芽孢桿菌生物合成納米硒條件優(yōu)化及活性評價

朱燕云，王　欣，陳丹艷，馬敬澤，朱　寧，靳紅梅,

芽孢桿菌生物合成納米硒條件優(yōu)化及活性評價

朱燕云1,2,3，王欣4，陳丹艷5，馬敬澤5，朱寧1,2，靳紅梅1,2,4※

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所，南京 210014；2. 江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；4. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，南京 210095；5. 金陵科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，南京 210038）

作為生防菌的枯草芽孢桿菌XP（subspeciesstrainXP）不僅具有較強(qiáng)的耐硒與耐鹽能力，而且還可將毒性較高的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為安全性高、生物活性好的納米硒 (SeNP)，然而目前其合成SeNP的效率并不高。為提升菌株XP生物合成SeNP的效率，該研究針對其合成工藝條件做了進(jìn)一步優(yōu)化。首先，通過單因素試驗(yàn)，初步篩選出適宜范圍量值的初始亞硒酸鹽Se (IV)濃度、搖床轉(zhuǎn)速、XP接種量；其次，將這三個因子作為影響因素，以SeNP產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，利用Box-Behnken響應(yīng)面法 (RSM) 進(jìn)行分析；最終，通過響應(yīng)面法獲得枯草芽孢桿菌XP產(chǎn)SeNP的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌XP合成納米硒的最佳發(fā)酵條件為：初始Se (IV) 3.4 mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速157 r/min、菌株XP接種量9.9%，此發(fā)酵條件下納米硒的產(chǎn)量達(dá)到1.82 mmol/L，相對優(yōu)化前提升了60%以上。此外，通過種子發(fā)芽試驗(yàn)，進(jìn)一步證明此工藝條件下合成的納米硒具有較高的生物活性，可有效提升油麥菜種子活力，促進(jìn)種子萌發(fā)。

菌；發(fā)酵；響應(yīng)面法；枯草芽孢桿菌；納米硒；生物活性

0 引 言

硒（Selenium, Se）是一種天然微量元素，在維持人體健康和動物機(jī)體正常代謝方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。目前，硒已被廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域，包括農(nóng)業(yè)、化工以及臨床醫(yī)學(xué)等[3-6]。硒雖然是動物和人類必需的微量營養(yǎng)元素，但其過量攝入則會導(dǎo)致機(jī)體中毒。研究表明，人體硒的安全攝入范圍在40～400 μg/d，過多或過少攝入硒均會導(dǎo)致人體產(chǎn)生嚴(yán)重的健康問題[7]。硒具有四種典型價態(tài)，即：硒酸鹽[Se(VI)]、亞硒酸鹽[Se(IV)]、硒化物[Se(?II)] 和單質(zhì)硒[Se(0)][4]，不同價態(tài)之間可以進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。一些植物可以通過自身代謝過程，將環(huán)境中的無機(jī)硒或單質(zhì)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒儲存在植物組織中，人類則可通過食用這些含硒植物間接攝取機(jī)體代謝所需的硒。自然界中的硒普遍以無機(jī)態(tài)存在于水體或土壤中，有機(jī)態(tài)硒多存在于生物體當(dāng)中。然而，無機(jī)硒易流動，潛在環(huán)境風(fēng)險高，而有機(jī)硒因其有效范圍狹窄易造成生物毒害，單質(zhì)硒毒性相對較低，但是生物利用度低[8]。

近年人們通過研究發(fā)現(xiàn)一種新型單質(zhì)態(tài)硒—納米硒（Selenium Nanoparticle, SeNP），并已證明納米硒相對于無機(jī)硒、有機(jī)硒和一般的單質(zhì)硒來說具有生物活性高、毒性小、粒子分散度高、表面積大等一系列更優(yōu)異的特性[9-12]，被視作一種具有廣泛應(yīng)用前景的材料。目前已有的納米硒合成手段主要包括：化學(xué)法、物理法以及生物法，相對于前兩者而言，生物法不僅能耗低、環(huán)境友好且所得納米硒的活性更高，更易被機(jī)體吸收利用[13]。因此，利用生物法合成納米硒更受人們青睞。國內(nèi)外已有研究表明，自然界中的許多微生物能夠通過自身代謝過程，將毒性較高的無機(jī)硒（硒酸鹽或亞硒酸鹽）轉(zhuǎn)化為毒性較低的納米硒[14-16]。這些產(chǎn)納米硒的微生物中以細(xì)菌居多，如：克雷伯氏菌屬（sp.）[17]、草螺菌屬（sp.）[18]、鏈酶菌屬（sp.）[19]、假單胞菌屬（sp.）等[20]。不同種類細(xì)菌之間，生物合成納米硒的能力存在較大差異，這主要是因?yàn)榉N類不同的細(xì)菌對底物硒酸鹽/亞硒酸鹽的耐受能力不同，且參與納米硒合成的代謝途徑不同[21]。此外，相同菌株在不同的生長環(huán)境下，其代謝硒酸鹽/亞硒酸鹽的能力也有所不同，對底物的利用度以及轉(zhuǎn)化能力也會表現(xiàn)出較大差異[22]。因此，篩選耐受硒脅迫能力強(qiáng)的菌株，并確定其培養(yǎng)的最佳條件參數(shù)，從而有效提升納米硒的合成效率，這對推動納米硒的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用十分關(guān)鍵。

枯草芽孢桿菌作為一種生防菌，在食品加工和保鮮、生物發(fā)酵以及綠色有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。此外，枯草芽孢桿菌也是微生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢種群，不僅具有植物促生等優(yōu)勢，其繁殖力和理化性質(zhì)穩(wěn)定性也優(yōu)于大部分生防菌株。本團(tuán)隊(duì)通過前期研究已篩選到一株耐高鹽且耐受硒能力較強(qiáng)的菌株—枯草芽孢桿菌菌株XP（subspeciesstrain XP），并明確了其合成納米硒的基本規(guī)律[23]。為了滿足納米硒后續(xù)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的需求，菌株XP合成納米硒的工藝條件參數(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化。本研究主要通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對菌株XP合成納米硒的主要條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。不僅有效提升了生物納米硒產(chǎn)量，而且進(jìn)一步對其生物活性進(jìn)行了評價，這將為后續(xù)耐硒枯草芽孢桿菌菌株功能的開發(fā)以及生物納米硒在富硒作物生產(chǎn)與環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用提供有力支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株與供試植物種子

將枯草芽孢桿菌XP（subspeciesstrainXP）作為本研究的供試菌株，此前由本實(shí)驗(yàn)室工作人員分離于廢棄生物質(zhì)的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中，菌株XP在此用于納米硒的生物合成。供試蔬菜種子為油麥菜（品牌為四季香，購自綠寶種業(yè)）。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

1.2.1 試劑

Na2SeO3（98%, Sigma-Aldrich) 固體粉末用于配制亞硒酸鹽母液（1 mol/L）；Na2S（≥98%，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）用于配制硫化鈉溶液（1 mol/L）；NaCl （≥99.5%，西隴科學(xué)股份有限公司）用于配制生理鹽水（0.85%，/）及培養(yǎng)基的制備；酵母提取物和胰蛋白胨均為賽默飛世爾科技公司OXIOD品牌，用于配制培養(yǎng)基；丙三醇、NaOH、鹽酸及其他常規(guī)試劑均為國藥集團(tuán)試劑，分析純；試驗(yàn)所用水均為去離子水。

1.2.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani (LB) 液體培養(yǎng)基成分：NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.3，121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，晾至室溫后用于菌株的活化。含硒LB液體培養(yǎng)基：將滅菌的LB液體培養(yǎng)基置于超凈工作臺上，用移液槍吸取上述無菌亞硒酸鈉母液（Se(Ⅳ)=1 mol/L），加至LB液體培養(yǎng)基中，使Se(IV)初始濃度達(dá)4 mmol/L，作為菌株XP合成納米硒的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器

桌面式冷凍離心機(jī)（5424R，Eppendorf，德國）、生化培養(yǎng)箱（DNP-9162，精宏，中國）、恒溫?fù)u床（HZQ-F160，華美，中國）、水浴鍋（HH-3A，國華，中國）、超低溫冰箱（DW-HL528，美菱，中國）、酶標(biāo)儀（EPOCH 12，Bio Tek，美國）、旋渦振蕩器（VORTEX-5，其林貝爾，中國）、真空冷凍干燥儀（Alpha 2-4 LSCbasic，CHRIST，德國）、烘箱（DHG-9076Y，精宏，中國）、pH計（FE28，Mettler Toledo，瑞士）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

將–20 ℃低溫保存的芽孢桿菌XP甘油管于4 ℃條件下解凍，之后置于超凈臺上備用。按照1%（體積分?jǐn)?shù)）的接種比將解凍后的菌株XP菌液接至5 mL的 LB培養(yǎng)基中，180 r/min、35 ℃恒溫培養(yǎng)過夜；次日，再將菌液轉(zhuǎn)接至50 mL的LB培養(yǎng)基中，相同轉(zhuǎn)速與溫度條件恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600≈0.8），此時的菌液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 納米硒生物合成及其含量測定

納米硒生物合成：基于1.2.2的方法配制LB培養(yǎng)基，將其事先分裝至250 mL三角錐形瓶中（100 mL/瓶），滅菌后添加亞硒酸鈉，獲得無菌含硒（Se(Ⅳ)= 4 mmol/L）LB培養(yǎng)基；于超凈工作臺上，用移液槍吸取活化好的枯草芽孢桿菌XP菌液，按照1%（體積分?jǐn)?shù)) 的接種量加至上述含硒LB培養(yǎng)基中，不加硒的為對照組；每個處理設(shè)置3個重復(fù)。將所有樣品放置于恒溫?fù)u床上，180 r/min、35 ℃恒溫連續(xù)培養(yǎng)48 h[23]，之后分析發(fā)酵液中的納米硒含量。

發(fā)酵液中納米硒含量測定采用改進(jìn)的Biswas[24]。具體步驟如下：1）從每個錐形瓶中各取發(fā)酵液6 mL分裝至3個2 mL離心管中，即每個生物學(xué)樣品對應(yīng)3個技術(shù)重復(fù)；2）將上述裝有樣品的離心管置于離心機(jī)中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，用移液槍輕輕吸出上清，得到沉淀；3）向上述沉淀中加入1 mol/L的Na2S溶液各1 mL，蓋上管蓋，輕輕振蕩以使沉淀充分溶解，室溫靜置，期間手動振蕩一次；4）靜置1 h后離心收集上清，加入到96孔板中，200 μL/孔，置于酶標(biāo)儀上測定500 nm 處的吸光值。同時，按照文獻(xiàn)[24]所述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。最后，將樣品測定的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算出原供試發(fā)酵液中納米硒的含量。

1.4.3 合成納米硒的單因素試驗(yàn)

本團(tuán)隊(duì)通過前期研究[23]已明確耐鹽枯草芽孢桿菌菌株XP生長的最佳pH值以及培養(yǎng)溫度依次為pH值7.2和35 ℃。此外，底物初始Se (IV) 濃度、搖床轉(zhuǎn)速、菌株XP接種量也是影響納米硒產(chǎn)量的三大主要因素，至今這3個因素各自的最優(yōu)區(qū)間尚不清楚。為此分別設(shè)置底物Se (IV) 不同初始濃度水平 (1、2、4、6、8 mmol/L)、不同搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180、200 r/min）、XP不同接種量（0.5%、1%、2.5%、5%、10%，/）進(jìn)行培養(yǎng)，以48 h時發(fā)酵液中的納米硒含量為標(biāo)準(zhǔn)，分別評價這3個因素（初始Se (IV) 濃度、搖床轉(zhuǎn)速、菌株XP接種量）對菌株XP生物合成納米硒的影響?？疾靻我灰蛩貢r，其余因素的量值固定為：搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、菌株XP接種量1%、底物Se(IV) 濃度4 mmol/L。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定每個因素的最優(yōu)區(qū)間，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，進(jìn)一步運(yùn)用Design-Expert 12 軟件設(shè)計多因素正交組合試驗(yàn)。選擇以上三個因子（初始Se (IV)濃度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量）作為變量，試驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示，A、B、C分別表示初始Se(IV)濃度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量3個變量。以SeNP產(chǎn)量為響應(yīng)值，獲得多元二次回歸模型，求解產(chǎn)SeNP發(fā)酵條件參數(shù)的最優(yōu)組合。采用三因素三水平的響應(yīng)面法對培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化，從而獲得菌株XP生物合成SeNP的最佳發(fā)酵工藝條件。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.4.5 模型驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面模型優(yōu)化得到菌株XP合成SeNP的最佳發(fā)酵工藝條件，按照初始Se (IV) 濃度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量的最優(yōu)值再次進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)合成納米硒，設(shè)置4組重復(fù)。發(fā)酵溫度35 ℃，48 h后測定發(fā)酵液中的納米硒含量，將其與模型預(yù)測值對比，從而驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測模型是否合理。

1.4.6 納米硒活性分析

通過種子萌發(fā)試驗(yàn)對優(yōu)化工藝條件下合成的納米硒生物活性進(jìn)行評價[25]。挑選籽粒飽滿大小均一的油麥菜種子，用3%的雙氧水消毒后再用去離子水沖洗4次，濾紙吸干種子表面水分后備用。設(shè)置含不同濃度納米硒（0.25、0.5、1、2.5、5、10 mmol/L）的種子培養(yǎng)液，發(fā)芽試驗(yàn)方法參照呼鳳蘭等[25]的研究。準(zhǔn)備無菌培養(yǎng)皿（12 cm），皿內(nèi)鋪墊2～3層濾紙，每個皿中放入40粒種子，按照不同處理加入相應(yīng)濃度的納米硒培養(yǎng)液10 mL，等量水做對照組，蓋上皿蓋。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)皿置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，次日開始統(tǒng)計種子發(fā)芽個數(shù)，以油麥菜種子吐白1 mm為標(biāo)準(zhǔn)。連續(xù)3 d無新增發(fā)芽種子則視為不發(fā)芽，連續(xù)觀察和記錄，7 d后統(tǒng)計油麥菜的發(fā)芽勢（GE）和發(fā)芽指數(shù)（GI）。GE/%=（發(fā)芽高峰期種子數(shù)/40）×100；GI/%=∑(G/D)×100，其中G為第天當(dāng)天的發(fā)芽數(shù)，D為發(fā)芽時間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本研究中涉及的所有試驗(yàn)沒有特殊說明的均設(shè)置3個重復(fù)，所得數(shù)據(jù)采用軟件SAS 9.4進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用origin 2021分析作圖，利用Design-Expert 12.0進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌XP生物合成納米硒工藝條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 底物Se(IV)初始濃度對納米硒產(chǎn)量的影響

底物濃度是影響生物發(fā)酵過程目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)量的主要因素之一。不同初始Se(IV)濃度條件下，菌株XP合成納米硒的結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著發(fā)酵體系中的底物Se(IV)濃度逐漸增加，納米硒的產(chǎn)量隨之呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)Se(IV)濃度為2 mmol/L時，納米硒產(chǎn)量最高為0.73 mmol/L。李嚴(yán)等[26]研究了1～4 mmol/L亞硒酸鹽Se(IV)條件下，產(chǎn)堿桿菌（sp.）和普羅菲登斯菌（sp.）合成納米硒的能力，發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，推測是由于Se(IV)濃度過高會對菌株產(chǎn)生毒性作用，從而造成菌株還原Se(IV)的能力降低。BORAH等[27]通過研究發(fā)現(xiàn)，擬蕈狀芽孢桿菌（）在1.25～10 mmol/L亞硒酸鹽Se(IV)條件下，合成納米硒的效率和底物Se(IV)初始濃度密切相關(guān)，表現(xiàn)為硒初始濃度越高納米硒合成效率逐漸降低。因此，選擇合適的初始Se (IV) 添加量，對于維持菌株XP的正常代謝生長和納米硒的高效合成至關(guān)重要，基于圖1結(jié)果，確定1～4 mmol/L作為下步Box-Behnken試驗(yàn)的Se(IV)初始濃度范圍。

注：考察單一因素時，其余因素的量值固定為：搖床轉(zhuǎn)速180 r·min-1、菌株XP接種量1%、底物Se(IV) 濃度4 mmol·L-1，不同字母表示差異明顯（P<0.05），下同。

2.1.2 搖床轉(zhuǎn)速對納米硒產(chǎn)量的影響

除底物濃度之外，搖床轉(zhuǎn)速對菌株代謝產(chǎn)物的合成過程也至關(guān)重要。轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌菌株XP合成納米硒的影響結(jié)果如圖2所示，在120～200 r/min范圍內(nèi)，菌株XP發(fā)酵產(chǎn)納米硒的量在0.88～0.57 mmol/L之間。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時，發(fā)酵液中納米硒含量最高（0.88 mmol/L）；搖床轉(zhuǎn)速增加至200 r/min，發(fā)酵液中納米硒的含量最低（0.57 mmol/L）。任玉文等[28]的研究表明，轉(zhuǎn)速過快會對培養(yǎng)體系中的菌體產(chǎn)生一定程度的機(jī)械損傷，從而造成菌體衰亡，抑制代謝產(chǎn)物的合成；王宏浩等[29]在對枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)速過慢則易致使發(fā)酵體系中的溶解氧含量降低，導(dǎo)致好氧菌株生長繁殖變緩，甚至使培養(yǎng)基發(fā)生沉淀，造成代謝產(chǎn)物合成量大幅降低。因此，搖床轉(zhuǎn)速過高或過低都不利于微生物的生長及代謝物的合成，選擇合適的轉(zhuǎn)速對于促進(jìn)菌株XP生物合成納米硒至關(guān)重要?；趫D2結(jié)果，確定120～180 r/min作為下步Box-Behnken試驗(yàn)的搖床轉(zhuǎn)速范圍。

2.1.3 接種量對納米硒產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程中，菌株的接種量過高或過低均會對整個發(fā)酵過程產(chǎn)生不利影響。菌株XP接種量對納米硒合成量的影響結(jié)果如圖3所示。當(dāng)菌株XP接種量在0.5%～10%之間時，納米硒產(chǎn)量隨接種量增加而增加；當(dāng)接種量為5%時納米硒合成量最高，為1.04 mmol/L；當(dāng)接種量增加到10%時，納米硒產(chǎn)量有輕微下降，但與5%接種量處理組相比無顯著性（>0.05）差異，納米硒合成量保持在相對恒定的水平。孫雨佳等[30]的研究表明，接種量過高，會導(dǎo)致發(fā)酵體系溶解氧快速消耗殆盡，進(jìn)而抑制菌株自身的生長以及代謝產(chǎn)物的合成。張羽竹等[31]通過研究植物乳酸桿菌還原亞硒酸鹽產(chǎn)納米硒，發(fā)現(xiàn)適宜的接種量（2%～4%）可使納米硒合成效果維持在較高的水平，接種量過低會顯著降低納米硒的合成量。合成同一目標(biāo)產(chǎn)物的最適接種量會因菌株種類的不同而表現(xiàn)出較大的差異，明確菌株XP的最適接種量將能有效提升菌株XP發(fā)酵產(chǎn)納米硒的量?；趫D3結(jié)果推測菌株XP最佳接種量在5%附近，雖10%處理與5%處理之間無顯著性差異，但二者之間差值較大，最佳值也可能位于5%～10%之間，綜合考量最終選定2.5%～10%作為下步Box-Behnken試驗(yàn)的接種量范圍。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對納米硒產(chǎn)量的影響

圖3 枯草芽孢桿菌XP接種量對納米硒合成的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 12 軟件對發(fā)酵體系初始Se (IV) 濃度、搖床轉(zhuǎn)速、菌株XP接種量進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸方程及方差分析

運(yùn)用Design-Expert 12 軟件中“Analysis”對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。得到初始Se (IV) 濃度（）、搖床轉(zhuǎn)速（）、接種量（）之間的二次回歸方程=1.767 1+ 0.516 6–0.091 8+0.130 7+0.049 5+0.001 2+ 0.185 6–0.419 92–0.270 52–0.075 32。由表3中的二次回歸模型方差分析結(jié)果可知，此回歸模型極顯著（= 0.000 4＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（=0.057 1＞0.05），說明方程模擬較好，可用此模型對納米硒產(chǎn)量進(jìn)行分析與預(yù)測；該模型的決定系數(shù)2=0.961 2，信噪比13.311 1＞4，表明模型可信度較高；模型一次項(xiàng)極顯著（＜0.01）、顯著（＜0.05），交互項(xiàng)顯著（＜0.05），二次項(xiàng)2、2極顯著（＜0.01）。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果

表3 二次回歸模型的方差分析

2.2.3 響應(yīng)面立體圖分析

根據(jù)回歸方程所得的響應(yīng)面立體圖如圖4所示，主要反映了初始Se(IV)濃度、搖床轉(zhuǎn)速、XP接種量三者之間的相互作用，通過2.2.2中的回歸方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 12.0 分析求解得到模型最大值，最優(yōu)產(chǎn)納米硒的發(fā)酵條件為：初始Se(IV) 3.4 mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速157 r/min、菌株XP接種量9.9%，此時由模型預(yù)測的SeNP產(chǎn)量為1.99 mmol/L。

圖4 初始Se(IV)濃度、搖床轉(zhuǎn)速與菌株XP接種量交互作用對納米硒產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 模型預(yù)測納米硒合成量的試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)上述模型優(yōu)化的結(jié)果，設(shè)置菌株XP合成納米硒的實(shí)際發(fā)酵條件為：初始Se (IV) 3.4 mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速157 r/min、菌株XP接種量9.9%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時間為48 h。對模型優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù)，最終結(jié)果取平均值。最終，試驗(yàn)結(jié)果表明菌株XP發(fā)酵液中SeNP的含量為 (1.82±0.25) mmol/L，接近理論預(yù)測值，表明上述優(yōu)化的模型可靠。

2.3 不同濃度生物納米硒對種子活力的影響

優(yōu)化條件下發(fā)酵產(chǎn)物中菌體和納米硒的形態(tài)如圖5a所示（箭頭所指為納米硒顆粒），分離去除細(xì)胞得到的純納米硒顆粒形態(tài)如圖5a中的小圖所示。通過種子發(fā)芽試驗(yàn)，對已去除細(xì)胞的純納米硒生物活性做進(jìn)一步分析。如圖5b所示，當(dāng)SeNP處理濃度在0.25～1 mmol/L范圍時，油麥菜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈上升趨勢；當(dāng)SeNP濃度達(dá)到1 mmol/L時，發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)均顯著（<0.05）高于無硒對照組（Control），分別為66%和31%。這說明0.25～1 mmol/L SeNP處理對油麥菜種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用，1 mmol/L的SeNP處理最有利于油麥菜種子的萌發(fā)。ANTONY等[32]用納米硒處理硬皮豆（）種子，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的納米硒可以增強(qiáng)種子的生命力，原因是由于納米硒處理促進(jìn)了種子快速萌發(fā)所需的H2O和O2的攝入。此外，納米材料也可以通過降低植物種子內(nèi)脫落酸的含量，從而提高赤霉素含量，改變種子的休眠周期[33]。通過納米硒處理后的種子具有較強(qiáng)的抗病能力，可以進(jìn)一步提升幼苗期耐受環(huán)境污染的能力，促進(jìn)種子的萌發(fā)、幼苗的生長以及后續(xù)植株的發(fā)育[34-36]。

圖5 納米硒掃描電鏡圖像和不同濃度SeNP對油麥菜種子活性的影響

3 結(jié) 論

本研究針對枯草芽孢桿菌菌株XP生物合成納米硒的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對優(yōu)化條件下發(fā)酵產(chǎn)生的納米硒生物活性做了進(jìn)一步分析。首先通過單因素試驗(yàn)，解析了“初始Se (IV) 濃度、搖床轉(zhuǎn)速、菌株XP接種量”3個主要因素對納米硒合成的影響規(guī)律，確定了后續(xù)試驗(yàn)這3個因素的范圍值依次為1～4 mmol/L、120～180 r/min、2.5%～10%。基于此，進(jìn)行了三因素三水平正交試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)建立了二次多項(xiàng)式回歸模型。最終，確定菌株XP合成納米硒的最佳發(fā)酵條件為：初始Se(IV) 3.4 mmol/L、搖床轉(zhuǎn)速157 r/min、菌株XP接種量9.9%。進(jìn)一步通過實(shí)際試驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化工藝下納米硒產(chǎn)量（1.82 mmol/L）比優(yōu)化前的（1.04 mmol/L）提高了60%以上。在此條件下合成的納米硒可以有效提升蔬菜種子的活力，促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究采用的發(fā)酵工藝優(yōu)化技術(shù)大大提升了目前芽孢桿菌產(chǎn)納米硒的效率，有效解決了微生物合成納米硒產(chǎn)率低這一瓶頸問題。研究結(jié)果不僅為今后生物納米硒的規(guī)?；a(chǎn)提供了理論參考，而且也為后續(xù)耐硒菌株的功能開發(fā)、納米硒的綠色高效合成及其在富硒農(nóng)作物安全生產(chǎn)中的應(yīng)用推廣提供了有力支撐。

[1] EHUDIN M A, GOLLA U, TRIVEDI D, et al. Therapeutic benefits of selenium in hematological malignancies[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(14): 7972.

[2] RAYMAN M P. The importance of selenium to human health[J]. Lancet, 2000, 356(9225): 233-41.

[3] WEN C, HE X, ZHANG J, et al. A review on selenium-enriched proteins: Preparation, purification, identification, bioavailability, bioactivities and application[J]. Food and Function 2022, 13(10): 5498-5514.

[4] YIN H, QI Z, LI M, et al. Selenium forms and methods of application differentially modulate plant growth, photosynthesis, stress tolerance, selenium content and speciation inL[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 169: 911-917. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2018.11.080

[5] NANCHARAIAH Y V, LENS P N L. Selenium biomineralization for biotechnological applications[J]. Trends in Biotechnology, 2015, 33(6): 323-330.

[6] BERGER S B, ENCK R C, SCHARFE M E, et al. The application of selenium and its alloys to xerography[M]. Berlin : Gerlach E & Grosse P, 1979, 13: 256-266. https://doi.org/10.1007/ 978-3-642-81398-6_40

[7] DINH Q T, CUI Z, HUANG J, et al. Selenium distribution in the Chinese environment and its relationship with human health: a review[J]. Environment International, 2018, 112: 294-309.

[8] WANG H, ZHANG J, YU H. Elemental selenium at nano size possesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes: comparison with selenomethionine in mice[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2007, 42(10): 1524-1533.

[9] BANACH M, PULIT-PROCIAK J. Proecological method for the preparation of metal nanoparticles[J]. Journal of Cleaner Production, 2017, 141: 1030-1039.

[10] BISHT N, PHALSWAL P, KHANNA P K, et al. Selenium nanoparticles: a review on synthesis and biomedical applications[J]. Materials Advances, 2022, 3(3): 1415-1431.

[11] KUMAR A, PRASAD K S. Role of nano-selenium in health and environment[J]. Journal of Biotechnology, 2021, 325: 152-163.

[12] HOSNEDLOVA B, KEPINSKA M, SKALICKOVA S, et al. Nano-selenium and its nanomedicine applications: A critical review[J]. International Journal of Nanomedicine, 2018, 13: 2107-2128.

[13] WADHWANI S A, SHEDBALKAR U U, SINGH R, et al. Biogenic selenium nanoparticles: Current status and future prospects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(6): 2555-2566.

[14] BORAH S N, GOSWAMI L, SEN S, et al. Selenite bioreduction and biosynthesis of selenium nanoparticles bySP3 isolated from coal mine overburden leachate[J]. Environmental Pollution, 2021, 285: 117519.

[15] SHIRSAT S, KADAM A, NAUSHAD M, et al. Selenium nanostructures: microbial synthesis and applications[J]. RSC Advances, 2015, 5(112): 92799-92811.

[16] FARIQ A, KHAN T, YASMIN A. Microbial synthesis of nanoparticles and their potential applications in biomedicine[J]. Journal of Applied Biomedicine, 2017, 15(4): 241-248.

[17] FESHARAKI P J, NAZARI P, SHAKIBAIE M, et al. Biosynthesis of selenium nanoparticles usingand their recovery by a simple sterilization process[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2010, 41(2): 461-466.

[18] XU X, CHENG W, LIU X, et al. Selenate reduction and selenium enrichment of tea by the endophyticsp. strain WT00C[J]. Current Microbiology, 2020, 77(4): 588-601.

[19] TAN Y, YAO R, WANG R, et al. Reduction of selenite to Se(0) nanoparticles by filamentous bacteriumsp. ES2-5 isolated from a selenium mining soil[J]. Microbial Cell Factories, 2016, 15(1): 157-157.

[20] KORA A J, RASTOGI L. Biomimetic synthesis of selenium nanoparticles byATCC 27853: An approach for conversion of selenite[J]. Journal of Environmental Management, 2016, 181: 231-236.

[21] JIN P, REN B, WANG X, et al. Mechanism of microbial metabolic responses and ecological system conversion under different nitrogen conditions in sewers[J]. Water Research, 2020, 186: 116312.

[22] WELLS M, STOLZ J F. Microbial selenium metabolism: A brief history, biogeochemistry and ecophysiology[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2020, 96(12): 209.

[23] 朱燕云，孔祥平，吳娥嬌，等. 耐高鹽枯草芽孢桿菌 XP 合成球形納米硒及其抑制草莓病原真菌生物活性[J]. 生物工程學(xué)報，2021，37(8)：2825-2835.

ZHU Yanyun, KONG Xiangping, WU Ejiao, et al. Biosynthesis of spherical selenium nanoparticles with halophilicsubspeciesstrain XP for inhibition of strawberry pathogens[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(8): 2825-2835. (in Chinese with English abstract)

[24] BISWAS K C, BARTON L L, TSUI W L, et al. A novel method for the measurement of elemental selenium produced by bacterial reduction of selenite[J]. Journal of Microbiological Methods, 2011, 86(2): 140-144.

[25] 呼鳳蘭，周淑萍. 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對冰菜種子萌發(fā)的影響[J]. 種子，2021，40(6): 112-115.

HU Fenglan, ZHOU Shuping. Effects of different plant growth regulators on seed germination of[J]. Seeds, 2021, 40(6): 112-115. (in Chinese with English abstract)

[26] 李嚴(yán)，楊婧，吳煒澤，等. 細(xì)菌共培養(yǎng)體系合成納米硒特性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2022，28(2)：379-386.

LI Yan, YANG Jing, WU Weize, et al. Biosynthesis of selenium nanoparticles by a bacteria co-culture system[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental, 2022, 28(2): 379-386. (in Chinese with English abstract)

[27] BORAH S N, GOSWAMI L, SEN S, et al. Selenite bioreduction and biosynthesis of selenium nanoparticles bySP3 isolated from coal mine overburden leachate[J]. Environmental Pollution, 2021, 285:117519.

[28] 任玉文，任媛媛，劉雅禎. 抗植物軟腐病枯草芽孢桿菌的高密度發(fā)酵優(yōu)化[J]. 河北科技大學(xué)學(xué)報，2020，41(5)：433-441.

REN Yuwen, REN Yuanyuan, LIU Yazhen. Optimization of high-density fermentation forresistant to plant soft rot[J]. Journal of Hebei University of Science and Technology, 2020, 41(5): 433-441. (in Chinese with English abstract)

[29] 王宏浩，張高瑜，逯夢凡，等. 枯草芽孢桿菌ZX-11培養(yǎng)條件及抑菌性能研究[J]. 中國釀造，2022，41(7)：138-143.

WANG Honghao, ZHANG Gaoyu, LU Mengfan, et al. Culture conditions and antibacterial property of Bacillus subtilis ZX-1[J]. China Brewing, 2022, 41(7): 138-143. (in Chinese with English abstract)

[30] 孫雨佳，黃輝，劉長根，等. 植物乳桿菌NCU137培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J/OL]. 中國食品學(xué)報，[2022-08-15]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.4528.TS.20220727.1818.002.html

SUN Yujia, HUANG Hui, LIU Changgen, et al. Optimization of medium composition and culture conditions ofNCU137[J/OL]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, [2022-08-15]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.4528.TS.20220727.1818.002.html (in Chinese with English abstract)

[31] 張羽竹，王冰宜，曾梓敖，等. 植物乳桿菌還原形成不同粒徑納米硒的培養(yǎng)條件及其生物活性分析[J]. 食品科學(xué)，2020，41(22)：119-126.

ZHANG Yuzhu, WANG Bingyi, ZENG Ziao, et al. Effect of culture conditions on the formation of selenium nanoparticles with different particle sizes by microbial reduction usingand their bioactivity evaluation[J]. Food Science, 2020, 41(22): 119-126. (in Chinese with English abstract)

[32] ANTONY D, YADAV R, KALIMUTHU R. Accumulation of pyto-mediated nano-CeO2and selenium doped CeO2on(horse gram) seed by nano-priming to enhance seedling vigor [J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2021, 31: 101923.

[33] 薛琳，孫宇彤，盛明悅，等. 納米材料對作物種子萌發(fā)及生長發(fā)育的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2020，36(21)：33-39.

XUE Lin, SUN Yutong, SHENG Mingyue, et al. Nanomaterials: effects on seed germination and growth and development of crop[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2020, 36(21): 33-39. (in Chinese with English abstract)

[34] NANDINI B, HARIPRASAD P, PRAKASH H S, et al. Trichogenic-selenium nanoparticles enhance disease suppressive ability ofagainst downy mildew disease caused byin pearl millet[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 2612. https://doi.org/10.1038/ s41598-017-02737-6

[35] ADHIKARY S, BISWAS B, CHAKRABORTY D, et al. Seed priming with selenium and zinc nanoparticles modifies germination, growth, and yield of direct-seeded rice (L.)[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 7103.

[36] EL-BADRI A M, BATOOL M, WANG C, et al. Selenium and zinc oxide nanoparticles modulate the molecular and morpho- physiological processes during seed germination ofunder salt stress[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 225: 112695. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2021.112695

Optimization and bio-activity evaluation of nano-selenium biosynthesis bysp.

ZHU Yanyun1,2,3, WANG Xin4, CHEN Danyan5, MA Jingze5, ZHU Ning1,2, JIN Hongmei1,2,4※

(1.210014,; 2.210095,; 3.,210014,; 4.210095,; 5.210038,)

Nano-selenium, as a kind of new functional nanomaterials, has attracted wide attention from all over the word. Compared with inorganic selenium, organic selenium or elemental selenium, nano-selenium has a lot of outstanding features, including high biological activity, low toxicity, and large surface area. Biosynthetic process is regarded as a relatively efficient and environment-friendly pathway to produce nanomaterials. Our previous study found thatsubspeciesstrainXP, as a biocontrol bacteria strain, not only had strong resistance to selenium or salt, but also had strong ability of transform inorganic selenium with higher toxicity into selenium nanoparticle (SeNP) with higher bioactivity and safety. Furthermore, the strain XP has been confirmed to have higher safety and bioactivity compared to those identified strains. But so far, the SeNP yield from selenite reduction by strain XP metabolism is inefficient, which seriously hinders the wide application of this technology. As we all known, fermentation process parameters have great influence on the selenite reduction and SeNP yield. Choosing appropriate parameters can increase in the SeNP production, as well as reduce the cost of SeNP synthesis. Response surface methodology (RSM) has been considered to be an effective method of process parameter optimization. In this study, the synthesis conditions (e.g., selenite concentration, speed of cultivation, dosage of inoculation) were further optimized to improve the biological efficiency of SeNP synthesis by strain XP. The fermentation conditions were optimizedby single factor test, Box-Behnken design (BBD), and response surface methodology. Firstly, the effects of different initial Se (IV) concentrations (1-8 mmol/L) in the culture medium, shaker speeds (120-200 r/min), and the amounts of strain XP inoculation (0.5-10%) on SeNP production were tested by single factor experiment. The production of SeNP increased first and then decreased with gradual increase of initial Se (IV) concentrations. With the shaking speed going up from 120 r/min to 200 r/min, SeNP production also increased first and then decreased. When the inoculum amount of strain XP was between 0.5% and 10%, the yield of SeNP enhanced rapidly along with the increase of inoculum amount. The results showed that each selected experiment parameter had a strong influence on the SeNP production within their scopes: 1-4 mmol/L Se(IV), 120-180 r/min, and 2.5%-10%, respectively. Based on it, the optimal range of each indicator was confirmed. Meanwhile, the above three factors were taken as the influencing factors and SeNP production was used as the response index. Secondly, the Box-Behnken response surface methodology (RSM) was applied to optimize the fermentation conditions of strain XP used for SeNP biosynthesis. Finally, the optimal theoretical value of fermentation condition obtained through response surface experiments were verified by actual experiments. The results indicated that the optimal fermentation condition for SeNP biosynthesis byXP were as follows: initial Se (IV) concentration of 3.4 mmol/L, shaker speed of 157 r/min, and inoculum amount of 9.9%. The SeNP production was 1.82 mmol/L under the optimum condition, which was increased by more than 60% over that under normal condition. Moreover, the seed germination experiment was conducted for confirming the bio-activity of SeNP biosynthesis under optimized culture condition. Application of SeNP could effectively stimulate the Indian lettuce seed vigor and promote the germination process.

bacteria; fermentation; response surface methodology;; nano-selenium; bio-activity

10.11975/j.issn.1002-6819.202208144

S2

A

1002-6819(2023)-01-0269-08

朱燕云，王欣，陳丹艷，等. 芽孢桿菌生物合成納米硒條件優(yōu)化及活性評價[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2023，39(1)：269-276.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202208144 http://www.tcsae.org

ZHU Yanyun, WANG Xin, CHEN Danyan, et al. Optimization and bio-activity evaluation of nano-selenium biosynthesis bysp.[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(1): 269-276. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202208144 http://www.tcsae.org

2022-07-28

2022-12-02

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（42107026）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(20)3078）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計劃（社會發(fā)展）項(xiàng)目（BE2022788）

朱燕云，博士，助理研究員，研究方向?yàn)榧{米硒的生物合成機(jī)制以及納米硒在環(huán)境修復(fù)方面的應(yīng)用研究。Email：yyz_leo@126.com

靳紅梅，博士，研究員，研究方向?yàn)樾滦臀廴疚锏倪w移轉(zhuǎn)化及產(chǎn)地投入品污染防控研究。Email：hmjin@jaas.ac.cn