鄧水明， 何昊東， 李 穎， 王 芳， 郭建峰

(中北大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 山西 太原 030051)

0 引 言

原位可注射水凝膠因其貼合性好， 可使藥物集中于傷口處和對(duì)周圍組織侵入性小等特點(diǎn)而備受關(guān)注[1-2]， 為增強(qiáng)其實(shí)用性， 研發(fā)一種價(jià)格便宜、 生物相容性好、 止血性能和傷口愈合能力滿意的可注射水凝膠非常必要。 可注射水凝膠的結(jié)構(gòu)與其交聯(lián)方式密切相關(guān)。 目前， 可注射水凝膠常見(jiàn)的交聯(lián)方式可分為化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)， 物理交聯(lián)的可注射水凝膠雖然凝膠速率快， 但機(jī)械性能通常不高， 化學(xué)交聯(lián)的可注射水凝膠可能存在膠凝時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題[3-4]。 此外， 生物降解性、 組織粘附性、 生物相容性也是可注射水凝膠需要考慮的問(wèn)題[5]。 常作為水凝膠原材料的透明質(zhì)酸不僅存在價(jià)格昂貴的問(wèn)題， 而且也被證明會(huì)刺激傷口部位的腫瘤并致其增殖[6]。

海藻酸鈉(Sodium Alginate, SA)因其無(wú)毒、 可生物降解、 免疫原性低、 生物相容性好且價(jià)格便宜， 已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域[7-9]。 五羥色胺是人體內(nèi)存在的天然成分， 不僅是潛在的止血及傷口愈合劑， 而且其作為交聯(lián)劑形成的水凝膠具有良好的組織粘附性[10-11]。 辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)是一種高效而特異的生物催化劑， 能在H2O2配合下， 使海藻酸鈉-五羥色胺聚合物交聯(lián)形成水凝膠。 這種酶促交聯(lián)方式不僅可以在溫和的條件下使用， 而且可以使水凝膠具有可注射性， 所形成的水凝膠具有凝膠時(shí)間較短且可調(diào)節(jié)的特點(diǎn)， 被認(rèn)為是安全且適合在生物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的交聯(lián)方式[12]。

本文結(jié)合海藻酸鈉、 五羥色胺在止血及傷口愈合方面的優(yōu)勢(shì)， 以及水凝膠復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物理屏蔽作用， 以海藻酸鈉與五羥色胺為原料， 在辣根過(guò)氧化物酶和H2O2的催化下制備了一種新型可注射水凝膠， 研究了雙氧水濃度對(duì)其凝膠時(shí)間、 溶脹度、 力學(xué)性能的影響， 制備的SAS水凝膠在生物醫(yī)學(xué)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 同時(shí)， 海藻酸鈉還具有易改性的特點(diǎn)， 海藻酸鈉水凝膠也具有較強(qiáng)的物質(zhì)包裹能力， 為以后進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域提供了條件[13]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)用試劑與主要儀器

實(shí)驗(yàn)用試劑： 海藻酸鈉(200 mPa·s～500 mPa·s)和辣根過(guò)氧化物酶(>300 u/mg)購(gòu)自羅恩醫(yī)藥(中國(guó)·上海)， 五羥色胺鹽酸鹽和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC·HCl)以及N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)購(gòu)自畢得醫(yī)藥(中國(guó)·上海)。

實(shí)驗(yàn)用主要儀器： 傅里葉紅外光譜儀， FTIR-6500， 天津溢東科技； 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀， Read Max 1900上海閃譜生物科技有限公司； 流變儀， MCR102， 奧地利Anton Paar； 磁力攪拌器， HJ-3， 金壇市杰瑞爾； 冷凍干燥機(jī)， CTFD-105， 青島永合川創(chuàng)信； 掃描電子顯微鏡， 捷克TESCAN MIRA LMS； 萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)， INSTRON LEGEND2345。

1.2 海藻酸鈉-五羥色胺(sodium alginate-serotonin， SAS)聚合物的合成

將2 g SA溶于pH值為5.5的緩沖液中， 配成質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的SA溶液； 將2.32 g EDC·HCl和3.86 g NHS分別加入SA溶液中攪拌1 h； 取定量的五羥色胺鹽酸鹽添加進(jìn)SA溶液中， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24 h； 反應(yīng)物在蒸餾水中透析3 d(透析帶截留分子量為3 500 Da)； 冷凍干燥后得到SAS聚合物, 4 ℃下保存。

配制不同濃度的五羥色胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液， 測(cè)量其在280 nm處的吸光度A， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.998 6)， 得到式(1)。 由式(2)計(jì)算得到SAS中五羥色胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wS。

A=1.417 1cNHS-0.001 7，

(1)

(2)

式中：A為五羥色胺的吸光度；cNHS為五羥色胺的質(zhì)量濃度， mg/mL；cSAS為SAS聚合物的質(zhì)量濃度， mg/mL。

1.3 SAS水凝膠的合成以及凝膠時(shí)間的測(cè)量

將1 g SAS溶于20 mL蒸餾水中得到SAS聚合物溶液， 將HRP加入SAS聚合物溶液中混合均勻； 分別用注射器取400 μL聚合物溶液和 100 μL H2O2在玻璃瓶中混合， 形成水凝膠。 打開(kāi)磁力攪拌器并開(kāi)始計(jì)時(shí)， 當(dāng)磁力轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速明顯改變時(shí)停止計(jì)時(shí)， 這個(gè)時(shí)間即為SAS水凝膠的凝膠時(shí)間。

1.4 流變分析

固定頻率為1 Hz， 在應(yīng)變控制掃描模式下(0.001%～1%)使用MC102流變儀測(cè)定水凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量， 通過(guò)計(jì)算水凝膠的平均儲(chǔ)能模量得到其彈性模量[11]。

1.5 水凝膠的微觀形態(tài)

冷凍干燥后的SAS水凝膠樣品在液氮中驟冷后脆斷， 對(duì)樣品斷面噴金處理后使用掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌， 電子加速電壓為5 kV。

1.6 溶脹度(Q)測(cè)量

在室溫下將干燥至恒重(w0)的水凝膠浸泡于磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH=7.4)中， 每間隔60 min測(cè)定水凝膠的質(zhì)量(wt)， 按式(3)計(jì)算溶脹度。

溶脹度=(wt-w0)/w0。

(3)

1.7 水凝膠對(duì)皮膚組織的粘附性

用豬皮在萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上測(cè)定水凝膠的粘合強(qiáng)度， 分析SAS水凝膠對(duì)皮膚組織的粘附性。 將豬皮切成5 cm×1.5 cm的長(zhǎng)方形， 2塊豬皮的搭接長(zhǎng)度為2 cm， 搭接區(qū)域均勻涂抹SAS水凝膠后將豬皮搭接在一起， 在室溫條件下保持30 min。 用夾具固定好豬皮， 萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)拉伸速率設(shè)置為5 mm/min， 根據(jù)最大載荷和搭接面積計(jì)算水凝膠的粘合強(qiáng)度[14]。 SAS 水凝膠換為 SA-Ca2+水凝膠[15]重復(fù)以上操作， 比較SAS水凝膠和SA-Ca2+水凝膠的粘合強(qiáng)度。

將SAS水凝膠原位注射于破損的皮膚組織處， 觀察其在破損皮膚組織中的填充情況， 并對(duì)比水凝膠在不同大小傷口的填充情況。

1.8 水凝膠的自愈與降解性

將水凝膠切開(kāi)， 切口緊挨在一起放置一段時(shí)間， 用鑷子夾起水凝膠觀察是否自愈， 并用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察自愈處是否有裂紋。

室溫下， 將SAS水凝膠在PBS緩沖液(pH=7.4)中浸泡8 h 使其達(dá)到溶脹平衡， 此時(shí)， 水凝膠的質(zhì)量為初始質(zhì)量wi， 測(cè)定浸泡5 d， 10 d， 15 d， 20 d， 25 d， 30 d時(shí)水凝膠的質(zhì)量wr， 按式(4)計(jì)算其質(zhì)量保留率。

(4)

2 結(jié)果與討論

2.1 SAS聚合物的合成與表征

SAS聚合物的合成過(guò)程如圖1(a)所示， 在EDC和NHS作用下， 海藻酸的羧基與五羥色胺的氨基發(fā)生取代反應(yīng)， 得到SAS聚合物。 通過(guò)分析SAS聚合物的傅里葉紅外光譜圖(見(jiàn)圖1(b))發(fā)現(xiàn)， 與SA相比， SAS聚合物在1 027 cm-1和1 623 cm-1處出現(xiàn)了新峰， 表明SAS上成功引入吲哚基團(tuán)[11]； 在1 290 cm-1處出現(xiàn)酰胺III的吸收峰， 表明五羥色胺成功嫁接到了SA鏈上。 分析SAS的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜圖(見(jiàn)圖1(c))可知， SAS聚合物在280 nm附近出現(xiàn)吸收峰， 這也表明吲哚基團(tuán)被成功引入[16]。 表1 為由式(1) 和式(2)計(jì)算得到的SA與五羥色胺在不同物質(zhì)的量比時(shí)SAS中五羥色胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 該質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高， 五羥色胺在SAS中的含量越高。 五羥色胺不僅可以充當(dāng)水凝膠的交聯(lián)劑， 還可以與生物分子中的親核試劑作用而粘附在組織表面[17]， 因此選擇海藻酸鈉與五羥色胺物質(zhì)的量比為1∶3。

(a) SAS聚合物的合成過(guò)程

表1 海藻酸鈉-五羥色胺聚合物中五羥色胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 水凝膠的合成與凝膠時(shí)間測(cè)定

SAS聚合物溶液在H2O2和HRP的催化作用下形成水凝膠， 交聯(lián)過(guò)程如圖2 所示。 在H2O2和HRP催化作用下得到吲哚自由基， 生成的吲哚自由基之間相互作用形成共價(jià)鍵[18]， 從而得到SAS水凝膠。

圖2 水凝膠合成示意圖

SAS聚合物溶液在不同濃度HRP和H2O2催化下的凝膠時(shí)間見(jiàn)圖3。 由圖3 可知， SAS聚合物溶液形成水凝膠的時(shí)間在40 s～85 s之間， 均在2 min內(nèi)。 當(dāng)H2O2的濃度不變時(shí)， 隨著HRP質(zhì)量濃度的升高， 凝膠時(shí)間明顯縮短， 這是因?yàn)槊负吭礁邌挝粫r(shí)間內(nèi)的催化效率越高， 因而凝膠時(shí)間越短。 在HRP質(zhì)量濃度不變的情況下， 隨著H2O2濃度的增加， 凝膠時(shí)間先縮短后增加， 這可能是由于適當(dāng)?shù)腍2O2濃度會(huì)加速聚合物的交聯(lián)從而縮短凝膠時(shí)間， 而當(dāng)H2O2濃度過(guò)大可能會(huì)導(dǎo)致HRP的活性降低， 從而延長(zhǎng)水凝膠形成的時(shí)間。

圖3 SAS水凝膠的凝膠時(shí)間

2.3 流變分析

水凝膠(HRP 0.3 mg/mL，H2O210 mmol·L-1)在0.001% ～1%應(yīng)變范圍的儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)見(jiàn)圖4(a)，不同H2O2濃度形成的水凝膠的彈性模量見(jiàn)圖4(b)。 如圖4(a) 所示， 在0.001%～1%應(yīng)變范圍內(nèi)， 水凝膠儲(chǔ)能模量始終大于損耗模量， 表明水凝膠形成穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)[11]。 如圖4(b) 所示， 雙氧水濃度從 10 mmol·L-1增加到 40 mmol·L-1， SAS水凝膠彈性模量從 282 Pa提高到 513 Pa， 彈性模量隨H2O2濃度的增加而升高， 彈性模量隨H2O2濃度的增加而升高， 這是由于隨著H2O2濃度的增加， 更多的吲哚自由基被氧化發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)， 從而使水凝膠的力學(xué)性能得到提升。 這說(shuō)明H2O2的濃度對(duì)SAS水凝膠的力學(xué)性能影響顯著。

(a) 水凝膠的儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)

2.4 水凝膠的形態(tài)及溶脹度

使用電子顯微鏡觀察到的SAS水凝膠的微觀形態(tài)如圖5 所示， 水凝膠呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且形狀不規(guī)則。 該結(jié)構(gòu)有利于吸收滲出物， 增加紅細(xì)胞和血小板濃度， 加速血液凝固， 多孔結(jié)構(gòu)也有利于細(xì)胞遷移和附著以及代謝廢物的排出， 從而加快傷口愈合[19-21]。

不同H2O2濃度形成的水凝膠的溶脹度如圖6 所示。 水凝膠的溶脹度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加， 最終在420 min左右達(dá)到平衡。 當(dāng)H2O2的濃度在10 mmol·L-1～40 mmol·L-1時(shí)， 溶脹度隨著H2O2濃度的增加而逐漸下降， 這是由于隨著H2O2濃度的增加， 所形成的水凝膠交聯(lián)更加致密， 從而導(dǎo)致水凝膠的溶脹度降低。 H2O2的濃度在10 mmol·L-1～40 mmol·L-1之間時(shí)， 溶脹度為18 g/g～33 g/g， 這說(shuō)明在此H2O2濃度范圍內(nèi)所形成的水凝膠均具有高溶脹度(Q>10 g/g)[22]， 高溶脹度的水凝膠更加有利于吸附滲出液和濃縮凝血因子， 加速傷口部位的凝血。

圖6 不同雙氧水濃度條件下SAS水凝膠的溶脹度

2.5 水凝膠的組織粘附

SAS水凝膠的粘合強(qiáng)度見(jiàn)圖7。 SAS水凝膠的粘合強(qiáng)度遠(yuǎn)大于SA-Ca2+水凝膠,這說(shuō)明SAS水凝膠的皮膚貼合能力要好于SA-Ca2+水凝膠。

圖7 SAS水凝膠的粘合強(qiáng)度

SAS水凝膠填充破損皮膚組織的情況如圖8 所示。 SAS水凝膠原位形成于傷口處， 能很好地填充傷口(見(jiàn)圖8(a))。 進(jìn)一步擴(kuò)大傷口， 水凝膠仍然能很好地填充傷口， 提起受損皮膚組織反復(fù)抖動(dòng)后水凝膠依然較好地填充于皮膚傷口處,傷口未見(jiàn)明顯裂開(kāi)(見(jiàn)圖8(b))。 這可能歸因于五羥色胺氧化中間體與皮膚組織中的一些蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)， 從而提高了SAS水凝膠的組織粘附性。 SAS水凝膠干燥后， 水凝膠也很容易從皮膚上脫離， 不會(huì)損害皮膚組織。

(a) 水凝膠填充破損皮膚組織的情況

2.6 水凝膠的自愈與降解

SAS水凝膠自愈過(guò)程和切口自愈后的SEM圖如圖9 所示。 將水凝膠切開(kāi)， 切口緊挨在一起放置一段時(shí)間后， 可以看到水凝膠自愈為一體， 將自愈后的水凝膠用鑷子夾起， 愈合部分也沒(méi)有裂開(kāi)掉落(見(jiàn)圖9(a))， 愈合處未見(jiàn)明顯的大裂縫(見(jiàn)圖9(b))， 表明SAS水凝膠具有良好的自愈能力， 這可能是由于水凝膠之間具有氫鍵與 π-π 堆積作用， 從而賦予SAS水凝膠自愈性[23]。

(a) SAS水凝膠自愈過(guò)程

SAS水凝膠的降解曲線如圖10 所示。 由圖10 可知， 隨著時(shí)間的推移， SAS水凝膠的質(zhì)量逐漸減少， 在降解30 d后， 其降解率超過(guò)80%， 說(shuō)明SAS水凝膠具有生物可降解性。

圖10 SAS(0.3 mg/mL HRP, 20mmol·L-1 H2O2)水凝膠的降解曲線

3 結(jié) 論

本研究以海藻酸鈉、 五羥色胺為原料， 在雙氧水和辣根過(guò)氧化物酶的催化作用下成功制備了一種新型可注射SAS水凝膠。 SAS水凝膠能形成穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，彈性模量隨雙氧水濃度的增加而增加， 可以通過(guò)改變雙氧水濃度來(lái)調(diào)節(jié)SAS水凝膠的性能， 達(dá)到更好的效果。 SAS水凝膠的凝膠時(shí)間隨雙氧水濃度的增加先降低后增大， 雙氧水濃度為20 mmol·L-1時(shí)， 凝膠時(shí)間最短。 微觀形態(tài)呈形狀不規(guī)則的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 表現(xiàn)出良好的溶脹性能，溶脹度隨雙氧水濃度的增加而下降。 SAS水凝膠不僅能很好地貼附于皮膚組織， 還具有良好的自愈能力和生物降解能力。