李博雅，李 彤，祖向陽，王 沖，秦 玲

（1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽，471003；2.河南科技學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽，471000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 鄭州，450052）

急 性 髓 系 白 血 病（acute myeloid leukemia，AML）是一種異質(zhì)性的惡性克隆性疾病，是成人最常見的血液癌之一［1］。其特征在于造血祖細(xì)胞遺傳改變的積累及正常自我更新機(jī)制、細(xì)胞增殖及分化的改變［2，3］?；颊哳A(yù)后差別較大，死亡率高。AML的診斷和預(yù)后主要基于形態(tài)學(xué)、免疫表型、染色體核型和分子特征等［4］。臨床和遺傳學(xué)的預(yù)后標(biāo)志物在AML 患者的評估和指導(dǎo)治療中至關(guān)重要［3］。最近的發(fā)現(xiàn)也揭示了轉(zhuǎn)錄失調(diào)和表觀遺傳機(jī)制在AML 發(fā)病機(jī)制中的重要作用［4］。

CANX（calnexin），位于人類5 號染色體（5q35）上，作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白通過多種方式參與蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞能量平衡及自噬等過程［5］。一些研究發(fā)現(xiàn)，包括CANX 在內(nèi)的不同預(yù)后模型與AML、膠質(zhì)瘤及腎透明細(xì)胞癌等患者危險分層及預(yù)后 相 關(guān)［6-8］。研 究 發(fā) 現(xiàn)，CANX 在 肺 癌［9］、口 腔 鱗癌［10］及乳腺癌［11］等疾病中表達(dá)上調(diào)，可能作為一種生物標(biāo)志物用于疾病診斷及治療。然而，CANX 在AML 中的作用機(jī)制及預(yù)后價值仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了CANX 基因表達(dá)與AML 患者預(yù)后及免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)。為AML 提供了新的潛在生物標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

從UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（http：//xena.ucsc.edu/）下載151 例AML 樣本（TCGA-LAML）（實(shí)驗(yàn)組）及337 例健康人全血樣本（GTEx）的原始RNA 表達(dá)譜及 相 應(yīng) 臨 床 信 息［12］。從GEO 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載包含422 例AML樣本的GSE37642 數(shù)據(jù)集（驗(yàn)證組）的RNA 表達(dá)譜、平臺文件（GPL96-57554）及臨床信息［13］。RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)均進(jìn)行l(wèi)og2（FPKM+1）歸一化處理。從CellMiner 數(shù) 據(jù) 庫［14］（https：//discover.nci.nih.gov/cellminer/）下載60 種癌細(xì)胞株的RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)及751 種藥物及化合物的半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）。為了更好的預(yù)測AML 患者的藥物敏感性，僅納入6 種白血病細(xì)胞株進(jìn)行藥物敏感性分析。

1.2 AML 中CANX 的 表 達(dá) 水 平

使用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org/）探索CANX 在所有TCGA 腫瘤及正常組織間的表達(dá)情況［15］。使用“l(fā)imma”R 包分別將實(shí)驗(yàn)組及驗(yàn)證組中的RNA 表達(dá)譜與GTEx 健康樣本中的RNA 表達(dá)譜進(jìn)行合并，得到相應(yīng)的RNA 表達(dá)矩陣。并從中提取出CANX 表達(dá)水平得到相應(yīng)的CANX表達(dá)矩陣。利用“l(fā)imma”及“beeswarm”R 包進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)AML 樣本及健康樣本間的CANX表達(dá)差異。

1.3 AML 患者的預(yù)后分析

排除無完整生存信息的樣本，將TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中132 例AML 樣本及GSE37642 數(shù)據(jù)集中417 例AML 樣本納入生存分析。利用“survival”R包繪制K-M 生存曲線探索CANX 表達(dá)與AML 患者生存的關(guān)系?；赥CGA-LAML 數(shù)據(jù)集中患者生存數(shù)據(jù)（死亡或復(fù)發(fā)），使用X-tile 3.6.1 軟件計(jì)算患者最佳總生存時間（overall survival，OS）閾值［16］。根據(jù)中位最佳OS 閾值將患者分為CANX 高表達(dá)組（n=40）及低表達(dá)組（n=92），以探討CANX 表達(dá)的臨床意義。利用“survival”R 包進(jìn)行單因素及多因素COX 回歸分析發(fā)現(xiàn)AML 患者的獨(dú)立預(yù)后因素。P均＜0.05 的變量被認(rèn)為是AML 患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。使用“readxl”R 包預(yù)測CANX 表達(dá)與藥物敏感性的關(guān)系。

1.4 CANX 與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)

從TCGA-LAML 的RNA 表達(dá)矩陣中提取出編碼mRNA 的基因及其表達(dá)量，得到mRNA 表達(dá)矩陣。去除在所有樣本中均不表達(dá)的基因，并對重復(fù)基因取均值，得到校正后mRNA 表達(dá)矩陣。以P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用“e1071”、“parallel”及“preprocessCore”R 包通過CIBERSORT 算法［17］得到91例AML 樣本及335 例健康樣本的22 種免疫細(xì)胞相對組成矩陣。使用“vioplot”R 包繪制小提琴圖觀察22 種免疫細(xì)胞在正常及腫瘤樣本中的表達(dá)差異。使用“corrplot”R 包繪制相關(guān)性熱圖發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞間的相互作用關(guān)系。根據(jù)免疫細(xì)胞的中位表達(dá)值將生存信息完整的81 例AML 樣本分為高表達(dá)組及低 表 達(dá) 組，使 用“survival”R 包 繪 制Kaplan-Meier（K-M）生存曲線發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞表達(dá)及患者生存的關(guān)系。隨后，分析CANX 表達(dá)與生存相關(guān)免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

R4.1.0 軟件用于本文中所有統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Wilcoxon 檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用K-M 法及Log-Rank 檢驗(yàn)評估CANX 及免疫細(xì)胞表達(dá)與患者生存的關(guān)系。采用χ2檢驗(yàn)評估CANX 表達(dá)與臨床性狀間的相關(guān)性。采用Pearson 相關(guān)性分析預(yù)測CANX 表達(dá)與藥物敏感性、免疫細(xì)胞及免疫細(xì)胞間的關(guān)系。Cor＞0 表示二者呈正調(diào)控，Cor＜0 表示二者呈負(fù)調(diào)控。

2 結(jié)果

2.1 CANX 在AML 中 高 表 達(dá)

使用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析了CANX 在多種腫瘤中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CANX 在膽管癌［18］、結(jié)腸腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）及腎透明細(xì)胞癌（KIRC）等13 種腫瘤及正常組織間的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。為了探索CANX 在AML 及健康樣本中的表達(dá)差異，對實(shí)驗(yàn)組（TCGA-LAML）中的CANX表達(dá)矩陣進(jìn)行差異表達(dá)分析。發(fā)現(xiàn)CANX 在AML樣本的表達(dá)水平高于健康樣本（F=0.1057；P=1.993e-13）（圖1B）。此外，使用驗(yàn)證組（GSE37642數(shù)據(jù)集）進(jìn)行差異分析得到同樣的結(jié)論（F=2.0904；P=4.109e-124）（圖1C）。

圖1 CANX 在AML 中高表達(dá)Fig 1 High expression of CANX in AML

2.2 CANX 高表達(dá)與AML 患者預(yù)后良好相關(guān)

分別對實(shí)驗(yàn)組（圖2A）及驗(yàn)證組（圖2B）中的CANX 高表達(dá)及低表達(dá)組進(jìn)行患者生存期比較。繪制K-M 生存曲線發(fā)現(xiàn)，CANX 高表達(dá)組均有更好的生存率（TCGA-LAML：P=0.012；GSE37642：P=0.016），表明CANX 高表達(dá)與患者預(yù)后良好相關(guān)。

圖2 CANX 高表達(dá)與患者預(yù)后良好相關(guān)Fig 2 High expression of CANX was associated with favorable prognosis

2.3 CANX 表達(dá)與臨床性狀相關(guān)性

為了探討CANX 表達(dá)的臨床意義，基于TCGA-LAML 數(shù)據(jù)集分析了CANX 高表達(dá)組及低表達(dá)組間臨床性狀的差異（表1）。結(jié)果顯示，兩組間的年齡（P=0.005）、生存狀態(tài)（P=0.016）、FAB分期（P=0.001）及染色體核型（P=5.77e-05）均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明CANX 表達(dá)與以上臨床性狀相關(guān)。

表1 TCGA-LAML 中132 例AML 患者CANX 表達(dá)及臨床性狀的關(guān)系Tab 1 Association between CANX expression and the clinical characteristics in 132 AML patients in TCGA-LAML

2.4 AML 患者的獨(dú)立預(yù)后分析

進(jìn)一步對TCGA 數(shù)據(jù)集中132 例AML 樣本進(jìn)行獨(dú)立預(yù)后分析，通過單因素（圖3A）及多因素（圖3B）COX 回歸分析繪制森林圖。單因素COX 回歸分 析 顯 示 年 齡（P＜0.001；HR：1.035；95%CI：1.019-1.051）、核 型（P＜0.001；HR：1.962；95%CI：1.410-2.731）、白 細(xì) 胞 表 達(dá) 量（P=0.026；HR：1.005；95%CI：1.001-1.010）及CANX 表達(dá)量（P=0.002；HR：0.601；95%CI：0.439-0.824）與患者預(yù)后相關(guān)。多因素COX 回歸分析顯示年齡（P＜0.001；HR：1.037；95%CI：1.019-1.055）、核 型（P=0.007；HR：1.716；95%CI：1.159- 2.541）及CANX 表 達(dá) 量（P=0.003；HR：0.794；95%CI：0.646-0.157）與患者預(yù)后相關(guān)。推測年齡、染色體核型及CANX 表達(dá)量均為AML 患者獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05）。CANX 表達(dá)量的置信區(qū)間在無效線的左側(cè)，說明CANX 的高表達(dá)是一種保護(hù)因子。這一結(jié)論與K-M 生存分析一致（圖2A、2B）。將AML 患者根據(jù)不同年齡（圖3C）和染色體核型分組（圖3D）進(jìn)行K-M 生存分析發(fā)現(xiàn)，低齡和良好染色體核型患者擁有更好的生存率（P＜0.001）。

圖3 TCGA-LAML 患者的獨(dú)立預(yù)后分析Fig 3 Independent prognostic analysis in TCGA-LAML

2.5 藥物敏感性分析

基于CellMiner 數(shù)據(jù)庫中6 種白血病細(xì)胞株的RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和751 種藥物IC50數(shù)據(jù)，分析CANX表達(dá)與藥物療效的關(guān)系（圖4）。結(jié)果顯示，CANX表達(dá)增加可能使患者對司美替尼（selumetinib，Cor=0.885；P=0.030）等藥物耐藥，但對馱瑞塞爾（temsirolimus，Cor=-0.901；P=0.014）、奧沙利鉑（oxaliplatin，Cor=-0.864；P=0.027）、長春新堿（vincristine，Cor=-0.856；P=0.030）及拉帕替尼（lapatinib，Cor=-0.817；P=0.047）等藥物敏感性增加。

圖4 CANX 表達(dá)與藥物敏感性的關(guān)系Fig 4 Relationship between CANX expression and drug sensitivity

2.6 CANX 與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)

根據(jù)22 種免疫細(xì)胞的相對組成繪制小提琴圖觀察免疫細(xì)胞在腫瘤及健康樣本中的表達(dá)差異（紅色代表腫瘤樣本，藍(lán)色代表健康樣本）（圖5A）。其中，17 種免疫細(xì)胞在腫瘤及健康樣本中的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。繪制22 種免疫細(xì)胞的相關(guān)性熱圖，發(fā)現(xiàn)22 種免疫細(xì)胞間存在不同程度的相關(guān)性。其中，CD8 T 細(xì)胞與未活化的自然殺傷細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（Cor=0.62），與初始CD4 T 細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（Cor=-0.53）（圖5B）。對17 種差異表達(dá)的免疫細(xì)胞進(jìn)行K-M 生存分析，發(fā)現(xiàn)M1 巨噬細(xì)胞（P＜0.001）、濾泡輔助性T 細(xì)胞（P=0.023）及CD8 T 細(xì)胞（P=0.044）表達(dá)增加與AML 患者預(yù)后良好相關(guān)（圖5C-5E）。最后，通過Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CANX 表達(dá)與M1 巨噬細(xì)胞（Cor=0.328；P=0.003）及CD8 T 細(xì) 胞（Cor=0.287；P=0.013）表達(dá)呈正相關(guān)（圖5F～5G）。

圖5 免疫細(xì)胞浸潤分析Fig 5 Analysis of immune cell infiltration

3 討論

AML 是一種原始造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞克隆性增殖的異質(zhì)性疾?。?8］。主要表現(xiàn)為髓系原始細(xì)胞異常增生，抑制正常骨髓造血功能，出現(xiàn)血細(xì)胞減少相關(guān)癥狀及白血病細(xì)胞增殖浸潤的表現(xiàn)。AML的臨床和基因組多樣性使復(fù)發(fā)/難治性AML 治療標(biāo)準(zhǔn)的建立面臨許多困難［19］。分子靶向藥物將是AML 誘導(dǎo)和鞏固治療的標(biāo)準(zhǔn)方法，并作為鞏固治療后的維持治療［20］。分子檢測作為診斷檢查的一部分在AML 診療過程中起重要作用［21］。

本研究中分析了AML 患者CANX 的表達(dá)及其與臨床性狀和預(yù)后的關(guān)系。通過TIMER 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CANX 在多種腫瘤中表達(dá)高于臨近正常組織（圖1A）。使 用R 語 言 對TCGA-LAML 及GSE37642 數(shù) 據(jù) 集 進(jìn) 行 分 析，發(fā) 現(xiàn)CANX 在AML 組中高表達(dá)，且其高表達(dá)與患者預(yù)后良好相關(guān)（圖1B-1C，圖2）?；赥CGA-LAML 數(shù)據(jù)集分析了CANX 表達(dá)與患者臨床性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CANX表達(dá)與患者年齡、生存狀態(tài)、FAB 分期及染色體核型均相關(guān)（表1）。一些研究已使用相同的方法探索基因與患者臨床性狀的相關(guān)性［22］。對AML 患者的獨(dú)立預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，CANX 高表達(dá)、低齡及染色體良好核型是患者預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測因素（圖3）。本研究表明，CANX 可能作為一種抑癌基因與患者預(yù)后良好相關(guān)（圖2-3A-3B）。藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)CANX 表達(dá)使AML 患者對多種藥物增敏或耐藥，未來有可能用于提升患者的藥物療效。在免疫細(xì)胞浸潤分析中，CANX 的表達(dá)與M1 巨噬細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞表達(dá)正相關(guān)。CANX 與M1 巨噬細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞間的關(guān)系仍不十分清楚，值得我們進(jìn)一步探索。這些結(jié)果證明CANX 可能作為AML的潛在生物標(biāo)志物，有助于AML 患者的精確預(yù)后和分層并指導(dǎo)AML 患者的精準(zhǔn)診療。

當(dāng)前，CANX 在白血病中的作用機(jī)制尚不清楚。Azuma 等［23］發(fā) 現(xiàn)，CANX 和CRT 可 以 在 凋 亡等細(xì)胞應(yīng)激及米托蒽醌等化療藥物刺激下易位到細(xì)胞表面，其在細(xì)胞表面表達(dá)增加可作為化療后吞噬細(xì)胞清除死亡細(xì)胞的信號。研究發(fā)現(xiàn)CANX 作為參與主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）抗原提呈的重要組分之一，影響MHC-Ⅰ的組裝和表達(dá)。MHC-Ⅰ在腫瘤細(xì)胞表面低表達(dá)有助于腫瘤細(xì)胞逃避T 細(xì)胞的識別及破壞，參與腫瘤免疫逃逸的發(fā)生［24］。Zheng 等［25］研 究 發(fā) 現(xiàn) 抑 制miR-148a-3p 可 以 恢 復(fù) 結(jié)直腸癌細(xì)胞表面MHC-Ⅰ水平，并通過促進(jìn)CANX表達(dá)顯著增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫攻擊作用。miR-148a-3p 可能通過靶向CANX/MHC-Ⅰ軸促進(jìn)疾病進(jìn)展。表明靶向 miR-148a-3p/CANX/MHC-Ⅰ通路可能作為結(jié)直腸癌患者的一種免疫治療方法。與之相反的是，Jung 等［26］發(fā)現(xiàn)CANX 在口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中表達(dá)上調(diào)與腫瘤組織中T 細(xì)胞浸潤的抑制有關(guān)，并與患者預(yù)后不良有關(guān)。CANX 可以抑制CD4+及CD8+T 細(xì)胞的增殖，并抑制這些細(xì)胞中IFNγ、TNFα 及IL2 的分泌。在黑色素瘤模型中，敲除CANX 增強(qiáng)了T 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤和效應(yīng)功能，并能更好地控制腫瘤的生長。此外，CANX 通過抑制PD-1 啟動子中CpG 島的DNA 甲基化狀態(tài)來增強(qiáng)CD4+及CD8+T 細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)。表明CANX 可能作為抗腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。這為未來CANX 發(fā)展為AML 可能的免疫治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。當(dāng)前，化療仍是AML 患者治療的主要方法，僅不到三分之一的AML 患者可獲得長期緩解。復(fù)發(fā)和耐藥仍是當(dāng)前AML 患者治療失敗和死亡的主要原因［27］。免疫治療有望根除化療耐藥性，使疾病得到長期緩解。當(dāng)前AML 的免疫治療方法主要有抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）、嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor-modified T cells，CAR-T）療法、免疫 檢 查 點(diǎn) 抑 制 劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）及免疫調(diào)節(jié)劑等［28］。當(dāng)前，免疫療法已應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療。然而，目前只有抗CD33 ADC 吉妥珠單抗奧唑米星（gemtuzumab ozogamicin，GO）被批準(zhǔn)用于AML 患者［29］。這促使繼續(xù)深入研究免疫治療，本研究為發(fā)現(xiàn)AML 新的生物標(biāo)志物提供證據(jù)。

在本研究中重點(diǎn)關(guān)注了CANX 的預(yù)后價值，通過整合基因表達(dá)、生存、藥物療效及免疫細(xì)胞浸潤等數(shù)據(jù)探索基因表達(dá)與AML 患者預(yù)后間的關(guān)系，首次發(fā)現(xiàn)并報道了CANX 高表達(dá)預(yù)示AML 患者預(yù)后良好的現(xiàn)象。本研究的主要局限性在于樣本量較小，為了確保研究結(jié)果和假設(shè)的可靠性和代表性，未來應(yīng)擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。也對其潛在的生物學(xué)機(jī)制很感興趣，正在準(zhǔn)備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證CANX 的生物學(xué)功能及其預(yù)后價值。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李博雅：構(gòu)思和設(shè)計(jì)研究；李博雅、李彤：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析及撰寫稿件；祖向陽、王沖：修改稿件。秦玲：構(gòu)思和設(shè)計(jì)研究，并對稿件進(jìn)行指導(dǎo)和審核。所有作者均閱讀并同意稿件發(fā)表。