人工飼料和桑葉對家蠶機體3 種代謝酶活性的影響

王永生，朱水芬，陳 松，陳云明，江 亞，范永慧，楊啟慧，李瓊艷，楊 海

（1.云南省農業(yè)科學院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.云南省蠶桑育種及高效生產工程研究中心，云南 蒙自 661101）

羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarE）、乙酰膽堿酯 酶（Acetylcholinesterase，AchE）和 堿 性 磷 酸 酶（Alkaline phosphatase，ALP）是生物體重要的代謝酶類[1-2]。CarE 是一類廣泛存在于動物、植物、微生物和昆蟲體內的代謝解毒酶，不僅能將內源性或外源性含有酯鍵的化合物分解為對應的醇和酸，而且在機體脂類物質轉運和發(fā)育調控等方面也發(fā)揮了一定的功能[3-4]。AchE 是生物體一種極其重要的神經遞質水解酶，其主要功能是在膽堿能神經突觸處通過快速水解神經遞質乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach），從而終止Ach 對乙酰膽堿受體的刺激作用，保證神經沖動在突觸間的正常傳導，維持生物體的正常生理功能。同時，AchE還是有機磷類和氨基甲酸酯類農藥的重要作用靶標[5-6]。CarE 和AchE 作為昆蟲機體重要的兩類酯酶，主要介導昆蟲機體的抗逆性過程[7-8]。家蠶CarE 和AchE 在機體代謝有機磷和氨基甲酸酯類農藥以及抵御病原微生物侵染過程中發(fā)揮了一定的功能，它們的活性大小在一定程度上反映了蠶體的代謝及生理狀態(tài)[8-9]。ALP 是一類高度保守的磷酸水解酶，直接參與了生物體磷酸基團的轉移和代謝過程[10-11]。ALP 不僅參與昆蟲的生長發(fā)育、神經傳導、物質代謝和滯育等過程，而且還參與了昆蟲機體的解毒代謝和免疫防御過程[12-13]。已有研究表明，ALP 參與家蠶機體營養(yǎng)物質的代謝吸收，該酶活性的增強有助于提高蠶體的抗逆性及繭絲產量和質量[14]。

家蠶（Bombyx mori）作為一種重要的特種經濟昆蟲，主要以桑葉為單一食物來源。人工飼料是根據家蠶的食性特點和營養(yǎng)要求配制成的用以代替桑葉的飼料，因其可以突破季節(jié)限制、便于實行機械化，越來越受到人們的關注[15]。人工飼料養(yǎng)蠶是今后養(yǎng)蠶業(yè)發(fā)展的重要方向，但是與桑葉飼育相比，全齡用人工飼料飼育的蠶存在體質弱、發(fā)育不齊、產絲量少等問題[16]。改良人工飼料的配方，探索適宜的人工飼料添加劑，使其有利于激活蠶體代謝酶和解毒酶活性，增強自身體質和提高抗逆性，成為亟待解決的問題。CarE、AchE 和ALP 對昆蟲機體生物代謝的穩(wěn)定性極其重要，其活性大小與機體的生理狀態(tài)及抗逆性和抗病性密切相關。目前，關于人工飼料對家蠶體內ALP、AchE 和CarE 活性影響的研究尚未見報道。

鑒于此，通過比較家蠶取食人工飼料和桑葉后機體不同組織ALP、AchE 和CarE 的活性差異，探究人工飼料和桑葉飼育對蠶體3 種代謝酶活性的影響，明確飼料因素的變化對家蠶抗性生理的影響，以期為優(yōu)化和改良人工飼料配方及飼育技術提供參考。

1 材料和方法

1.1 家蠶來源

P50家蠶品種由云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、雪科牌IMS-40 雪花制冰機和HSW24 型電熱恒溫水浴鍋購自廣州深華生物技術有限公司；ThermoFisher 雙光束紫外/可見分光光度計和高速冷凍離心機購自昆明伯騰儀器有限公司。

1.2.2 主要試劑 家蠶人工飼料購自重慶正佳飼料有限公司；無水乙醇和冰醋酸購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012S）購自碧云天生物技術有限公司。堿性磷酸酶ALP 活性檢測試劑盒（貨號：BC2140）、羧酸酯酶CarE 活性檢測試劑盒（貨號：BC0840）和乙酰膽堿酯酶AchE 活性檢測試劑盒（貨號：BC2020）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 處理分組和樣品采集 用新鮮桑葉飼養(yǎng)家蠶至五齡起，隨機分成2 組，一組繼續(xù)用桑葉飼養(yǎng)，另一組改用人工飼料飼養(yǎng)。從開始進食計時，隨后每隔12 h，冰上解剖家蠶幼蟲，取血淋巴、中腸組織?？偣踩〔? 次（取材時間點12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h）。2 個處理組每次取樣均設3 次重復，每個重復取4 頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存。

1.3.2 酶液制備和活性測定 中腸組織酶液制備：取0.5 g 的中腸組織放入預冷的研缽中，分別加入1.5 mL 各個酶活性測定試劑盒提供的抽提液，迅速充分研磨勻漿，隨后將勻漿液轉移至新的2 mL離心管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，吸取上清液作為待測酶液。血淋巴酶液制備：取350 μL血淋巴，分別加入1.0 mL 酶活性測定試劑盒提供的抽提液，隨后在4 ℃條件下10 000 r/min 離心10 min，棄沉淀取上清液，即為待測酶液。按照BCA 蛋白質測定試劑盒和3種酶（堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶）試劑盒操作分別測定蛋白質濃度和酶活性。

1.4 數據分析

利用Excel 2016 和SPSS 21.0 對試驗數據進行整理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 人工飼料和桑葉飼育的家蠶不同組織ALP活性變化

圖1為喂食人工飼料和桑葉后家蠶血淋巴和中腸組織中ALP 活性變化情況。由圖1A 可知，在測定的時間內，喂食人工飼料組家蠶血淋巴中ALP 活性變化不明顯，而桑葉組ALP 活性在后期明顯增強。在12～48 h，喂食人工飼料組和桑葉組血淋巴ALP 活性無顯著差異，而在60、72 h，桑葉組的ALP活性顯著高于人工飼料組（P＜0.05），酶活性分別為人工飼料組的1.42、1.81倍。

圖1B 結果顯示，桑葉組家蠶中腸ALP 活性在36 h 開始顯著高于人工飼料組，在48、60、72 h 酶活性持續(xù)增強，且極顯著高于人工飼料組（P＜0.01），酶活大小分別是人工飼料組的2.88、1.86、2.13倍。

圖1 人工飼料和桑葉對家蠶血淋巴（A）和中腸（B）ALP活性的影響Fig.1 Effects of artificial diet and mulberry leaves on ALP enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

2.2 人工飼料和桑葉飼育的家蠶不同組織CarE活性變化

圖2A 結果顯示，家蠶血淋巴中CarE 活性整體呈現逐漸增強的趨勢，其中人工飼料組酶活性略高于桑葉組，但差異不顯著。由圖2B可知，在12 h，人工飼料組和桑葉組中腸CarE活性無差異；而在24 h和36 h，人工飼料組CarE 活性開始增強，并顯著高于桑葉組（P＜0.05）；隨著喂食時間的延長，人工飼料組中腸CarE 活性持續(xù)增加，在48 h 和60 h，CarE活性極顯著高于桑葉組（P＜0.01），其中在60 h，酶活性升至最高值，約為桑葉組的2.61 倍；而在72 h，CarE 活性雖有一定程度的降低，但仍顯著高于桑葉組（P＜0.05）。

圖2 人工飼料和桑葉對家蠶血淋巴（A）和中腸（B）CarE活性的影響Fig.2 Effects of artificial diet and mulberry leaves on CarE enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

2.3 人工飼料和桑葉飼育的家蠶不同組織AchE活性變化

如圖3A 所示，在12 h 和24 h，喂食桑葉組血淋巴AchE 活性略低于人工飼料組，但差異不顯著。在36 h，桑葉組血淋巴AchE 活性開始增加并且在48 h、60 h和72 h持續(xù)高于人工飼料組，分別是人工飼料組的1.52 倍、1.64 倍和1.71 倍，差異達到顯著水平（P＜0.05）。圖3B結果表明，在測定的時間范圍內，喂食桑葉組家蠶中腸AchE 活性均比人工飼料組高。其中在12～48 h，桑葉組AchE 活性顯著高于人工飼料組（P＜0.05）；隨著喂食時間的推移，桑葉組AchE 活性繼續(xù)增強，在60 h 和72 h 持續(xù)高于人工飼料組，且差異達到極顯著水平（P＜0.01），AchE活性分別為人工飼料組的2.68倍和2.84倍。

圖3 人工飼料和桑葉對家蠶血淋巴（A）和中腸（B）AchE活性的影響Fig.3 Effects of artificial diet and mulberry leaves on AchE enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

3 結論與討論

ALP、CarE 和AchE 被認為是昆蟲機體重要的三大代謝酶，其活性大小受到不同植物飼料、病原微生物及生長環(huán)境的影響。薛英偉等[17]比較了桑葉和柘葉對家蠶ALP、AchE、CarE 活性的影響，發(fā)現柘葉飼養(yǎng)組蠶體內的ALP 和AchE 活性比桑葉飼養(yǎng)組顯著降低，而CarE的活性顯著高于桑葉組。家蠶感染核型多角體病毒（BmNPV）后，蠶體內的CarE 活性會大幅度上升，ALP 與AchE 活性顯著下降。另外，接種家蠶濃核病毒（BmDNV）后12 h，家蠶抗性品系中腸羧酸酯酶基因BmCarE及其酶活性顯著升高，提示羧酸酯酶在抵御BmNPV 和BmDNV 過程發(fā)揮一定的功能[18]。喂食槲皮素，能有效誘導CarE 的活性，并且酶活性隨喂食槲皮素濃度的增加呈現先升后降的趨勢，暗示CarE具有對外源物質解毒代謝的功能[19]。韓琨[20]的研究結果表明，人工飼料育家蠶中腸的α-淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶等活性均低于桑葉育家蠶。

本研究測定了人工飼料和桑葉飼育對五齡家蠶中腸和血淋巴ALP、CarE 和AchE 活性的影響，結果顯示，桑葉組的ALP 和AchE 活性在家蠶血淋巴和中腸中均顯著高于人工飼料組。另外，桑葉組家蠶血淋巴CarE活性與人工飼料組無明顯差異，而中腸CarE 活性顯著低于人工飼料組。一般認為，ALP和AchE 活性大小反映了昆蟲正常生理代謝活動的強弱。ALP 是昆蟲體內調控磷酸代謝的關鍵酶，參與了機體的能量代謝和生長發(fā)育過程[13-14]。AchE作為神經遞質乙酰膽堿的水解酶，其活性大小是機體細胞代謝狀態(tài)的一個重要指標[21-22]。抑制昆蟲AchE基因的表達，降低AchE 活性，幼蟲會出現生長發(fā)育遲緩，雌性成蟲的造卵量和產卵率也顯著降低[22-23]。CarE 被認為是昆蟲機體負責解毒的重要水解酶，其活性受到外源化合物、次生代謝產物及其他 病 原 微 生 物 的 影 響[2-3]。ZHOU 等[24]和CAPPELLOZZA 等[25]研究發(fā)現，人工飼料飼育的家蠶，機體能量代謝進程減緩，幼蟲抗病性弱，絲蛋白合成減少，分析認為是家蠶進食人工飼料后，參與物質能量代謝的一系列相關酶活性受到不同程度的抑制，影響了正常的生理代謝活動。喂食人工飼料的家蠶中腸CarE酶活性顯著高于桑葉飼喂組，推測可能是人工飼料中的某些成分或是代謝產物對中腸組織有一定的損傷或毒害作用，進而導致CarE活性的升高。綜上，采用人工飼料飼養(yǎng)的家蠶，其血淋巴和中腸三大代謝酶活性受到一定的影響，導致蠶體正常的生理代謝進程受阻，抵御不良環(huán)境的能力減弱。