莊明亮 李劍飛 李志勇 王志 葛蓬│文

吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108

蜜蜂是重要的社會(huì)性昆蟲(chóng)，占授粉昆蟲(chóng)總數(shù)的80%，具有巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的重要一環(huán)。我國(guó)擁有豐富的蜜蜂遺傳資源，然而，在過(guò)去十年里全球范圍內(nèi)蜜蜂種群受到巨大威脅，包括來(lái)自自然環(huán)境、農(nóng)藥、寄生蟲(chóng)等因素[1]，蜜蜂珍惜種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用顯得尤為重要。超低溫冷凍蜜蜂生殖細(xì)胞技術(shù)不受地域、時(shí)間和蜂王壽命的限制，為蜜蜂種質(zhì)資源的保護(hù)開(kāi)辟了新途徑。

利用低溫冷凍技術(shù)保存生物資源由來(lái)已久，1776年，Sallanzani 利用雪冷凍馬的精子即是這方面最早的記載，1951年Stewart 用冷凍精液授精成功生下一頭牛犢[2]，這是世界第一例使用冷凍的精液授精并成功的案例，1964年Sawada 等首先利用甘油作為冷凍保護(hù)劑能夠?qū)⒚鄯渚豪鋬霰４娉晒3]。蜜蜂生殖細(xì)胞低溫冷凍保存技術(shù)發(fā)展到今天，根據(jù)冷凍過(guò)程中降溫速率不同可分為2 種：第一種是逐步降溫冷凍法（程序化冷凍法），第二種是玻璃化冷凍法。

一、冷凍機(jī)理

逐步降溫法采用分步降溫，先將保存材料慢速降溫至置核溫度，再放入液氮中保存。該法適用于單細(xì)胞、少細(xì)胞或含單一細(xì)胞類(lèi)型的生物材料，蜜蜂精液的冷凍保存多采用逐步降溫法。精液冷凍溫度降低過(guò)程，精子膜的完整性受到冰晶的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶、脂類(lèi)、各種離子釋放從而對(duì)精子造成損傷，這個(gè)時(shí)期的控制好低溫速率和投入液氮時(shí)精液溫度才能減小冰晶化對(duì)精子的損傷[4]。

玻璃化冷凍保存是指以非?？斓乃俾蕦⒈４娌牧辖禍刂烈旱耙旱獪囟纫韵聲r(shí)，出現(xiàn)非晶態(tài)的現(xiàn)象，這種非晶態(tài)被稱為玻璃態(tài)[5]。玻璃化冷凍方法是通過(guò)使用高濃度的冷凍保護(hù)劑使細(xì)胞脫水，0℃以上直接投入液氮中，使冷凍材料快速冷卻（15,000 ～30,000℃/min），液體粘度增加，當(dāng)達(dá)到臨界值時(shí)發(fā)生凝固化，避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。該法適用于些多細(xì)胞類(lèi)型的復(fù)雜生物材料，蜜蜂的胚胎多采用玻璃化冷凍法。

二、冷凍降溫方法

1.冷凍前的滲透化處理

蜜蜂的胚胎外層有保護(hù)結(jié)構(gòu)，保護(hù)劑無(wú)法滲入，所以采用玻璃化冷凍方法冷凍蜜蜂胚胎時(shí)必須要有去除保護(hù)結(jié)構(gòu)的滲透化處理，而冷凍蜜蜂精液則無(wú)需滲透化處理。對(duì)滲透起主要障礙的是蜜蜂的外卵殼和蠟質(zhì)層，外卵殼是有多種蛋白組成的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，蠟質(zhì)層主要由脂類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成。

目前滲透化處理的方法有機(jī)械去除法[6]、酶消化法[7]、次氯酸鈉和鏈烷烴類(lèi)并用法[8]。機(jī)械去除法者需很高的操作技巧，且易對(duì)胚胎造成致死性機(jī)械損傷，酶消除法處理時(shí)間較長(zhǎng)且成本較高。蜜蜂胚胎的滲透化處理采用次氯酸鈉和鏈烷烴類(lèi)并用法，用2%～5%的次氯酸鈉去除蜜蜂胚胎的外卵殼，再用庚烷或正己烷去除蠟質(zhì)。

2.加入冷凍保護(hù)劑

根據(jù)冷凍保護(hù)劑能否進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑。滲透性保護(hù)劑能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)細(xì)胞外溶液出現(xiàn)冰晶時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部使細(xì)胞內(nèi)溶液濃度升高，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，避免細(xì)胞過(guò)分脫水而皺縮同時(shí)減少細(xì)胞外高濃度電解質(zhì)的損傷。這類(lèi)冷凍保護(hù)劑主要包括甘油、二甲基亞砜、酰胺類(lèi)等。非滲透性保護(hù)劑難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，但可以結(jié)合細(xì)胞外水分子，使細(xì)胞外自由水含量降低，減少細(xì)胞內(nèi)外的冰晶的形成，從而減少對(duì)細(xì)胞的損傷的保護(hù)劑主要包括：卵黃、低密度脂蛋白等。

蜜蜂采用逐步降溫法冷凍精子是可以采用甘油、二甲亞砜、卵黃等滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑[9,10]，采用玻璃化冷凍胚胎時(shí)多采用乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜等滲透性保護(hù)劑[11,12]。

3.冷凍降溫步驟

低溫冷凍蜜蜂精子是采用逐步降溫法，降溫程序很關(guān)鍵。首先混合冷凍保護(hù)劑的精液在4℃環(huán)境中平衡數(shù)小時(shí)，根據(jù)本團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果，采用2 ～5℃/min速率下降從4℃降到40℃，最后把混合冷凍保護(hù)劑的精液直接投入到液氮中。

低溫冷凍蜜蜂胚胎是采用玻璃化冷凍法，有一步法和兩步法。一步降溫法即將用冷凍保護(hù)劑處理好的蜜蜂胚胎直接投入液氮中；兩步法即先在液氮蒸汽中停留幾秒至幾分鐘，再投入液氮中保存。

三、小結(jié)

低溫冷凍保存技術(shù)對(duì)于科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用的意義重大。它可以節(jié)約大量的人力、物力和財(cái)力，實(shí)現(xiàn)大批量生物活性材料的保存。逐步降溫法冷凍是精子冷凍的首先方法，冷凍玻璃化冷凍是胚胎冷凍的首選方法。目前針對(duì)蜜蜂精液的逐步降溫冷凍法研究較多，技術(shù)相對(duì)成熟，針對(duì)玻璃化冷凍蜜蜂胚胎研究較少，存在冷凍后胚胎孵化率低等問(wèn)題，總體來(lái)說(shuō)蜜蜂生殖細(xì)胞冷凍保存技術(shù)發(fā)展迄今幾十年，還有很多難關(guān)需要攻克[13,14]，蜜蜂生殖細(xì)胞低溫冷凍保存還有很長(zhǎng)的路要走。