張 鑫，胡希好，胡志明，劉 浩，王越茂，趙福彬，程昌新，李貴忠，褚德朋，尹紹靜，程亞東，尤祥偉，李義強

[1.中國農業(yè)科學院煙草研究所，山東青島 266101；2.山東青島煙草有限公司，山東青島 266101；3.云南省煙草公司保山市公司，云南保山 6780992；4.紅云紅河煙草(集團)有限責任公司，云南昆明 650202；5.中國煙草云南進出口有限公司，云南昆明 650031]

多年來，由于施肥模式、種植制度及栽培方式等不盡合理，導致我國煙葉質量整體下降[1]。發(fā)展有機肥料，因地制宜開發(fā)和施用有機肥，促進煙葉產量質量的提高是目前被普遍采納的有機農業(yè)生產模式[2]。長期施用有機肥可以調節(jié)土壤微生態(tài)、提高土壤微生物整體代謝活性、增加土壤微生物多樣性和功能多樣性，進而提高土壤的生態(tài)功能，對促進煙株生長產生積極的影響[3-5]。

海藻有機肥作為一種天然的綠色有機肥料，含有大量的營養(yǎng)元素和氨基酸、多糖、甜菜堿、植物生長素等多種活性物質，不僅能提供植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)，還可提供植物生長調節(jié)劑，并且與普通化學肥料相比，海藻肥擁有安全無毒等優(yōu)勢[6-8]。楊錦等研究發(fā)現(xiàn)，海藻有機肥的施用能夠顯著促進根系生長，提高土壤酶活性、土壤微生物活性和作物抗逆性，從而有效提高作物產量和品質[9-10]。利用海藻有機肥是綠色農業(yè)生產需要，在煙草上亟需推廣，但目前缺乏相關研究，而且由于我國缺乏完善的肥料效果評價體系，目前市面所售應用于煙草的有機肥質量參差不齊，肥料效果差別很大，因此開發(fā)篩選優(yōu)質高效海藻有機肥對促進煙草生長發(fā)育具有重要意義。

本試驗以烤煙品種中煙100為材料，通過田間小區(qū)試驗，研究不同施用量的海藻肥和大豆海藻肥對煙株生長發(fā)育的影響，從土壤養(yǎng)分有效性以及土壤微生物群落結構的角度，探索不同有機肥在促進煙株生長發(fā)育方面的作用。對開發(fā)綠色高效的煙草海藻有機肥，實現(xiàn)煙草行業(yè)綠色防控、肥料減量、煙田土壤綠色高效保育模式的現(xiàn)實需求具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2019年4月在山東省青島市黃島區(qū)六旺鎮(zhèn)(35°57′16″N，119°44′18″E)進行。該地土壤類型為棕壤，pH值4.18，有機質含量15.94 g/kg，銨態(tài)氮含量0.018 7 g/kg，硝態(tài)氮含量0.030 9 g/kg，速效鉀含量276.60 mg/kg，速效磷含量28.88 mg/kg。供試品種為當?shù)刂髟钥緹熎贩N中煙100。試驗所用煙草專用肥(N含量≥10%，K2O含量≥20%，P2O5含量≥10%)450 kg/hm2、硫酸鉀含量225 kg/hm2統(tǒng)一按照當?shù)責煵莨緲藴蕡?zhí)行。市售普通有機肥含量(N+P2O5+K2O≥6%，有機質含量≥45%；主要原料為有機質、有機鈣、有益菌)于當?shù)剞r資公司購買；海藻肥為青島海大生物集團有限公司提供的海狀元有機肥(N+P2O5+K2O含量≥6%，有機質含量≥45%；主要原料為有機質、海洋生物鈣粉、海洋有益菌、海藻提取物)；大豆海藻肥為青島農特生物科技有限責任公司提供的煙大帥有機肥(N+P2O5+K2O含量≥5%，有機質含量≥65%；主要原料為有機質、發(fā)酵大豆和海藻廢棄物、海洋有益菌)。

1.2 試驗設計

海藻肥(SF)、大豆海藻肥(SSF)分別與煙草專用肥混合，條施后起壟，壟高30 cm，壟體飽滿。試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，共設置8個處理(表1)，每個處理重復3次，每個小區(qū)種植50株，行距120 cm，株距50 cm，四周設保護行。于2019年4月移栽大田試驗煙苗。試驗過程中嚴格按照當?shù)貎?yōu)質煙生產技術規(guī)范執(zhí)行。

表1 試驗處理

1.3 測定項目及方法

1.3.1 農藝性狀調查 于團棵期每個小區(qū)選取 3 株代表性煙株，沿莖基部切開，洗凈并擦干表面水分后立即測量煙株地下部分和地上部分鮮質量[11]，隨后置于烘箱105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒質量；于旺長期每個小區(qū)選取 5 株代表性煙株，根據(jù)YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查測量方法》標準測定農藝性狀。

1.3.2 土壤樣品采集及測定 于移栽后60 d采用5點取樣法采集450 kg/hm2用量海藻肥和大豆海藻肥處理土樣，采用抖根法采集450 kg/hm2用量海藻肥和大豆海藻肥處理根際土和非根際土，采集后混合均勻[12]。將采集后的土樣分別等量混合后分為2個部分，其中一部分置于-80 ℃超低溫冰箱中用于土壤微生物的測定，另一部分自然風干后過 0.25 mm 篩，測定土壤樣品的理化性質[13].。

1.3.3 煙葉樣品采集及測定 根據(jù)王新月等的方法[14]，檢測殺青樣煙葉元素含量。于移栽后60 d(旺長期)，每小區(qū)選取 5 株代表性煙株，采集相同部位2張煙葉，于105 ℃烘箱殺青30 min后于 65 ℃ 烘干至恒質量，用粉碎機粉碎后過20目篩，用于煙葉元素含量的測定。

1.3.4 高通量測序分析微生物群落 采用 DNeasy? PowerSoil? Kit(100)試劑盒提取DNA，隨后進行PCR擴增產物檢測[12]。由北京諾禾致源科技股份有限公司構建高通量測序文庫和完成基于Illumina MiSeq平臺的測序[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

運用FLASH軟件對Reads進行拼接。使用Uparse軟件在相似性為97%的水平下對優(yōu)質序列進行OTU聚類。對比silva 數(shù)據(jù)庫(細菌)以對OTU序列進行物種注釋及豐度分析。采用 Microsoft Excel 2019 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗(Duncan’s 新復極差法，α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同有機肥處理對煙株生長的影響

不同用量SF和SSF的施用對煙株團棵期地上部分和地下部分的鮮質量均產生了影響(表2)。SF300處理團棵期地下部鮮質量和地上部鮮質量較CK均大幅度提高，但與CK0無顯著差異；SF450處理團棵期地上部鮮質量和SF600處理團棵期地下部鮮質量分別較CK大幅度提高；SSF300、SSF600處理團棵期地下部鮮質量均與CK差異顯著，較CK分別提高101.35%、83.86%。結果表明，施用2種有機肥可不同程度地影響團棵期烤煙地下部、地上部鮮質量。

2種海藻有機肥對煙株的生長發(fā)育均具有較好的促進作用，但各農藝性狀指標對不同添加量的2種海藻有機肥的響應各異(表3)。與CK相比，SF各處理均可影響煙株的農藝性狀，其中SF450處理促進效果最佳。SF450處理與CK相比，農藝性狀各項指標均有較大提高。SSF的施用對煙株長勢整體改善更為可觀，其中SSF450、SSF600處理提升效果最為顯著，各項指標較CK均大幅度提高。表明中用量海藻肥、中用量和高用量大豆海藻肥促進煙株生長的效果較好。

2.2 不同有機肥處理對土壤化學性質的影響

2種有機肥施入煙田后，煙田的土壤化學性質見表4。根際土壤中各處理pH值和土壤速效磷含量較CK和CK0均無顯著差異；土壤速效鉀含量SF450、SSF450處理較CK顯著提高；而SSF450處理的土壤銨態(tài)氮含量較CK0提高64.86%，土壤硝態(tài)氮含量較CK、CK0分別提高156.76%、280.00%。非根際土壤中各處理pH值較N-CK、N-CK0無顯著差異；N-SSF450處理與N-CK相比，土壤速效磷含量、土壤速效鉀含量、土壤銨態(tài)氮含量、土壤硝態(tài)氮含量均顯著提高；而N-SF450處理與N-CK和N-CK0相比無顯著提高趨勢。SF、SSF的施用有效改善了土壤養(yǎng)分。

表4 不同有機肥處理旺長期土壤化學性狀比較

2.3 不同有機肥處理對煙葉元素含量的影響

旺長期階段，施用不同用量的2種有機肥能在不同程度上影響煙葉元素含量(表5)。與CK相比，SF300、SSF300處理煙葉全氮含量均無顯著差異，但煙葉全鉀含量顯著降低；而SF450、SF600、SSF450、SSF600處理煙葉全氮含量均顯著降低，但煙葉全鉀含量均無顯著差異；各處理煙葉全磷含量與CK均無顯著差異。

表5 不同有機肥處理旺長期煙葉元素含量比較

2.4 不同處理對微生物多樣性和結構的影響

本研究采用基于Bray-Curtis距離的主成分分析(PCA)比較了不同肥料處理條件下根際土壤(圖1-a)和非根際土壤(圖1-b)的細菌群落變化情況。從圖1-a中可以看出SSF450處理形成了遠離其他處理的明顯聚類，表明SSF的施用較大程度地改變了煙株根際土壤的細菌群落結構，而SF450處理和CK0對煙株根際土壤的細菌群落結構影響較小。圖1-b是非根際土壤細菌屬水平上的PCA，SF450和SSF450處理均與CK和CK0差異明顯，且SSF450處理差異最大；說明2種有機肥的施用均改變了煙株非根際土壤的細菌群落結構，且SSF450處理對煙株根際和非根際土壤細菌群落結構的影響更大。

不同試驗處理根際與非根際土壤微生物屬水平群落組成及相對豐度前10位物種如圖2所示。從圖2可以看出，根際土壤和非根際土壤中不同細菌屬數(shù)量，其中Acidibacter、Bryobacter以及Sphingomonas屬于根際土壤和非根際土壤的優(yōu)勢菌群。與CK相比，SF組中Acidibacter、Sphingomonas相對豐度升高，而在SSF450組中這3菌群相對豐度均升高；而與CK0相比，在SF450組中Sphingomonas相對豐度升高，在SSF450組中Bryobacter、Sphingomonas相對豐度升高；非根際土壤中，同NCK和NCK0相比較，Acidibacter、Sphingomonas在NSF450組和NSSF450組中相對豐度均顯著升高。

各處理組之間根際土壤和非根際土壤組間差異物種見圖3。根際土壤中SF450處理均與CK和CK0在Nocardioides中差異顯著，且SF450處理在該屬中的相對豐度均高于CK和CK0，而SSF450處理在Bryobacter中顯著高于SF450處理，在Nocardioides中與之相反；非根際土壤中NSF450、NSSF450處理在Gemmatimonas中均顯著高于NCK和NCK0，且NSF450處理在Nocardioides、Mizugakiiibacter中顯著高于NCK，在Bradyrhizobium、Chthonomonas中顯著高于NCK0，NSF450與NSSF450處理在Conexibacter、Nocardioides中差異顯著，且NSF450在3屬中的相對豐度均顯著高于NSSF450處理。

3 討論與結論

施用有機肥既可以為煙葉生產提供所需營養(yǎng)，提高煙葉產量和改善煙葉品質，還可以顯著改善土壤理化性質，同時使土壤肥力得到提高[15]。研究結果表明，2種海藻有機肥的施用明顯改善了煙株的生長狀況，團棵期地下部鮮質量和地上部鮮質量較CK相比均提高，且有機肥的施用使旺長期煙株農藝性狀與CK相比均大幅度增加。這與張蕊等的研究結果[15]一致，施用海藻有機肥可以通過多種機制的協(xié)同效應，大大改善土壤質量，誘導根系產生多胺和植物激素類物質，促進煙草根系和植株的生長發(fā)育。本試驗結果顯示，與CK相比，海藻肥和大豆海藻肥的施用對土壤養(yǎng)分含量進行了有效改善，尤其是大豆海藻肥的施用使土壤速效鉀、硝態(tài)氮等含量得到較大提高。何浩等發(fā)現(xiàn)，商品有機肥的施用使土壤有機質含量、速效磷含量、堿解氮含量均有顯著提高，說明施用有機肥能改善土壤理化特性和養(yǎng)分供應[16-17]。氮、磷、鉀元素直接參與植物的新陳代謝，與植物的生長關系密切[5]。本研究結果顯示，施用中、高用量海藻肥和大豆海藻肥后，煙葉全氮含量較CK顯著降低，但煙葉全鉀、全磷含量與CK無顯著差異，可能原因為此階段烤煙由氮代謝轉入碳代謝[18]，有關有機肥對煙葉養(yǎng)分吸收影響的機制還需要進一步研究闡明。

土壤微生物的群落組成及多樣性是反映土壤微生物群落生態(tài)功能的重要指標[4]。海藻肥和大豆海藻肥施用后根際土壤和非根際土壤在屬水平上的群落組成及相對豐度分別表現(xiàn)出不同的變化。這與張明宇等的研究結果[19]一致，有機肥的施入可以影響土壤微生物區(qū)系結構，還對微生物的群落多樣性有所調節(jié)。Chen等發(fā)現(xiàn)，海藻有機肥的施入使土壤優(yōu)勢菌群的相對豐度產生了有規(guī)律的變化，對土壤微生物的多樣性也有影響[20]。分析有機肥施用后根際土壤和非根際土壤在屬水平上的群落組成及相對豐度，Acidibacter、Sphingomonas和Bryobacter均屬于根際土壤和非根際土壤的優(yōu)勢菌群。Acidibacter和Bryobacter為酸桿菌門，Pramanik等研究發(fā)現(xiàn)，酸桿菌門可以調節(jié)土壤pH值和參與腐殖質分解的碳循環(huán)過程，還能促進土壤硝化反應，增加土壤中可溶性氮的含量[21]。2種有機肥處理的根際土壤和非根際土壤優(yōu)勢菌群Sphingomonas豐度較CK和CK0均增大。Krishna等研究發(fā)現(xiàn)，Sphingomonas屬于氨氧化細菌，與土壤硝化作用、土壤氮循環(huán)及生物固氮作用關系密切[22]。Yan等發(fā)現(xiàn)，Sphingomonas可以促進根系生長，并在提升煙葉品質方面發(fā)揮重要作用[23]。2種有機肥處理的根際土壤和非根際土壤中非優(yōu)勢菌群Massilia豐度與CK相比均有不同程度的增大。相關研究表明，Massilia具有溶磷作用，能有效改善土壤養(yǎng)分[24]，在防治土傳病害方面也具有重要作用[25]。分析各處理組之間根際土壤和非根際土壤組間的差異物種，有機肥的施用增加了土壤中有益菌群的相對豐度。相關研究表明，Nocardioides、Gemmatimonas對改善土壤環(huán)境起著積極作用[26-27]。Conexibacter和Bradyrhizobium具有生物固氮作用，可有效改善土壤養(yǎng)分[28-29]。Mizugakiiibacter和Chthonomonas與防治作物土傳病害關系密切[30-31]。

海藻肥和大豆海藻肥的施用可有效改善土壤理化性狀及養(yǎng)分，影響土壤微生物群落結構及多樣性，增加土壤中Sphingomonas、Acidibacter等有益細菌的相對豐度，從而促進了煙株在團棵期、旺長期的生長發(fā)育。綜合分析，中、高用量的海藻肥和大豆海藻肥的施用效果較佳，可滿足煙草生產的實際需求。