楊 婷 綜述，劉思佳，李小麗，劉 鑫 審校

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，重慶 400038)

膿毒癥系指機體對感染的免疫反應(yīng)失調(diào)而引發(fā)的危及生命的器官功能障礙，是導(dǎo)致臨床危重癥患者死亡的首要因素[1]。肝臟是人體最主要的代謝和免疫器官，在膿毒癥中發(fā)揮關(guān)鍵性的免疫防御與代謝調(diào)節(jié)作用。肝臟也是膿毒癥中最常累及受損的臟器之一。膿毒癥所致的肝損傷/肝功能障礙已被認為是預(yù)警患者早期(28 d)死亡的獨立危險因素，并與慢性期(1年)死亡率也呈顯著正相關(guān)[2]。膿毒癥肝損傷的發(fā)病機制復(fù)雜，可能與病原體感染和內(nèi)毒素水平升高，炎癥因子過度釋放、氧自由基和脂質(zhì)過氧化損傷，肝組織微循環(huán)障礙及能量代謝紊亂等機制密切相關(guān)，進而引發(fā)以肝實質(zhì)細胞死亡和肝間質(zhì)細胞過度活化為特征的肝組織病理生理改變，最終造成缺氧性肝炎、膽汁淤積和繼發(fā)硬化性膽管炎等主要的臨床表現(xiàn)[3]。肝臟細胞死亡是膿毒癥肝損傷發(fā)生的基礎(chǔ)性事件，其中既包括非裂解形式的凋亡，也包括各種形式的裂解性細胞死亡(LCD)。因后者可導(dǎo)致各類胞內(nèi)成分的大量釋放，具有更加強烈的致炎和免疫激活作用及播散效應(yīng)，因而在膿毒癥肝損傷中的作用更受關(guān)注。LCD又可分為非調(diào)控性的壞死和近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的具有受控特點的LCD，如壞死性凋亡、焦亡、中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)死亡(NETosis)和鐵死亡等[4]。既往研究認為，非調(diào)控性的壞死是肝細胞發(fā)生LCD的主要形式。近來研究認識到受控性細胞死亡(RCD)在膿毒癥肝損傷發(fā)生中更加扮演重要的角色。因其具有確切的響應(yīng)機制和調(diào)控性靶點，與膿毒癥的病理生理機制關(guān)系密切，故已成為本領(lǐng)域當(dāng)前研究的焦點和熱點問題。為此，本文擬就有關(guān)RCD的主要類型、發(fā)生規(guī)律和調(diào)控機制及其在膿毒癥肝損傷中的作用研究進展進行綜述，旨在為膿毒癥肝損傷的病理生理機制和治療靶點研究提供新視角。

1 RCD的主要特點

RCD是一類由特定的死亡誘導(dǎo)分子和信號機制啟動，在生理和病理條件下都是促使達到死亡閾值的細胞進入死亡程序的主要形式，以維持或恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。根據(jù)死亡細胞是否發(fā)生胞膜破裂和內(nèi)容物溢出，RCD又可分為LCD和非裂解性死亡(non-LCD)[5]。胞膜破裂是RCD的顯著標志，其依賴于特定破膜復(fù)合物(如壞死小體和炎癥小體等)的組裝，并受到內(nèi)外源性啟動機制的調(diào)控。RCD的另一顯著特征是危險相關(guān)分子模式(DAMPs)等分子的大量釋放，進而引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。已有研究證明，RCD與不同原因引起炎癥性疾病的進展密切相關(guān)，其中就包括膿毒癥引起的肝損傷[6]。

盡管不同亞型的RCD在啟動分子、信號通路和和破膜機制上存在差異，但有一些共性調(diào)控分子/通路參與各類RCD的發(fā)生，使得不同的細胞死亡方式得以共存或互補，共同介導(dǎo)肝臟細胞死亡和肝損傷的發(fā)生。從誘導(dǎo)因素來看，感染和炎癥是目前已知最為主要的啟動機制。細菌及細菌結(jié)構(gòu)分子(如內(nèi)毒素等)均可直接或與其他因素協(xié)同誘導(dǎo)過度或持續(xù)性炎癥反應(yīng)，進而啟動引發(fā)細胞破裂和死亡的相關(guān)信號機制。與此同時，LCD細胞也可釋放炎癥因子或促進炎癥介質(zhì)的表達，使得炎癥反應(yīng)進一步放大，造成惡性循環(huán)[7-8]。從關(guān)鍵信號分子來看，活性氧(ROS)和鈣離子(Ca2+)作為胞內(nèi)常見的信使分子，對受體相互作用蛋白激酶(RIPK)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)等介導(dǎo)RCD發(fā)生的關(guān)鍵信號分子具有調(diào)控作用。ROS和Ca2+的異常活化可以影響上述信號分子的活化水平，誘導(dǎo)壞死性凋亡、焦亡、NETosis和鐵死亡在內(nèi)的各類細胞死亡途徑，造成組織損傷[9-10]。此外，近期證據(jù)表明，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)作為關(guān)鍵的開關(guān)分子，在不同條件下決定了細胞向凋亡、壞死性凋亡和焦亡的不同走向[11]，而caspase-8如何調(diào)控不同細胞死亡的發(fā)生，仍有待研究證實。從破膜后效應(yīng)來看，組蛋白、熱休克蛋白、腺苷三磷酸(ATP)及白細胞介素(IL)等DAMPs的大量釋放在各類RCD均可見，同時可進一步誘導(dǎo)細胞死亡的發(fā)生，但各類DAMPs的釋放和后續(xù)作用在不同RCD類型中是否具有選擇性仍有待進一步研究加以證實[12]。

2 LCD的主要類型與機制

2.1壞死性凋亡 RAY等[13]在1996年觀察到感染牛痘病毒的豬腎細胞死亡的裂解模式，提供了首個有關(guān)壞死性凋亡的直接證據(jù)。壞死性凋亡是一種具有壞死樣形態(tài)和凋亡樣調(diào)控機制的細胞死亡模式，主要由受體相互作用蛋白(RIPK1和RIPK3)和混合譜系激酶域樣蛋白(MLKL)介導(dǎo)，表現(xiàn)為細胞體積增加、細胞質(zhì)腫脹和早期膜破裂等特征。壞死性凋亡依賴于腫瘤壞死因子受體(TNFR)、Fas和TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體(TRAIL-R)激活，并與RIPK1相互作用調(diào)節(jié)RIPK3/MLKL通路誘導(dǎo)壞死性凋亡和壞死小體形成[14]。此外，Z-DNA結(jié)合蛋白(ZBP1)的下游包含多個RHIM域也可以招募并激活RIPK1和RIPK3誘導(dǎo)壞死性凋亡[15]。RIPK1被認為是調(diào)節(jié)壞死性凋亡的關(guān)鍵激酶，激活核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，而無活性的caspase-8則可裂解RIPK1激活壞死性凋亡。MLKL作為關(guān)鍵介質(zhì)，被RIPK3磷酸化，誘導(dǎo)寡聚化并易位至質(zhì)膜上形成孔隙，隨后胞膜破裂導(dǎo)致細胞內(nèi)容物釋放，大量DAMPs暴露引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞走向死亡[16]。

2.2焦亡 1992年，ZYCHLINSKY等[17]發(fā)現(xiàn)被福氏志賀菌感染的巨噬細胞出現(xiàn)一種裂解形式死亡的方式，并將其定義為焦亡。焦亡以質(zhì)膜中caspase依賴性小孔的形成為特征，形態(tài)上表現(xiàn)為細胞破裂和腫脹。細胞焦亡可由典型或非典型信號通路激活，當(dāng)炎癥小體傳感器分子：NLRP1/3或黑色素瘤-2(AIM2)缺失時，Toll樣受體(TLRs)通過識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和DAMPs，激活NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體復(fù)合體促進了原IL-1β、IL-18裂解為活性形式，并刺激caspase-1的激活誘導(dǎo)消皮素D(GSDMD)裂解，形成質(zhì)膜孔，從而觸發(fā)焦亡的典型途徑。在非經(jīng)典途徑中，胞漿內(nèi)脂多糖(LPS)和PAMPs直接刺激caspase-4/5/11裂解GSDMD，活化的GSDMD結(jié)合膜磷脂，啟動孔隙形成并導(dǎo)致細胞膜裂解[18]。Caspase-3/8也被認為是介導(dǎo)焦亡的新機制，在TNF-α或RIPK1的激活下，caspase-3/8可以特異性地切割和激活GSDME，釋放N端與細胞膜結(jié)合，形成“gasdermin通道”參與細胞焦亡[19]。

2.3NETosis 2004年，BRINKMANN等[20]首次定義了中性粒細胞自殺式死亡和釋放胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的生理現(xiàn)象，稱之為NETosis 。起初，研究人員將NETosis定義為NADPH氧化酶(NOX)依賴的細胞死亡過程，形態(tài)上表現(xiàn)為染色質(zhì)解聚、核腫脹、核膜和顆粒膜的裂解[21]。NETosis涉及觸發(fā)NOX依賴性途徑、ROS的產(chǎn)生和RIPK/MLKL信號通路。在ROS的作用下，中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、髓過氧化物酶(MPO)和NOX復(fù)合物被Raf-MEK-ERK途徑激活，聯(lián)合參與染色質(zhì)的解聚和核膜破裂。此外，PAD4酶通過TLR4和TLR9信號通路激活，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，催化組蛋白的瓜氨酸化和染色質(zhì)解聚并排出細胞外[22]。在NETosis后期，GSDMD被NE分解激活，影響蛋白酶的激活和核擴張的前饋循環(huán)，在中性粒細胞的質(zhì)膜和核膜上形成孔隙，導(dǎo)致中性粒細胞死亡[23]。近來發(fā)現(xiàn)，病原體及PAMPs和DAMPs分子還可通過獨立于NOX的途徑介導(dǎo)NETosis的發(fā)生，但具體機制仍有待探討。

2.4鐵死亡 2003年在使用一種細胞滲透性化合物(Erastin)處理細胞的過程中首次觀察到鐵死亡現(xiàn)象。2012年，DIXON等[24]將Erastin誘導(dǎo)的鐵超載和ROS依賴性脂質(zhì)過氧化物積累引起的細胞死亡定義為鐵死亡，其形態(tài)表現(xiàn)為細胞體積縮小和線粒體膜密度增加，不同于細胞凋亡，無細胞器腫脹和染色質(zhì)濃縮。細胞內(nèi)的鐵積累是通過鐵死亡激活劑Erastin和RSL3誘導(dǎo)增加不穩(wěn)定鐵池，以及通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS激活脂質(zhì)過氧化的酶引起氧化應(yīng)激，誘發(fā)鐵死亡[25]。鐵死亡的過程中脂質(zhì)過氧化有助于細胞質(zhì)膜通透，從而釋放DAMPs引發(fā)炎癥。鐵死亡發(fā)生的3個主要途徑分別為GSH/GPX4/XC-系統(tǒng)、鐵代謝途徑和脂質(zhì)代謝途徑。其中，GSH依賴性酶谷胱甘肽酶-4(GPX4)是鐵死亡主要的內(nèi)源性抑制劑，具有限制脂質(zhì)過氧化作用。抑制GPX4的活性使得細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物大量堆積已成為鐵死亡的標志[26]。

3 RCD在膿毒癥肝損傷中的作用

3.1概述 有研究已證實，肝臟細胞死亡是肝功能障礙的膿毒癥患者中的重要表現(xiàn)，并與低生存率有關(guān)[27]。肝細胞LCD加重了肝臟損傷，對膿毒癥的嚴重程度和預(yù)后的影響更為重要。在膿毒癥期間，肝組織中的肝細胞、血管內(nèi)皮細胞和膽管上皮細胞因病原體、有毒代謝物、ROS和膽汁酸的累積而受損，導(dǎo)致DAMPs的大量釋放。LCD與PAMPs協(xié)同通過TLRs激活肝臟常駐細胞(如Kupffer細胞、肝星狀細胞、竇道內(nèi)皮細胞等)和因損傷而被招募的免疫細胞(如巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞等)，誘導(dǎo)肝細胞發(fā)生凋亡或LCD[28]。此外，肝臟常駐的間質(zhì)細胞與招募而來的免疫細胞也可發(fā)生自身的凋亡、壞死和焦亡，進一步加劇肝損傷[29]。

3.2壞死性凋亡與膿毒癥肝損傷 壞死性凋亡是肝臟細胞死亡的另一種常見形式，也是導(dǎo)致膿毒癥肝損傷的重要細胞死亡機制之一。研究顯示，壞死性凋亡中關(guān)鍵激酶(如RIPK1等)的表達缺失或活性抑制可導(dǎo)致對膿毒癥重要細胞死亡誘導(dǎo)因子腫瘤壞死因子(TNF)的應(yīng)答性顯著降低，肝、肺等臟器損傷也得到顯著改善[30-31]。XU等[32]通過LPS誘導(dǎo)仔豬肝臟損傷并觀察到典型的細胞壞死性凋亡的關(guān)鍵成分，包括激酶(RIPK1、RIPK3和MLKL)的表達、線粒體蛋白(PGAM5和DRP1)和細胞內(nèi)DAMPs，如高遷移率族蛋白1(HMGB1)等以時間依賴性增加。其次是肝臟炎癥、形態(tài)學(xué)損傷和功能障礙，表現(xiàn)為肝臟炎癥指標IL-1β、IL-6和TNF-α表達增加，以及血清谷草轉(zhuǎn)氨酸(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平升高。用壞死抑制因子-1(Nec-1)預(yù)處理后，RIPK1、RIPK3和MLKL及PGAM5、DRP1和HMGB1的表達可顯著降低，從而減輕肝臟炎癥和損害。結(jié)果表明，發(fā)生膿毒癥時肝臟可發(fā)生壞死性凋亡，并與肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)。此外，GU等[33]發(fā)現(xiàn)，miR-425-5p通過靶向蘇氨酸激酶1(RIP1) mRNA的3′-UTR抑制RIP1/RIP3壞死性凋亡信號通路，從而改善LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷。激活的RIP1逆轉(zhuǎn)miR-425-5p對膿毒癥肝細胞的壞死性凋亡和壞死，該作者進一步使用Nec-1抑制劑進行干預(yù)，結(jié)果表明Nec-1通過抑制RIP1可以減輕膿毒癥和肝損傷。因此，針對RIP1的抑制劑可能對未來膿毒癥肝損傷患者的防治具有潛在的臨床價值。

3.3焦亡與膿毒癥肝損傷 焦亡與肝臟病變高度相關(guān)，如酒精/非酒精性肝病、藥物引起的肝損傷、缺血再灌注和肝移植損傷或繼發(fā)于膿毒癥的器官損傷，均可檢測到細胞焦亡的發(fā)生[34]。巨噬細胞是已知發(fā)生焦亡的主要細胞類型，如LPS可通過激活巨噬細胞中經(jīng)典炎癥小體或非典型炎癥小體，分別介導(dǎo)caspase-1或caspase-11的活化，進而誘發(fā)焦亡，介導(dǎo)臟器損傷。HUANG等[35]研究表明，在小鼠結(jié)扎和穿刺(CLP)膿毒癥急性肝損傷實驗?zāi)Ｐ椭蠬MGB1可促進肝臟巨噬細胞的焦亡，介導(dǎo)膿毒癥急性肝損傷。還有研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞釋放的HMGB1與LPS結(jié)合，并通過高級糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)使其內(nèi)化到巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的溶酶體，在膿毒癥中介導(dǎo)caspase-11依賴性的細胞焦亡[36]。YANG等[37]發(fā)現(xiàn)Maresin 1可以通過抑制MAPK/NF-κB信號和NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的焦亡，激活巨噬細胞M1/M2極化和Nrf2/HO-1信號，改善脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)誘導(dǎo)的膿毒癥急性肝損傷期間的炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝實質(zhì)細胞中也可發(fā)生NLRP3炎癥小體活化和焦亡現(xiàn)象，且與膿毒癥肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)[38-39]。大量研究已證實，抑制炎癥小體活化、阻斷肝臟細胞焦亡的發(fā)生可以顯著緩解膿毒癥所致的急性肝損傷。如在一項體外實驗中，單獨或聯(lián)合使用NLRP3(Glyburide)和caspase-1(AC-YVAD-CMK)抑制劑較LPS+ATP組的caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18的表達降低，可以減少肝細胞的損傷。另一項大鼠體內(nèi)研究結(jié)果也表明，經(jīng)焦亡抑制劑治療后膿毒癥模型動物的生存率顯著提高，肝臟損傷也明顯減輕[40]。

3.4NETosis與膿毒癥肝損傷 NETosis是免疫系統(tǒng)的重要炎癥機制，無菌性炎癥中NETs的釋放促進血栓的形成和介導(dǎo)組織損傷，對冠狀動脈疾病、腎臟、肺部和肝臟等缺血性損傷的預(yù)后具有重要影響[41]。在膿毒癥中，NETosis不僅有利于細菌的清除，也會促進血栓形成和膿毒癥多器官損傷，并與嚴重程度相關(guān)。研究顯示，NETs能在膿毒癥期間的肝臟血管中形成，膿毒癥患者的血漿誘導(dǎo)TLR4依賴性的中性粒細胞與血小板相互作用可以加速NETs的產(chǎn)生[42]。研究通過小鼠模型評估了從膿毒癥到肝臟損傷的病理機制，其結(jié)果表明NET的形成和血管內(nèi)血小板聚集是膿毒癥發(fā)展到肝臟損傷的第一步，而膿毒癥肝功能障礙的根本原因是NET促進竇道內(nèi)皮細胞脫落所引起的血管外血小板聚集[43]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中使用抗瓜氨酸組蛋白H3(H3Cit)與磷酸二酯酶Ⅲ西洛他唑(Ciz)可以抑制體外NET的形成和血小板聚集，免疫組織化學(xué)和流式細胞儀檢測后顯示肝臟中H3Cit、NE和MPO的水平和外周血中H3Cit陽性的中性粒細胞數(shù)量得到明顯改善，提高了小鼠的生存率，表明Ciz可能具有防治膿毒癥肝損傷的潛在價值[44]。

3.5鐵死亡與膿毒癥肝損傷 鐵死亡通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵的水平、ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物影響疾病的發(fā)展，在器官損傷和癌癥的靶向治療中發(fā)揮重要作用。研究顯示，鐵死亡可能參與了膿毒癥肝損傷的發(fā)生、發(fā)展，甚至預(yù)后過程。已有研究證明，鐵死亡參與調(diào)控鐵超載引起的肝臟疾病包括肝損傷、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝細胞癌等[45]。肝臟巨噬細胞可以通過調(diào)節(jié)鐵超載過度誘導(dǎo)HO-1的表達促進肝臟鐵質(zhì)沉著，導(dǎo)致肝細胞存活率下降，肝臟損傷加劇。在使用抗氧化劑抑制鐵死亡作用和巨噬細胞胞外陷阱后，可逆轉(zhuǎn)該狀態(tài)并減輕肝損傷[46]。有報道稱，在膿毒癥肝損傷小鼠模型中鐵死亡相關(guān)基因(Hmox1、Slc3a2、Jun和Zfp36)高表達，并通過B細胞和自然殺傷細胞促進肝細胞衰竭，將成為今后膿毒癥肝損傷治療的候選靶點[47]。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡與線粒體功能密切相關(guān)并影響膿毒癥引起的組織和功能障礙。WEI等[48]研究表明，鳶尾素(irisin)可以通過減少ROS的產(chǎn)生和恢復(fù)線粒體功能來抑制膿毒癥誘發(fā)的肝臟細胞鐵死亡。另外，LI等[49]發(fā)現(xiàn)，一種高度進化和應(yīng)激反應(yīng)的蛋白(Sesn2)可以通過下調(diào)ATF4-CHOP-CHAC1信號通路，抑制膿毒癥中LPS誘導(dǎo)的樹突狀細胞鐵死亡，發(fā)揮其抗氧化作用。并且使用鐵死亡抑制劑治療后促炎性細胞因子明顯減少可改善LPS誘導(dǎo)的膿毒癥損傷。

4 小結(jié)與展望

LCD是一種重要的肝臟細胞死亡類型，并密切參與膿毒癥肝損傷的發(fā)生和發(fā)展。阻斷或減少肝臟細胞的LCD發(fā)生，對減輕膿毒癥肝損傷和改善病情具有潛在的應(yīng)用價值。盡管有關(guān)LCD的發(fā)生及調(diào)控機制正在不斷被揭示，未來仍需進一步探索發(fā)現(xiàn)啟動RCD(壞死性凋亡、焦亡、NETosis和鐵死亡等)的關(guān)鍵分子，闡明重要信號分子和效應(yīng)蛋白及未知的下游因子之間相互作用的確切分子機制，探討相關(guān)拮抗劑的藥理作用，為尋找膿毒癥肝損傷的有效干預(yù)措施提供新的契機和可行性。