi)耳疾病的分子病理生理機(jī)制缺乏全面的認(rèn)識,了解導(dǎo)致內(nèi)耳損傷并誘發(fā)聽力損失的確切分子機(jī)制將加速有效精準(zhǔn)治療的發(fā)展。盡管外泌體作為內(nèi)耳治劑的潛在用途是充滿希望的,但這一領(lǐng)域還需要進(jìn)一步的深入研究。