附子聯(lián)合MPTP誘導肝陽上亢型PD小鼠亞急性模型與慢性模型的建立及比較

榮 華 劉得水 張靜艷 郭科東 渠麗麗 張曉杰 陸佰榮

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在中醫(yī)學中屬于“顫證”范疇，早在黃帝內(nèi)經(jīng)中就有“諸風掉眩，皆屬于肝”記載[1]。PD的病機是肝腎陰虛，水不涵木，肝風內(nèi)動，導致筋脈失其儒養(yǎng)而致病[2]。主要病理變化是中腦黑質(zhì)和紋狀體多巴胺(dopamine，DA)含量降低，TH是DA生物合成中的限速酶，在PD腦組織中，表達明顯下降[3,4]。通常MPTP致PD小鼠模型作用明確，是目前常用的PD動物模型之一。急性和亞急性模型被應用的十分廣泛，但是上述模型損傷在短期內(nèi)恢復較快，而人類PD發(fā)病是一個長期的發(fā)展過程，因此需要一種能產(chǎn)生損傷并且保持時間長的動物模型才能與臨床的病理變化更為接近[5,6]。中醫(yī)臨床診療PD的特點是“辨病與辨證結(jié)合”以往都是采用單純的疾病動物模型而忽視了中醫(yī)藥自身特點，與中醫(yī)臨床實踐銜接不夠密切，因此本研究采用附子煎液灌服聯(lián)合MPTP不同周期誘導，旨在建立病證結(jié)合動物模型，并通過行為學檢測、病理學檢測等手段驗證慢性模型比急性模型更加穩(wěn)定這一優(yōu)勢，證明慢性模型在研究PD的發(fā)病機制方面更具有可靠性。

材料與方法

1.實驗材料：SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，2～3月齡，體質(zhì)量為20～25g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[許可證號：SCXK(遼)2020-0001]。所有實驗研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。附子煎液由單味附子組成[生藥4g/(kg·d)，批號:000001294]購自北京同仁堂飲片有限責任公司。TH抗體購自美國Cell Signaling公司，批號(1)，SP法免疫組化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司(批號：00011404)。

2.動物分組、造模及給藥：小鼠隨機分為正常組、模型組、肝陽上亢PD亞急性組、肝陽上亢PD慢性組。肝陽上亢PD小鼠模型制備：附子煎液灌胃4周后，MPTP腹腔注射，肝陽上亢PD亞急性組給予25mg/(kg·d)共7 天，肝陽上亢PD慢性組給予25mg/(kg·d)，每3.5 天給藥1次，為期5周[7～9]。

3.麻痹震顫評分標準：0分:與正常小鼠相似，無任何癥狀；1分：豎毛、弓背、間斷性細小震顫，但活動自如；2分：吞咽頻繁，頻繁性震顫，后肢張開，顫尾，活動逐漸受限；3分：流涎，持續(xù)性震顫，四肢僵硬，活動受限；4分：因全身麻痹而死亡[10]。

4.易激惹程度的評定3級：Ⅰ級為捉持小鼠頸部時尖叫、驚跳；Ⅱ級為捉持頸部時咬人；Ⅲ級為提尾時尖叫、驚跳甚至咬人或同籠小鼠頻繁打斗；上述情況不明顯為0級[11]。

5.爬桿實驗：給藥前3 天，每天進行1次爬桿訓練。給藥結(jié)束后第3 天，每天進行1次爬桿實驗，持續(xù)到第7 天。制作直徑為1cm，長50cm頂部固定直徑為5cm的小球爬桿，用紗布纏繞防止動物攀爬發(fā)生打滑現(xiàn)象。測試時將小鼠放置球上，記錄小鼠完全頭向下爬到桿底部的時間。小鼠每天進行3次實驗。評分標準：0分為爬桿時間<4.01s；1分為4.01～8.00s；2分為8.01 ～12.00s；3分為>12.00s[12]。

6.轉(zhuǎn)棒實驗：給藥前3 天，每天進行1次轉(zhuǎn)棒訓練。轉(zhuǎn)速30r/min，訓練時長3min，連續(xù)訓練3 天。給藥結(jié)束后，轉(zhuǎn)棒實驗以4r/min起始，加速度為0.12r/min，最大速度為40r/min，記錄小鼠在5min內(nèi)在轉(zhuǎn)棒上停留時間，即轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期[13]。

7.免疫組化法檢測TH陽性神經(jīng)元平均光密度：4%多聚甲醛固定腦組織，4℃保存72h后，脫水浸蠟后進行石蠟包埋。中腦黑質(zhì)區(qū)冠狀切片，65℃烘片6h，進行脫蠟、水化處理后，開始TH免疫組織化學染色。

8.免疫印跡法檢測TH蛋白表達：冰上快速取出中腦黑質(zhì)區(qū)域[14]。BCA 法進行蛋白定量，SDS 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入 TH 抗體(1∶1000) 4℃ 過夜；二抗(1∶6000) 孵育2h，ECL 化學發(fā)光反應，ImageJ 圖像分析軟件對免疫印跡條帶進行密度掃描，以TH/GAPDH比較各組蛋白相對表達水平。

9.實時定量PCR法檢測TH mRNA表達：取60mg腦組織，加入600μl Trizol溶液，腦組織在冰上進行勻漿處理提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒進行擴增PCR。擴增實驗結(jié)束之后，使用2-ΔΔCt法進行結(jié)果分析。

結(jié) 果

1.各組小鼠一般狀態(tài)變化：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組和肝陽上亢PD慢性組小鼠均在給予MPTP 5～30min內(nèi)出現(xiàn)豎毛、弓背、肢體僵直、活動受限、身體震顫等現(xiàn)象。模型組及肝陽上亢PD亞急性組在給藥后2～6h后逐漸恢復正常狀態(tài)，肝陽上亢PD慢性組恢復時間明顯長于其余3組。

2.各組小鼠麻痹震顫水平的變化：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組和肝陽上亢PD慢性組小鼠均出現(xiàn)麻痹震顫的癥狀(P均<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組麻痹震顫評分升高(P<0.05)，且肝陽上亢PD慢性組麻痹震顫最為明顯(P<0.05,表1)。

表1 各組小鼠麻痹震顫評分

3.各組小鼠易激惹程度的變化：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組和肝陽上亢PD慢性組小鼠均出現(xiàn)性情變化，易激惹度提高(P<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組易激惹程度明顯提高(P<0.05)，且肝陽上亢PD慢性組的易激惹程度最為明顯(P<0.05,表2)。

表2 各組小鼠易激惹程度的變化(n=10)

4.爬桿實驗：與正常組比較，模型組小鼠爬桿時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),肝陽上亢PD亞急性組小鼠爬桿時間較正常組有所延長(P<0.05)，肝陽上亢PD慢性組小鼠所用時間明顯長于其他3組小鼠(P<0.05,表3)。

表3 各組小鼠爬桿時間與得分對比

5.轉(zhuǎn)棒實驗：與正常組比較，模型組小鼠、肝陽上亢PD亞急性組小鼠、肝陽上亢PD慢性組小鼠的在棒停留時間均有所縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而肝陽上亢PD慢性組小鼠在棒時間明顯短于其他3組小鼠(P<0.05,表4)。

表4 各組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時間對比

6.各組小鼠免疫組化結(jié)果：與正常組比較，模型組、肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組小鼠黑質(zhì)TH平均光密度均有所降低(P<0.05)；但肝陽上亢PD慢性組降低的最為顯著(P<0.05,圖1,表5)。

表5 各組小鼠黑質(zhì)TH平均光密度比較

圖1 各組小鼠TH表達水平(免疫組化法，×200)A.正常組;B.模型組;C.肝陽上亢PD亞急性組;D.肝陽上亢PD慢性組

7.各組小鼠黑質(zhì)TH蛋白表達比較：與正常組比較，模型組小鼠與肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組TH蛋白表達量均有所下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組的蛋白含量降低明顯，肝陽上亢PD慢性組表達量下調(diào)最為明顯(P<0.05,圖2)。

圖2 各組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)域TH蛋白表達差異A.TH免疫印跡圖;B.TH統(tǒng)計直方圖。與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05;與肝陽上亢PD亞急性組比較，ΔP<0.05

8.各組小鼠黑質(zhì)TH mRNA表達的比較：與正常組比較，模型組小鼠與肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組TH mRNA表達量均有所下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組mRNA含量降低明顯，其中肝陽上亢PD慢性組表達量下調(diào)最為顯著(P<0.05,圖3)。

圖3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)域TH mRNA的表達與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與肝陽上亢PD亞急性組比較，ΔP<0.05

討 論

PD是常見的神經(jīng)退行性疾病，詹姆斯·帕金森于1817年首次對PD進行描述[15]。它是以DA神經(jīng)元選擇性丟失為主要特征的椎體外系疾病，多發(fā)生于老年群體。據(jù)統(tǒng)計，在60歲以上人群中發(fā)生率達到1%，即全世界有超過700萬人患病，這導致一系列家庭、醫(yī)療和社會問題[16]。因此，成功建立PD動物模型是尤為重要的。既往采用MPTP誘導小鼠PD模型得到認可，但該種模型與中醫(yī)藥自身特點不符[17]。附子為大熱之品，久用必耗傷精血，奪肝腎之陰而致肝腎陰虛，陰不潛陽而肝陽偏亢。肝陽上亢證是PD中的常見證型，臨床中應用平肝潛陽藥物治療PD肝陽上亢證取得了較好的療效，采用灼傷肝腎之陰而發(fā)生肝陽上亢灌服附子煎液聯(lián)合 6-OHDA單側(cè)損毀的方法，從病和證兩方面綜合模擬肝陽上亢證PD模型，與單純PD模型和單純肝陽上亢證候模型比較，在研究治療PD藥效評價方面更具特色和優(yōu)勢[18,19]。將辨病論與辨證論有機結(jié)合起來，病證結(jié)合的動物模型使很多“證”的不確定性因素由于“病”的限制變得清晰。

作為PD病理變化的主要特征黑質(zhì)致密部多DA能神經(jīng)元的丟失程度可導致疾病表現(xiàn)的差異。MPTP經(jīng)腹腔注射后可迅速進入血-腦脊液屏障，生成MPP+與DA親和，破壞黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元，產(chǎn)生PD樣病理變化，因此被常用于建立PD模型的誘導藥物[20]。

附子煎液灌胃可以使小鼠出現(xiàn)煩躁，易激惹的表現(xiàn)，從而制備肝陽上亢證候模型[21]。PD具有周期長且呈進行性發(fā)展的趨勢，因此需要能使損傷程度持久的模型這無疑是更接近于臨床的病理特點，研究表明，MPTP誘導的小鼠模型應用較多的是急性或亞急性的模式，這種模型發(fā)生的損傷會在較短時間內(nèi)得到恢復[22]。立足于此，本研究采用不同周期MPTP誘導聯(lián)合附子進行周期灌胃，成功建立肝陽上亢PD亞急性模型及肝陽上亢PD慢性模型。

通過研究發(fā)現(xiàn)，模型組、肝陽上亢PD亞急性組及肝陽上亢PD慢性組小鼠在給藥后均會出現(xiàn)豎毛、弓背、四肢僵硬、運動速度減慢，出現(xiàn)活動受限的現(xiàn)象。但肝陽上亢PD慢性組恢復時間與其他組比較，恢復時間較長，其余組在給藥后2～6h內(nèi)可逐漸恢復正常。對小鼠易激惹程度的觀察，發(fā)現(xiàn)肝陽上亢PD小鼠易激惹程度更高，肝陽上亢PD慢性組小鼠表現(xiàn)的更為暴躁，出現(xiàn)捉頸時尖叫咬人，同籠打斗現(xiàn)象明顯多于其他各組。通過爬桿、轉(zhuǎn)棒實驗檢測小鼠行為學變化得知，與正常組比較，給藥各組小鼠均出現(xiàn)了運動能力及平衡能力的損傷，而附子與MPTP聯(lián)合用藥肝陽上亢PD慢性組較單純MPTP模型組及肝陽上亢PD亞急性組小鼠出現(xiàn)損傷程度更大，運動功能受損嚴重。行為學檢測結(jié)束后，對各組小鼠中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元標志物TH進行定位和定量的研究得知，給藥各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的TH表達量下降。與單純西藥模型組比較，肝陽上亢PD慢性組蛋白及mRNA表達含量降低的最為顯著，由此認為肝陽上亢PD慢性組小鼠腦內(nèi)多DA能神經(jīng)元損傷程度較其余組要高。

綜上所述，通過增加MPTP給藥周期并聯(lián)合附子構(gòu)建小鼠肝陽上亢型PD慢性模型，從行為學、TH神經(jīng)元標志物等方面分析比較可以初步驗證，慢性模型是最穩(wěn)定貼近于PD臨床病理特征的建模方式，同時體現(xiàn)了中醫(yī)學“辨病與辨證相結(jié)合”特點，將病證結(jié)合動物模型建立并研究運用，將會使中藥防治PD基礎研究更具有應用前景。