童紅梅，宋巧*，張敏，郭敏，何丹

甘肅醫(yī)學(xué)院（平?jīng)?744000）

甜葉菊（Steviarebaudiana）原產(chǎn)南美洲的菊科（Asteraceae）甜菊屬（Stevia）多年生草本植物，因其葉片含有高甜度低熱量的甜菊糖苷（steviolglycosides）而聞名[1]，甜菊糖苷是甜葉菊體內(nèi)的一種次生代謝產(chǎn)物，其甜度高達(dá)蔗糖的250～450倍，熱量卻低至蔗糖的1/300，作為天然低熱量甜味劑被譽(yù)為“世界第三糖源”[2]，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。并具有預(yù)防和治療肥胖癥、糖尿病、高血壓、抗氧化、抗菌抗癌和增強(qiáng)免疫力等藥用價(jià)值[3-5]。

β-葡萄糖苷酶又稱(chēng)β-D-葡萄糖苷水解酶，可有效調(diào)節(jié)甜菊糖苷的合成與分解、糖基化與去糖基化的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)甜菊糖苷的水解[6-7]，這在甜菊糖苷提取研究中尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，試驗(yàn)通過(guò)添加β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷，對(duì)β-葡萄糖苷酶的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期明確β-葡萄糖苷酶對(duì)甜菊糖苷產(chǎn)量、品質(zhì)指標(biāo)影響的內(nèi)在作用機(jī)制，為甜菊糖苷成品高品質(zhì)奠定理論與試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以甘肅省平?jīng)霎a(chǎn)甜葉菊品種“普6”為試驗(yàn)材料，于2021年9月甜菊旺盛生長(zhǎng)期采集植株中上部的新鮮莖稈、葉片，稱(chēng)重10.000 g分裝，液氮速凍后于冰箱-80 ℃保存，由平?jīng)鍪修r(nóng)科院專(zhuān)家鑒別，冷藏于0 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器

島津LC-16型液相色譜儀，色譜檢測(cè)工作站、二元陣列高壓電子梯度色譜泵、二極管陣列色譜檢測(cè)[島津儀器（蘇州）有限公司]；鼓風(fēng)干燥箱（山東博科科學(xué)儀器公司）；SY-500型數(shù)控超聲波清洗儀（250 W、40 kHz，合肥恒泰超聲波設(shè)備有限公司）；FA2004型分析天平（濟(jì)南鑫宇鑫醫(yī)療設(shè)備有限公司）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（河南省艾瑞德儀器設(shè)備有限公司）；JY-33型手持糖度計(jì)（西安測(cè)維光電）。

1.3 試驗(yàn)試劑

75%乙醇（分析純，無(wú)錫源之泉化工產(chǎn)品有限公司）；乙腈（色譜純，山東瑞港化工有限公司）；甲醇（色譜純，東莞市南箭精細(xì)化工有限公司）；磷酸（分析純，山東振華工業(yè)股份有限公司）；萊鮑迪苷A（生產(chǎn)批號(hào)21041011，規(guī)格1 g/支，純度≥98%）；斯替夫苷（生產(chǎn)批號(hào)21034008，規(guī)格1 g/支，純度≥98%）；甜菊苷（生產(chǎn)批號(hào)21082603，500 mg/支，純度≥98%）；超純水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定與計(jì)算

試管中取600 μL酶液、200 μL pH 7.0的磷酸緩沖液和200 μL 10 mmol/L的對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside，pNPG），混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。反應(yīng)液以5 000 r/min離心1 min后，取上清液于410 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色，以加熱失活的酶液同樣處理為空白對(duì)照[8]。

1.4.2β-葡萄糖苷酶酶活力

β-葡萄糖苷酶活力國(guó)際單位定義為以pNPG為底物，每分鐘釋放出1 μmol對(duì)硝基苯酚（pNP）所需要的酶量。β-葡萄糖苷酶能水解pNPG中的糖苷鍵生成pNP，pNP在堿性溶液中呈現(xiàn)黃色，在410 nm波長(zhǎng)下有最高吸收峰，故用分光光度法測(cè)定波長(zhǎng)410 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算β-葡萄糖苷酶的活力[9]。

1.4.2.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)量pNP 139.0 mg，用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。分別吸取該溶液1，2，3，4，5和6 mL至100 mL容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容并將其混勻，使pNP濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 μmol/L。以蒸餾水為空白對(duì)照，在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度為縱坐標(biāo)，pNP的濃度為橫坐標(biāo)，繪制pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.4.2.2 酶活性計(jì)算

酶活性=Y×V2×V/K×V1×M×T（1）式中：酶活性單位為U/g；Y為酶促反應(yīng)的吸光度；V2為總反應(yīng)液量，mL；V為酶液的提取總量，mL；K為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率；V1為反應(yīng)體系中酶液量，mL；M為試樣質(zhì)量，g；T為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.4.3β-葡萄糖苷酶作用條件研究

1.4.3.1β-葡萄糖苷酶最適酶濃度確定

天平精確稱(chēng)取10 g干燥的甜菊莖稈、葉片，研成粉末，以1∶50（g/mL）比例加入75%乙醇，44.7 Hz、60 ℃超聲提取60 min，加入500，600，700，800和900 U的β-葡萄糖苷酶；重復(fù)3次，將樣本置于40 ℃水浴鍋中，反應(yīng)2 h后，按10 000 r/min 30 s離心取上清液并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。測(cè)定可溶性固形物、萊孢迪苷、斯替夫苷 的含量。

1.4.3.2β-葡萄糖苷酶最適溫度確定

天平精確稱(chēng)取10 g干燥的甜菊莖稈、葉片，研成粉末，以1∶50（g/mL）比例加入75%乙醇，44.7 Hz、60 ℃超聲提取，加入500 Uβ-葡萄糖苷酶；重復(fù)3次，將樣本置于30，40，50，60 和70 ℃水浴鍋中，2 h后按10 000 r/min，30 s離心取上清液并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。測(cè)定可溶性固形物、萊孢迪苷、斯替夫苷 的含量。

1.4.3.3β-葡萄糖苷酶最適pH確定

天平精確稱(chēng)取10 g干燥的甜菊莖稈、葉片，研成粉末，以1∶50（g/mL）比例加入75%乙醇，按44.7 Hz、60 ℃超聲提取60 min，加入500 Uβ-葡萄糖苷酶；重復(fù)3次；滴加pH 5.0，6.8，7.0，8.0和9.0的磷酸鹽溶液20滴，將樣本置于40 ℃水浴鍋中，反應(yīng)2 h后，按10 000 r/min，30 s離心取上清液并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。測(cè)定可溶性固形物、萊孢迪苷、斯替夫苷的含量。

1.4.4 HPLC法測(cè)定甜菊糖苷含量

1.4.4.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～20 min，10%～90%，20～30 min，90%～100%），流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.4.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

甜菊苷含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干基計(jì)）≥99.0%。萊鮑迪苷A與斯替夫苷（St）標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干基計(jì)≥99.0%。將甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，精密稱(chēng)取5 mg，溶液溶解并定容至10 mL，搖勻置于棕色瓶中。即配成質(zhì)量濃度0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。吸取10 μL標(biāo)液進(jìn)樣，并記錄。

1.4.4.3 甜菊糖苷供試樣品溶液的制備

按照1.4.3方法制備樣品。

1.4.4.4 結(jié)果計(jì)算取上述供試樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積，計(jì)算甜菊苷、萊孢迪苷、斯替夫苷 的含量。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0和Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

按照1.4.2.1的方法繪制對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果如圖1所示。橫軸X為對(duì)硝基苯酚的濃度（μmol/L），縱軸Y為吸光度，得到對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程。后續(xù)試驗(yàn)將根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)吸光度計(jì)算酶活力。

圖1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用條件研究

2.2.1β-葡萄糖苷酶最適酶濃度確定

取甜菊糖苷莖稈、葉片超聲提取液10 mL，添加β-葡萄糖苷酶量500，600，700，800和900 U/g，反應(yīng)溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為2 h，測(cè)定可溶性固形物含量，結(jié)果如表1所示。隨著β-葡萄糖苷酶量的增加，莖稈與葉片中可溶性固形物含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，β-葡萄糖苷酶量700 U/g時(shí)莖稈中可溶性固形物含量最高，β-葡萄糖苷酶量600 U/g時(shí)葉片中可溶性固形物含量最高，隨著酶濃度繼續(xù)增加，莖稈中可溶性固形物含量增幅變慢；考慮到成本建議β-葡萄糖苷酶最適酶濃度確定為600 U/g適宜。

表1 不同酶濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影響（±S）

表1 不同酶濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影響（±S）

β-葡糖糖苷酶酶濃度/(U·g-1)葉片可溶性固形/%500 8.01 8.89 600 12.33 12.87 700 12.77 11.37 800 12.10 11.51 900 12.33 11.62莖稈可溶性固形物/%

2.2.2β-葡萄糖苷酶最適溫度確定

取10 mL甜菊糖苷莖稈、葉片超聲提取液，添加β-葡萄糖苷酶量600 U/g，反應(yīng)溫度分別為30，40，50，60和70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h，測(cè)定可溶性固形物的含量，結(jié)果如表2所示。40 ℃時(shí)莖稈、葉片中的可溶性固形物含量最高，說(shuō)明β-葡萄糖苷酶40 ℃時(shí)酶活性最高，水解甜葉菊莖稈、葉片中甜菊糖苷物質(zhì)效果最好，隨著溫度升高酶活性受到抑制，水解作用變?nèi)?。由此可?jiàn)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的最適溫度為40 ℃。

表2 不同溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影響（±S）

表2 不同溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影響（±S）

反應(yīng)溫度/℃ 莖稈可溶性固形物/% 葉片可溶性固形/%30 10.01 10.89 40 12.27 13.57 50 8.53 9.41 60 8.31 7.41 70 7.24 7.22

2.2.3β-葡萄糖苷酶最適pH確定

取甜菊糖苷莖稈、葉片超聲水提取液10 mL，添加β-葡萄糖苷酶量600 U/g，反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h，pH分別為5.0，6.8，7.0，8.0和9.0，進(jìn)行水解反應(yīng)，測(cè)定可溶性固形物含量，結(jié)果如表3所示。pH 7.0時(shí)，該酶活性最強(qiáng)，莖稈葉片中可溶性固形物含量最高，偏酸偏堿都不利于甜菊糖苷水解。

表3 不同pH對(duì)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影響（±S）

表3 不同pH對(duì)β-葡萄糖苷酶水解甜菊糖苷作用的影響（±S）

pH 莖稈可溶性固形物/% 葉片可溶性固形物/%5.0 6.80 7.42 6.8 9.75 10.44 7.0 9.87 10.89 8.0 5.54 5.21 9.0 5.11 5.14

2.2.4 HPLC法測(cè)定甜菊糖苷含量

取10 mL甜菊糖苷莖稈、葉片超聲提取液，在β-葡萄糖苷酶添加量600 U/g、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、pH 7.0條件下制備反應(yīng)液，未添加β-葡萄糖苷酶的做對(duì)照（CK），HPLC條件為C18反相色譜柱（250.0 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為乙腈-磷酸鈉緩沖液（30∶70，體積比），梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，測(cè)定波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算峰面積。結(jié)果如表4所示。

表4 HPLC法測(cè)定β-葡萄糖苷酶量水解甜菊糖苷含量單位：mg/g

甜葉菊“普六”品種的莖稈中甜菊糖苷含量為0.167 mg/g，萊鮑迪苷A含量為0.125 mg/g，斯替夫苷含量為0.022 mg/g；葉片中的甜菊糖苷含量為0.184 mg/g，萊鮑迪苷A含量為0.153 mg/g，斯替夫苷 含量為0.035 mg/g，葉片甜菊糖苷含量高于莖稈；與對(duì)照相比，甜葉菊莖稈中甜菊糖苷含量提高28.7%，萊孢迪苷A含量提高23.7%，斯替夫苷 含量提高15.8%；葉片中甜菊糖苷含量提高19.9%，萊孢迪苷A含量提高25.7%，斯替夫苷含量提高21.9%；由此可見(jiàn)，β-葡萄糖苷酶可有效水解甜葉菊莖稈與葉片中的糖苷類(lèi)物質(zhì)，可以提高甜菊糖苷得率。

3 結(jié)論

β-葡萄糖苷酶在自然界中廣泛存在，其生物學(xué)功能多種多樣[10]，可以是植物醇系香氣產(chǎn)生的一種關(guān)鍵酶，在橡膠[12]、葡萄[13]、茶樹(shù)等植物中已有大量研究報(bào)道，同時(shí)該酶在人參皂苷、大豆異黃酮苷等萜類(lèi)糖苷降解中的關(guān)鍵作用也有研究[14-15]。甜菊糖苷是以甜菊醇為苷元的四環(huán)二萜類(lèi)糖苷，β-葡萄糖苷酶理應(yīng)對(duì)甜菊糖苷的分解轉(zhuǎn)化起作用[16]。

以甜葉菊莖稈和葉片為試驗(yàn)材料，結(jié)果表明pH 7.0、β-葡萄糖苷酶添加量600 U/g、40 ℃條件下水解、超聲（60 ℃、44.7 Hz、2 h）乙醇提取的甜菊糖苷、甜葉菊莖稈中甜菊糖苷含量為0.167 mg/g，萊鮑迪苷A含量為0.125 mg/g，斯替夫苷 含量為0.022 mg/g；葉片中甜菊糖苷含量為0.184 mg/g，萊鮑迪苷A含量為0.153 mg/g，斯替夫苷含量為0.035 mg/g，葉片甜菊糖苷含量高于莖稈。與未經(jīng)β-葡萄糖苷酶處理對(duì)照相比，甜葉菊莖稈中甜菊糖苷含量提高28.7%，萊孢迪苷A含量提高23.7%，斯替夫苷含量提高15.8%。葉片中甜菊糖苷含量提高19.9%，萊孢迪苷A含量提高25.9%，斯替夫苷含量提高21.9%。由此可見(jiàn)，β-葡萄糖苷酶可有效水解甜葉菊莖稈與葉片中的糖苷類(lèi)物質(zhì)，提高甜菊糖苷得率，莖稈中的甜菊糖苷也得以被利用。