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      免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)檢測食品中嘔吐毒素的方法優(yōu)化

      2023-03-19 12:10:44鄒勇平周元元梁志春周可欣
      食品安全導(dǎo)刊 2023年6期
      關(guān)鍵詞:親和柱小麥粉黃酒

      胡 云,鄒勇平,王 帥,周元元,梁志春,周可欣

      (揚(yáng)州市食品藥品檢驗檢測中心,江蘇揚(yáng)州 225000)

      嘔吐毒素是鐮刀屬真菌污染玉米、小麥等谷物 后產(chǎn)生的具有一定毒性的真菌毒素[1],高劑量暴露后會引起拒食、嘔吐和免疫功能抑制等癥狀[2]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中嘔吐毒素的限量要求有著嚴(yán)格的規(guī)定[3]。食品中嘔吐毒素的檢測方法較多,有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法等,其中液相色譜法因具有操作簡便、定量準(zhǔn)確、效率高等優(yōu)點,是檢驗檢測機(jī)構(gòu)最常用的毒素檢測方法[4]。本實驗對小麥粉、醋和黃酒中嘔吐毒素的凈化方法和液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的食品中嘔吐毒素的檢測方法。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 材料

      小麥粉、醋、黃酒均購于超市;嘔吐毒素免疫親和柱:3 mL/支,美國Romer labs 公司;934-AH玻璃纖維濾紙,英國Whatman 公司。

      1.1.2 試劑

      甲醇、乙腈,色譜純,默克;聚乙二醇,化學(xué)純,國藥;氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀,分析純,國藥;超純水,由Milli-Q 超純水機(jī)制備;嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液(197.2 mg·L-1);溶劑(甲醇),色譜級,安譜。

      1.2 儀器與設(shè)備

      1260 高效液相色譜儀(配置DAD 檢測器),美國Agilent 公司;Milli-Q 超純水儀,美國Millipore公司;S210-K 酸度計,美國METTLER TOLEDO公司;XSR204 電子分析天平,美國METTLER TOLEDO 公司;AH40 全自動均質(zhì)器,睿科集團(tuán)股份公司;Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀,??萍瘓F(tuán)股份公司;Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀,睿科集團(tuán)股份公司。

      1.3 實驗方法

      1.3.1 前處理方法

      (1)提取。①小麥粉。稱取小麥粉25 g 于均質(zhì)瓶中,參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?;苌锏臏y定》(GB 5009.111——2016)的方法[4],加入5 g 聚乙二醇和100 mL 水,于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s,立刻轉(zhuǎn)移至離心管中,于6 000 r·min-1離心10 min,上清液經(jīng)玻纖濾紙過濾后備用。②醋。稱取醋25 g,滴加50%(v/v)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0,參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?;苌锏臏y定》(GB 5009.111——2016)的方法[4],加入5 g 聚乙二醇,水定容至100 mL,混勻,全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中,于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s,立刻用玻纖濾紙過濾后備用。③黃酒。稱取黃酒20 g,參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?;苌锏臏y定》(GB 5009.111——2016)的方法[4],加入1 g 聚乙二醇,水定容至25 mL,混勻,全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中,于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s,立刻用玻纖濾紙過濾后備用。

      (2)凈化。將冷藏的嘔吐毒素免疫親和柱取出放置至室溫,吸取2.0 mL 備用的濾液,以1.0 mL·min-1的速度通過免疫親和柱,先用5 mL PBS(pH=7.0)淋洗,再用5 mL 水淋洗,淋洗速度2.0 mL·min-1,直至淋洗液全部通過免疫親和柱,吹干柱體至無殘留淋洗液,將1.5 mL 甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次低速洗脫,收集全部洗脫液。

      (3)濃縮。將洗脫液置于45 ℃的水浴中,以 0.5 L·min-1的氮氣吹至近干,流動相定容至1.0 mL,濾膜過濾后上機(jī)分析。

      1.3.2 液相色譜條件

      色 譜 柱:Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm),美國Agilent 公司;流動相:乙腈∶水=10 ∶90;流速:0.8 mL·min-1,柱溫:35 ℃,進(jìn)樣量:50 μL;檢測波長:218 nm。

      1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

      分別移取5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL和250 μL 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于10 mL 容量瓶中,流動相定容至刻度,配制得98.6 ng·mL-1、197.2 ng·mL-1、493.0 ng·mL-1、986.0 ng·mL-1、1 972.0 ng·mL-1和 4 930.0 ng·mL-1的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 前處理條件和色譜條件的優(yōu)化

      2.1.1 優(yōu)化免疫親和柱的凈化條件

      研究嘔吐毒素的甲醇洗脫曲線,用2.0 mL 甲醇洗脫柱載量為1 084.6 ng 的嘔吐毒素,分4 次每次以0.5 mL·min-1的流速向免疫親和柱中注入0.5 mL 甲醇,等待10 s,注入和等待期間不使甲醇流出,然后以0.5 mL·min-1的流速洗脫,待此部分甲醇全部流出后,進(jìn)行下一次洗脫,直至使全部的2.0 mL 甲醇洗脫液流出。此方法的嘔吐毒素洗脫情況見圖1。由圖1 可知,第1 次、第2 次和第3 次的甲醇洗脫液中嘔吐毒素的量分別為29.1 ng、839.0 ng 和201.0 ng,第4 次的甲醇洗脫液中沒有檢測到嘔吐毒素,洗脫液中嘔吐毒素的總量為1 069.1 ng,柱回收達(dá)到98.6%,可見,使用1.5 mL 甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次洗脫,能得到理想的柱回收效果。

      圖1 甲醇低流速分次洗脫時嘔吐毒素的分布情況

      將12.4 ng、19.7 ng、25.0 ng、49.3 ng、 98.6 ng、197.2 ng、256.4 ng、295.8 ng、493.0 ng、754.3 ng、1 005.7 ng、1 104.3 ng、1 202.9 ng、 1 301.5 ng、1 672.3 ng、1893.1 ng、1 991.7 ng、2 090.3 ng、2 253.0 ng、2 353.0 ng、2 504.0 ng、 2 997.4 ng、4 003.2 ng 和5 008.9 ng 的嘔吐毒素分別加載到免疫親和柱,考察柱回收率,結(jié)果見圖2。當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在12.4 ~2 504.0 ng 時,柱回收率在82.6%~103.2%,柱效較高,當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在2 997.4 ng 時,柱回收率在78.3%,柱效開始降低,當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在5 008.9 ng 時,柱回收率已持續(xù)降低至52.9%。由于嘔吐毒素在自然界中的污染率較高,含量也高,高濃度的嘔吐毒素應(yīng)在載柱前進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

      圖2 嘔吐毒素免疫親和柱柱效(12.4 ~5 008.9 ng)

      2.1.2 優(yōu)化色譜條件

      以甲醇∶水=20 ∶80 的流動相進(jìn)行分析,免疫親和柱凈化后的嘔吐毒素在色譜分離的過程中仍存在雜質(zhì)峰的干擾,改用乙腈∶水=10 ∶90 的流動相進(jìn)行分析,色譜基線更平穩(wěn),嘔吐毒素色譜峰的峰型得到了改善,與雜質(zhì)峰能實現(xiàn)有效分離,與TAN等[5]的實驗結(jié)果一致,因此,實驗選擇以乙腈∶水=10 ∶90 的流動相分析嘔吐毒素。

      2.2 方法的線性范圍與檢出限、定量限

      嘔 吐 毒 素 在98.6 ~4 930.0 ng·mL-1的 濃 度 范圍內(nèi),校正曲線y=0.063 35x-0.815 90,相關(guān)系數(shù)為0.999 921。用實驗方法檢測小麥粉、醋和黃酒中的嘔吐毒素,檢出限分別為1.2 μg·kg-1、1.2 μg·kg-1和4.2 μg·kg-1,定 量 限 分 別 為4 μg·kg-1、4 μg·kg-1和14 μg·kg-1,低于國家標(biāo)準(zhǔn)中50 ~100 μg·kg-1的檢出限,100 ~200 μg·kg-1的定量限,說明實驗采用的方法具有較高的檢測靈敏度。

      2.3 方法的加標(biāo)回收率與精密度

      以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間點和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最高殘留限量(標(biāo)準(zhǔn)沒有規(guī)定的,則選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度較高的點)進(jìn)行3 水平的加標(biāo)回收試驗[3-4,6],每個水平重復(fù)6 次,計算平均加標(biāo)回收率和實驗室內(nèi)變異系數(shù),結(jié)果見表1。小麥粉、醋、黃酒中嘔吐毒素的3 水平加標(biāo)平均回收率在84.3%~104.7%,實驗室內(nèi)變異系數(shù)在0.3%~5.5%,符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗方法確認(rèn)的技術(shù)要求[6]。其中,小麥粉的嘔吐毒素3 水平加標(biāo)平均回收率較低,變異系數(shù)較高,主要是因為小麥粉為固體粉末狀,嘔吐毒素在其中分布的均勻度不及醋和黃酒。3 種食品中均檢出了嘔吐毒素,小麥粉中的嘔吐毒素源自小麥在生長期受到的鐮刀屬真菌的污染,黃酒和醋中的嘔吐毒素源自生產(chǎn)原料中含有受鐮刀屬真菌污染的麥麩[7],由于國家標(biāo)準(zhǔn)并未對黃酒和醋中的嘔吐毒素規(guī)定限量要求,因此,有必要對市場上的醋和黃酒進(jìn)行嘔吐毒素的風(fēng)險監(jiān)測和分析評估。

      表1 樣品中嘔吐毒素的加標(biāo)回收率及實驗室內(nèi)變異系數(shù)

      2.4 方法的準(zhǔn)確度

      對嘔吐毒素特性值為1 303 μg·kg-1,特性值區(qū)間為1 043 ~1 563 μg·kg-1的小麥粉質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果為1 320 μg·kg-1,說明本試驗采用的檢測方法準(zhǔn)確度高,適用于食品中嘔吐毒素的檢測。

      3 結(jié)論

      實驗優(yōu)化了食品中嘔吐毒素的免疫親和柱的凈化方法和色譜分離方法,方法靈敏度高,檢出限和定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法,定量結(jié)果準(zhǔn)確。實驗使用了自動化程度高的均質(zhì)器、固相萃取儀和平行濃縮儀,在提高工作效率的同時,檢測結(jié)果的穩(wěn)定性也得到了提升。綜上,本方法適用于食品中嘔吐毒素含量的檢測。嘔吐毒素主要存在于谷物和谷物產(chǎn)品中[8],但是,以被嘔吐毒素污染的谷物為原料的發(fā)酵產(chǎn)品(如啤酒)的安全性也受到了越來越多的關(guān)注[9],因此,鑒于我國國家標(biāo)準(zhǔn)目前沒有對這類食品中的嘔吐毒素規(guī)定限量要求,今后對這類食品中嘔吐毒素的污染水平有必要進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)測和安全性 評估。

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