呂岳駿， 李亞蕓， 王舒淇， 高于涵， 李鑫豐， 蔡明娜， 侯 彬， 盧 靜

(中北大學 環(huán)境與安全工程學院， 山西 太原 030051)

0 引 言

微塑料(Microplastics， MPs)， 是指粒徑小于5 mm的高分子化合物[1]。 由于其比表面積大， 吸附污染物的能力強， 且具有體積微小的特點， 在環(huán)境中隨風力、 水力運輸遷移的范圍更廣， 對環(huán)境和生態(tài)圈食物鏈的危害程度更大、 更持久[2]。 目前， 已有大量關于MPs的污染研究的報道。 MPs最早在海洋中被發(fā)現[3]， 研究者追溯海洋中MPs的來源時發(fā)現大部分MPs來自于內陸地表水， 內陸環(huán)境中的MPs首先進入地表水， 然后隨地表水進入內陸河流， 最后匯入海洋[4-5]。 目前很多的MPs研究都集中在海洋[1-2,6]， 內陸地表水的研究不是很多， 尤其是對世界排名前幾的河流研究更少。 此外， MPs作為一種典型的非自然介質的生物棲息地， 其附著的微生物群落近年來也受到越來越多研究者關注[4,7-8]。

黃河作為世界第六大河流[9]， 針對其中MPs分布情況的研究有報道但并不是很多， 且大多數研究集中在黃河下游[7,9-10]。 山西地處黃河中上游， 境內黃河流段長965 km， 幾乎占黃河全長的1/5， 研究山西境內黃河流域中MPs 的污染情況對黃河水環(huán)境保護治理具有重要意義[11]。 然而， 關于山西省境內黃河流域中MPs的研究卻鮮有報道。 龔喜龍等[12]研究了甘肅至山東黃河流域沉積物中的MPs情況， 但是其中只包括山西黃河流域中下游的沉積物， 山西黃河上游MPs的分布情況還未見報道。 關于黃河中MPs表面生物膜方面的研究更未見報道。 本文以山西境內黃河上游的河曲縣和保德縣黃河采樣站點附近的水體和沉積物為研究對象， 觀察MPs及其附著生物膜的表面形貌， 對MPs的形狀、 顏色和粒徑分布特征進行統(tǒng)計， 并分析了MPs的聚合物類型， 最后對MPs附著微生物菌群分類學組成進行分析， 旨在探究山西境內黃河上游MPs的分布特征及其表面附著微生物群落的組成。

1 實驗部分

1.1 樣品采集

在山西黃河上游的河曲縣(H)、 保德縣(F)共選擇6個采樣點， 如圖1 所示， 于2021年12月7日選擇河面水流平緩處采集樣品。 每個采樣點收集1 L水樣裝入無菌采樣瓶中， 收集2 kg沉積物樣裝于鋁箔袋中。 每個采樣點采集3個平行樣。

圖1 采樣點地理位置圖

1.2 MPs的分離與富集

將肉眼可見的大塊MPs挑出， 沖洗表面后收集冷凍保存， 用于后續(xù)生物膜研究實驗。

對水樣和干沉積物樣分別用飽和氯化鈉溶液(1.2 g/m3)浮選， 上清液進行真空抽濾， 將MPs收集在0.22 μm的水系混合纖維素微孔濾膜上， 然后用質量分數為30%的H2O2浸泡收集起來的MPs， 將樣品放在恒溫振蕩器(HZ-9511KB， 溫度60 ℃， 轉速120 r/min)中消解36 h， 對消解后的樣品進行真空抽濾， MPs被收集在0.22 μm水系混合纖維素微孔濾膜上， 將富集在濾膜上的MPs及濾膜一起置于50 ℃的烤箱中烘干， 等待顯微鏡檢驗[4,12]。

1.3 MPs及其附著微生物表面形貌的觀察

利用金相顯微鏡(Leica DM18/MC190HD)對干燥后的疑似MPs的粒徑梯度、 顏色、 形狀進行分類統(tǒng)計。 利用掃描電子顯微鏡(SEM， 捷克TESCAN MIRA LMS， 加速電壓3 kV)對MPs表面形貌以及MPs附著微生物表面形貌進行表征。 觀察MPs附著生物膜的表面形貌時， 先將樣品在質量分數為2.5%的戊二醛固定液中室溫下固定12 h后用乙醇梯度脫水， 再將干燥后的MPs樣品粘在掃描電鏡樣品臺上， 用離子濺射鍍膜儀在MPs表面噴金100 s。

1.4 MPs聚合物類型的鑒定

較大的MPs用傅里葉紅外變換光譜儀(布魯克， ALPHAⅡ)進行表征， 測試范圍500 cm-1～4 000 cm-1， 分析MPs聚合物類型。

1.5 MPs附著微生物菌群分類學組成和分布

取水樣和沉積物中的MPs樣品各10 g， 加入50 mL～100 mL的PBS緩沖液或者無菌水， 在恒溫振蕩器(HZ-9511KB， 150 r/min ～200 r/min，25 ℃)中振蕩30 min～60 min， 超聲10 min， 再次振蕩30 min ～60 min， 取上清液在8 000 r/min下離心分離， 收集沉淀并用液氮速凍， -80 ℃或液氮中長期保存。

選擇擴增子項目文庫類型標準細菌V3V4區(qū)(Miseq-PE250/Novaseq-PE250)， 在Pacbio Sequuel平臺對群落全長rDNA進行單分子測序。 對高通量測序的原始下機數據根據序列質量進行初步篩查， 運用QIIM軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology， v1.8.0， http://qiime.org/)對樣品的操作分類單元(Operational Taxonomic Unit， OTU)進行劃分， 對各樣本在不同分類水平的具體組成進行分析。 MPs附著菌群分類學樣本編號為： HW表示河曲水樣中的MPs， HS表示河曲沉積物樣中的MPs， BW表示保德水樣中的MPs， BS表示保德沉積物中的MPs。

2 結果與討論

2.1 MPs的表面形貌

通過SEM觀察到的MPs的表面形貌見圖2。 圖2(a)～圖2(c)(放大倍數為500倍)分別為河曲流域沉積物中的碎片狀MPs， 保德流域沉積物中的薄膜狀和纖維狀MPs， 不同形狀的MPs表面均存在明顯劃痕、 溝壑、 凹槽等風化痕跡， 這表明黃河流域中的MPs受到了水流沖刷、 泥沙摩擦、 生物侵蝕等作用。 保德流域沉積物中的碎片狀MPs附著生物膜的表面形貌如圖2(d)(放大倍數為5萬倍) 所示， MPs表面明顯存在微生物附著生長。 風化作用使MPs比表面積增大， 為各種異養(yǎng)生物的定植提供了有利條件[13-14]。

(a) 碎片狀MPs

2.2 MPs的豐度

如圖3 所示， 兩地水體和沉積物中MPs的豐度分別為160 個/L～275 個/L和287 個/kg～480 個/kg。 其中， 河曲水體中MPs為平均豐度的193 個/L， 沉積物中MPs的平均豐度為405 個/kg； 保德水體中MPs的平均豐度為220 個/L， 沉積物中MPs的平均豐度337 個/kg。 圖3 中縱坐標負值代表沉積物中MPs的豐度，讀數取絕對值。河曲水體中MPs的平均豐度略低于保德水體中MPs的平均豐度， 而河曲沉積物中MPs的平均豐度略高于保德沉積物中MPs的平均豐度。 黃河流域不同研究區(qū)域水體和沉積物中MPs的分布特征如表1 和表2 所示， MPs的分布特征整體呈現下游高于上游的趨勢。 本研究地處黃河中上游， 研究區(qū)域水體和沉積物中MPs的豐度比上游的高， 比下游的低， 符合黃河流域中MPs的分布特征整體呈現下游高于上游的趨勢。 MPs會隨水流在中游部分積累， 其余部分隨水流進入下游， 且研究區(qū)域處于內陸地區(qū)， 相比下游沿岸靠海地區(qū)， 其人口密集程度較低， 受人類活動的影響程度較低， MPs的豐度較低[9,14]。

圖3 河曲、 保德黃河流域中MPs的豐度

表1 黃河流域不同研究區(qū)域地表水中MPs的分布特征

表2 黃河流域不同研究區(qū)域沉積物中MPs的分布特征

2.3 MPs的形狀分布、 粒徑梯度及顏色特征

樣品中MPs的主要形狀有薄膜狀、 纖維狀、 小球狀和碎片狀， 如圖4 所示。 采樣點的MPs形狀分布如圖4(b)所示， 碎片狀MPs占比最大， 其次為纖維狀MPs， 小球狀和薄膜狀MPs相對較少。 碎片狀MPs主要來源于城市生活垃圾， 纖維狀MPs主要來源于農業(yè)地膜、 包裝袋、 服裝纖維以及日常塑料繩破損， 小球狀和薄膜狀MPs主要來源于工業(yè)垃圾。 這與研究區(qū)域靠近城市， 周邊工業(yè)區(qū)較少， 主要是生活垃圾和各種纖維垃圾的實際相符。

(a) MPs的金相顯微鏡圖

兩地流域MPs的粒徑分布如圖5 所示。 將MPs按粒徑梯度劃分為<0.1 mm、 0.1～0.5 mm、 0.5～1 mm、 1～5 mm 4類， 兩地水體和沉積物中粒徑<0.1 mm的MPs占比最多， 這與Han[9]、 牛學銳[10]、 Ding[14]等的研究結果類似， 一方面泥水沖刷對來源于上游水體的MPs顆粒撕裂程度更高[12]， 另一方面MPs在水體和沉積物中各種作用下脆化、 斷裂， 再加上其難降解的特點， 環(huán)境中微小體積MPs隨著時間的推移不斷積累， 整體呈現出環(huán)境中體積小的MPs占比更高的趨勢[7,12]。

圖5 河曲、 保德黃河流域MPs粒徑分布

河曲/保德黃河流域MPs的顏色分布特征如圖6 所示， 樣品中白色MPs最多， 占比為 60%；藍色 MPs占比最小，僅為10% 左右。

圖6 河曲、 保德黃河流域MPs的顏色分布特征

2.4 MPs的聚合物類型

MPs樣品的FTIR光譜圖如圖7 所示， 樣品中纖維狀MPs的聚合物成分主要為聚乙烯(Polyethylene， PE)， PE主要用作農膜、 工業(yè)用包裝膜、 藥品與食品包裝薄膜、 繩索、 過濾布、 包裝布、 機械零件、 日用品、 建筑材料、 電線、 電纜絕緣、 涂層和合成紙等； 碎片狀MPs的聚合物成分主要為聚丙烯(Polypropylene， PP)， PP廣泛應用于服裝、 毛毯等纖維制品、 醫(yī)療器械、 汽車、 自行車、 零件、 輸送管道、 化工容器等的生產， 也用于食品、 藥品包裝； 薄膜狀和小球狀MPs的聚合物類型主要為聚苯乙烯(polystyrene， PS)[12,15]， PS經常被用來制作隔熱板、 泡沫塑料制品、 一次性塑料餐具、 透明CD盒等。 城市生活垃圾未經合理處置， 其中的塑料垃圾經過農田灌溉、 風力、 雨水沖刷等污染遷移過程， 最終進入了河流。

(a) 聚乙烯

2.5 MPs附著微生物菌群分類學組成

通過高通量測序， 對12組樣本進行OTU劃分和分類地位鑒定， 如圖8(a) 所示， 水體中MPs附著微生物OTU整體的數目高于沉積物中MPs表面的數目， 12組樣本的相似度主要集中體現在屬水平。 進一步在屬水平上對兩地12組樣品展開分類學組成分析， 如圖8(b)， 圖8(c)為屬水平河曲、 保德兩地12組樣品的菌群分類學組成和分布圖。

(a) 兩地12組樣本的OTU劃分和分類地位鑒定結果統(tǒng)計圖

分析圖8(b)可知， 河曲水中MPs表面細菌群落主要有黃桿菌屬(Flavobacterium)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)[16]、 彎桿菌屬(Flectobacillus)、Limnohabitans、 紅細菌屬(Rhodoferax)， 沉積物中MPs表面細菌群落主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、 黃桿菌屬(Flavobacterium)、 微小桿菌屬(Exiguobacterium)、 嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。 分析圖8(c)可知， 保德水體中MPs表面細菌群落主要有Limnohabitans、 黃桿菌屬(Flavobacterium)、 馬賽菌屬(Massilia)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)、 紅細菌屬(Rhodoferax), 沉積物中MPs表面細菌群落組成主要有節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、 黃桿菌屬(Flavobacterium)、 馬賽菌屬(Massilia)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)和嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)。

河曲水體中MPs表面黃桿菌屬(Flavobacterium)是優(yōu)勢種、 沉積物中MPs表面假單胞菌屬(Pseudomonas)是優(yōu)勢種， 保德水體中MPs表面的優(yōu)勢種是Limnohabitans、 沉積物中MPs表面的優(yōu)勢種是節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)， 這些菌都是參與水環(huán)境碳氮循環(huán)的有益菌種， 對促進水體自凈有積極作用[17]。 同時， 黃桿菌屬(Flavobacterium)還可以抑制微囊藻的生長， 有助于水體富營養(yǎng)化的修復[18]； 節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)具有極強的環(huán)境適應性， 可以降解水體中的有機物和重金屬[19]； 馬賽菌屬(Massilia)具有溶磷、 降解多環(huán)芳烴的功能[20]。 同一采樣點水體和沉積物中的MPs表面的優(yōu)勢種不同， 不同采樣點水體樣本之間、 沉積物樣本之間的優(yōu)勢種也不相同， 這可能是由于所處水體和沉積物環(huán)境的不同而表現出顯著差異性[2,15]， 同時沉積物高速沉降和再懸浮作用可能導致水體和沉積物間細菌群落發(fā)生劇烈交換[15]， 水生微生物利用漂浮物、 懸浮物在不同區(qū)域中吸附轉移是微生物常見的傳播途徑。

3 結 論

本研究對山西黃河上游流域中MPs的分布特征及其表面附著菌群分類學組成進行了表征， 結論如下：

1) 山西黃河上游水體和沉積物中MPs的豐度分別為160 個/L～275 個/L和287 個/kg～480 個/kg， 其中， 粒徑<1 mm的MPs顆粒占比最大。 碎片狀MPs占比最高， 其主要成分是PP； 纖維狀次之， 主要成分是PE； 小球狀和薄膜狀MPs的主要成分是PS， 占比最小。 通過SEM觀察到MPs表面存在劃痕、 溝壑、 凹槽等風化痕跡， 且表面存在微生物附著生長。

2) 利用高通量測序技術表征MPs表面微生物菌群分類學組成， 兩地流域中MPs表面普遍存在黃桿菌屬(Flavobacterium)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)等， 除此之外， 水樣中MPs表面還大量存在Limnohabitans、 紅細菌屬(Rhodoferax)等， 沉積物中MPs表面大量存在節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、 馬賽菌屬(Massilia)、 嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)等。