田野，劉肖（通信作者），于超，楊潤(rùn)，劉路錄，張志勇

1 解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 （海南三亞 572013）；2 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院（山東濟(jì)南 250012）；3 解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 （海南三亞 572013）

人體器官上皮因自然更新所脫落的細(xì)胞，被稱為脫落細(xì)胞。臨床常見的含有脫落細(xì)胞的樣本主要包括：尿液、痰液、乳汁、精液等自然排出液，胸水、腹水、心包積液、腦脊液、卵巢囊腫液等體腔抽出液，以及宮頸、口腔等體腔搔刮細(xì)胞。脫落細(xì)胞樣本能夠?yàn)槎喾N疾病的診斷提供重要參考依據(jù)[1-2]，且具有取樣簡(jiǎn)便、可多次重復(fù)、對(duì)患者損傷小、患者依從性高的優(yōu)勢(shì)。

涂片、推/拉片、滴片等是目前最常用的脫落細(xì)胞制片方法[3]，此類方法無需使用特殊的儀器設(shè)備，通常先將脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行固定和離心濃縮，然后將濃縮液滴在載玻片上，再分別通過涂抹、推拉或自然沉降的方法，使細(xì)胞在載玻片表面形成薄層，風(fēng)干后洗滌染色；此類方法靠肉眼預(yù)估細(xì)胞密度，制片往往出現(xiàn)細(xì)胞疊加堆積，導(dǎo)致鏡下觀察困難，易發(fā)生漏診、誤診[3]。薄層液基制片技術(shù)（thin-cytologic test，TCT），制片效果好且可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，目前多被應(yīng)用于宮頸脫落細(xì)胞樣本[4]；但是該方法制得的細(xì)胞制片較易脫片，無法耐受常規(guī)的高溫抗原修復(fù)步驟，因此病理科在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）染色檢測(cè)時(shí)，通常需要先制作細(xì)胞蠟塊再行切片染色[5]，同時(shí)該方法需要采用特定儀器和耗材，除宮頸細(xì)胞外，其他類型樣本由于處理步驟繁復(fù)且成本較高，臨床應(yīng)用較為受限。

制作細(xì)胞蠟塊，通常要先對(duì)脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行逐級(jí)離心濃縮，然后離心沉降，再將細(xì)胞團(tuán)塊從離心管中取出[6]，但該方法取出的細(xì)胞團(tuán)塊大小不一，易破碎丟失細(xì)胞。因此也有在細(xì)胞濃縮懸液中加入瓊脂、血漿凝固酶等使細(xì)胞凝結(jié)為團(tuán)塊[7]，再進(jìn)行石蠟包埋，但加入此類凝固劑后可能導(dǎo)致ICC 染色背景加深或出現(xiàn)污染。此外，上述方法均僅憑肉眼觀察和以往工作經(jīng)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞密度，缺乏客觀性。由此可見，以上細(xì)胞制片方法均存在一定局限。

基于上述情況，如何進(jìn)一步提高脫落細(xì)胞制片技術(shù)方法的標(biāo)準(zhǔn)化程度、效率，是技術(shù)工作者所面對(duì)的重要問題。為此，本研究旨在開發(fā)一種可快速進(jìn)行脫落細(xì)胞樣本固定、細(xì)胞密度估算和細(xì)胞團(tuán)塊制作的裝置，并對(duì)以該裝置制作的細(xì)胞蠟塊石蠟切片的蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和ICC 染色效果進(jìn)行觀察和評(píng)估，從而明確該裝置的臨床應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)新的脫落細(xì)胞樣本制片技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 設(shè)計(jì)

1.1 樣本采集和保存

本研究樣本為：經(jīng)病理檢測(cè)后剩余的胸、腹水各6 例，共計(jì)12 例樣本以細(xì)胞保存液（安必平，粵穗械備20140065 號(hào)）固定，樣本和保存液的體積比為5‥1。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板（Watson，177-112C）計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液密度后，將樣本置于50 ml 透明離心管中4 ℃保存，1 個(gè)月內(nèi)完成所有檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞離心管的設(shè)計(jì)、制作和驗(yàn)證

本裝置由細(xì)胞離心管和密度標(biāo)簽組成。其中，離心管包括管體和上、下管蓋（圖1 A）。管體外徑為28 mm，總高為 125 mm，與常見的50 ml 離心管外尺寸基本一致，適用于市面上常見的50 ml 離心機(jī)轉(zhuǎn)子，容積大于50 ml；下管口內(nèi)徑為4 mm，高度為10 mm；管壁厚度為2 mm，斜坡及下口處增加至3 mm，以確保其機(jī)械硬度。上、下口及管蓋均為螺紋口設(shè)計(jì)；此外，在下管蓋內(nèi)還增加了厚度為1.5 mm的橡膠密封墊片，以進(jìn)一步增強(qiáng)下口密封性。

目前，可用于三維立體（3 dimensions，3D）打印的材料很多[8]，其中丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（acrylonitrile butadiene styrene，ABS）是一種常用的熱塑性樹脂材料，具有強(qiáng)度高、韌性好、易于加工成型，具加工產(chǎn)品表面光潔，機(jī)械性能良好[9]。因此，我們使用了ABS 作為本裝置離心管的3D 打印材料，并打印了成品模型（圖1 B）。

圖1 細(xì)胞離心管

由于3D 打印建模的設(shè)計(jì)尺寸與成品尺寸存在一定偏差，尤其是螺紋等精密部件[10]，因此，為進(jìn)一步測(cè)試其剛性和密閉性，我們?cè)?D 打印模型中加入50 ml 蒸餾水，擰緊管蓋后，2 000 ×g，離心15 min，以管體、管蓋無變形同時(shí)無漏液為符合性能要求的標(biāo)準(zhǔn)，否則修改建模設(shè)計(jì)參數(shù)，以補(bǔ)償誤差值，重新打印模型。

1.3 密度標(biāo)簽的設(shè)計(jì)、制作和驗(yàn)證

密度標(biāo)簽由兩個(gè)不同灰度值的矩形和兩條平行橫線組成（圖2）。左側(cè)矩形三原色（red green blue，RGB）值為75、75、75；右側(cè)矩形RGB 值為200、200、200；兩個(gè)矩形大小均為7.5 mm×10 mm，橫線長(zhǎng)15 mm，間距為2 mm，RGB 值為0、0、0。

圖2 密度標(biāo)簽

12 例已固定的胸/腹水樣本各取4 ml，加至1 個(gè)50 ml 離心管中并充分混合，計(jì)數(shù)混合細(xì)胞密度并離心濃縮，再以0.9%氯化鈉溶液將混合細(xì)胞配制為1×106、5×105、1×105、5×104、1×104個(gè)/ml 不同密度但體積均為15 ml 的細(xì)胞懸液，裝入50 ml 透明離心管中；將密度標(biāo)簽貼附在離心管外壁，透過細(xì)胞懸液觀察標(biāo)簽，并記錄觀察結(jié)果；隨后將密度標(biāo)簽分別貼附在裝有12 例胸/腹水樣本的離心管外壁，根據(jù)上述觀察結(jié)果評(píng)估各例樣本密度，并與細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.4 細(xì)胞石蠟芯片制作及切片

12 例胸/腹水樣本漩渦震蕩15 s 混勻，各取40 ml 加入本裝置離心管中，2 000 ×g 離心15 min，傾去上清液后，加入10 ml 95%乙醇，2 000 ×g 離心15 min，室溫靜置15 min，擰開上管蓋傾去上清液。擰開下管蓋，用3.5 mm 直徑的玻璃攪拌棒從管內(nèi)自下管口推出細(xì)胞團(tuán)塊，記錄細(xì)胞團(tuán)塊直徑和長(zhǎng)度，放入包埋盒，以全自動(dòng)脫水機(jī)（Sakura，VIP6 AI）進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，制成細(xì)胞石蠟芯片。隨后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為4 μm，以防脫載玻片撈片，60 ℃烤至干片，4 ℃保存，1 個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)。

1.5 HE 染色、ICC 染色和結(jié)果評(píng)估

細(xì)胞芯片石蠟切片采用全自動(dòng)染色封片機(jī)（Leica，CV5030）進(jìn)行HE 染色，采用全自動(dòng)免疫組化儀（Ventana，BenchMark ULTRA）進(jìn)行廣譜細(xì)胞角蛋白（pan cytokeratin，CK pan）（安必平，IM067）、細(xì)胞核相關(guān)抗原（nuclear-associated antigen ki-67，Ki-67）（Ventana，5278384001）ICC 染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并采集圖像，分別對(duì)細(xì)胞形態(tài)和ICC 染色陽性信號(hào)的表達(dá)部位、強(qiáng)度、陽性細(xì)胞百分比、染色背景等進(jìn)行評(píng)估。

2 應(yīng)用效果

2.1 細(xì)胞離心管驗(yàn)證結(jié)果

以該細(xì)胞離心管3D 模型承裝50 ml 蒸餾水，2 000 ×g 離心15 min，判定標(biāo)準(zhǔn)為管體無變形，管口無漏液。經(jīng)驗(yàn)證，性能符合要求。

2.2 密度標(biāo)簽驗(yàn)證結(jié)果

透過離心管和不同濃度細(xì)胞懸液，觀察密度標(biāo)簽（圖3），記錄標(biāo)簽2 個(gè)區(qū)域內(nèi)的黑色橫線是否可以被清晰分辨，結(jié)果如表1 所示。

圖3 密度標(biāo)簽觀察結(jié)果

采用密度標(biāo)簽，參照表1 所述標(biāo)簽觀察結(jié)果，評(píng)估12 例胸/腹水樣本細(xì)胞密度，并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，結(jié)果如表2 所示。

表1 密度標(biāo)簽觀察結(jié)果

表2 脫落細(xì)胞樣本信息

2.3 細(xì)胞團(tuán)塊和石蠟芯片

胸、腹水樣本各取40 ml，以本研究設(shè)計(jì)的細(xì)胞離心管，制作為長(zhǎng)度不一（表2）但直徑均為4 mm 的圓柱形細(xì)胞團(tuán)塊（圖4A）。其中有2 例樣本（P1、A6）細(xì)胞數(shù)量過少無法直接采用本裝置制作為細(xì)胞團(tuán)塊，取該2 例樣本各120 ml，分3 管離心，隨后將3 管沉渣混合至1 管中，以0.9%氯化鈉溶液重懸為40 ml，再行離心制作細(xì)胞團(tuán)塊。隨后將12 例胸/腹水樣本圓柱形細(xì)胞團(tuán)塊按順序排列，制作為細(xì)胞石蠟芯片，然后切片并進(jìn)行染色（圖4B）。

圖4 細(xì)胞團(tuán)塊及細(xì)胞石蠟芯片

2.4 HE 染色和ICC 染色結(jié)果

細(xì)胞芯片石蠟切片HE 染色結(jié)果顯示（圖5A～B），細(xì)胞密度適中且無重疊，形態(tài)完整，核、膜、質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰；ICC 染色結(jié)果顯示（圖5C～F），細(xì)胞形態(tài)完整，無脫片現(xiàn)象，CK pan 和Ki67 陽性信號(hào)清晰，定位準(zhǔn)確。

圖5 HE 染色和ICC 染色結(jié)果（200 ×）

3 討論

液體中顆粒成分密度越高，渾濁度越高，透過液體觀察某一物體的清晰度則越低[11]。根據(jù)這一原理，本研究設(shè)計(jì)了一種密度標(biāo)簽，將此標(biāo)簽貼附在裝有細(xì)胞懸液的透明離心管外壁，透過細(xì)胞懸液觀察標(biāo)簽，以標(biāo)簽2 個(gè)區(qū)域中的黑色雙線是否清晰可見來評(píng)估細(xì)胞懸液密度。本研究對(duì)12例胸/腹水樣本進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)密度標(biāo)簽評(píng)估結(jié)果和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果基本符合，該結(jié)果提示，較目測(cè)，采用此密度標(biāo)簽可更有效地區(qū)分密度高于或低于5×105個(gè)/ml 的體液樣本。

本研究進(jìn)一步采用特殊設(shè)計(jì)的細(xì)胞離心管，制作了細(xì)胞團(tuán)塊，結(jié)果顯示，體液樣本中的細(xì)胞數(shù)量與采用本裝置制成的細(xì)胞團(tuán)塊體積并不成正比，推測(cè)是由于體液中所含細(xì)胞類型和比例差距較大導(dǎo)致。以體液樣本體積為40 ml 計(jì)算，當(dāng)細(xì)胞密度在5×105個(gè)/ml 以上，即可采用本裝置一步獲取直徑為4 mm、長(zhǎng)度在1 mm 以上可用于進(jìn)行石蠟包埋的細(xì)胞團(tuán)塊；但當(dāng)細(xì)胞密度不足5×105個(gè)/ml，則需要進(jìn)行預(yù)濃縮，才能使用本裝置制作細(xì)胞團(tuán)塊。本研究的12 例樣本中，僅有2 例（胸水、腹水各1 例）需要進(jìn)行預(yù)濃縮，因此本研究設(shè)計(jì)的離心管適用于絕大部分胸/腹水樣本細(xì)胞團(tuán)塊的制作。

采用本裝置處理脫落細(xì)胞樣本，不但能夠更準(zhǔn)確地預(yù)估樣本中的細(xì)胞數(shù)量是否滿足制作蠟塊所需，幫助技術(shù)人員確定所需樣本體積；還可實(shí)現(xiàn)加樣后一次直接成型，獲得直徑一致的圓柱形細(xì)胞團(tuán)塊，團(tuán)塊緊致不易松散丟失細(xì)胞，包埋切片后可形成直徑基本相同的圓點(diǎn)，且無外源性物質(zhì)，對(duì)HE染色和ICC 染色結(jié)果無影響。上述結(jié)果提示本裝置臨床應(yīng)用效果較好。目前尚無類似裝置在臨床應(yīng)用，因此本裝置已申請(qǐng)國(guó)家實(shí)用新型專利并已受理（受理號(hào)202220169770.9）。

由于痰液、尿液、腦脊液等樣本中細(xì)胞含量較少，本裝置目前的設(shè)計(jì)并不適用上述檢測(cè)，我們還將進(jìn)一步研究低細(xì)胞含量樣本的處理方法。

4 結(jié)論

本研究介紹了一種可用于脫落細(xì)胞樣本固定、細(xì)胞密度估算和細(xì)胞團(tuán)塊制作的裝置，該裝置適用于細(xì)胞密度在5×105個(gè)/ml 以上的胸、腹水樣本，能夠提高檢測(cè)效率，且有利于建立標(biāo)準(zhǔn)化的脫落細(xì)胞檢測(cè)流程，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。