劉佳悅，趙芳瑩，張 琰，張 樂，苑金利，陳吉龍，刁洪秀

[1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院) 福建省畜禽病原感染與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002 ；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193]

生物體中的RNA種類繁多，功能復(fù)雜，按照是否編碼蛋白質(zhì)可將其分為編碼RNA(Coding RNA)和非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)兩大類。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展和數(shù)據(jù)的共享，ncRNA的功能研究進(jìn)入了嶄新的階段，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在ncRNA 中占比最高，且功能最復(fù)雜，已成為國際生命科學(xué)領(lǐng)域的研究前沿。大量研究證實(shí)，lncRNA具有高度的組織特異性，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多重水平上對細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，不僅參與機(jī)體的生長發(fā)育和生理過程，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著重要角色，有望成為疾病治療的靶點(diǎn)[1-3]。

我國一直是乳制品需求大國。根據(jù)中國海關(guān)數(shù)據(jù)，2021年中國乳制品凈進(jìn)口385.2萬噸，同比增加18.1%，增速是2020年的2倍[4]，乳制品總需求快速增長。此外，中國乳制品消費(fèi)水平位于全球前三，奶牛養(yǎng)殖業(yè)在國內(nèi)具有很大的發(fā)展?jié)摿?，然而奶牛相關(guān)疾病的致病機(jī)理尚不明確，對于相關(guān)疾病的診斷主要依賴于發(fā)病后各項(xiàng)生理指標(biāo)的檢測，此時(shí)往往已經(jīng)造成了不可挽回的損失。因此，從基因水平上了解疾病的致病機(jī)理對于奶牛臨床疾病的防治至關(guān)重要。本文圍繞近年來lncRNA在奶牛臨床常見疾病領(lǐng)域的新進(jìn)展及研究策略進(jìn)行綜述，并展望了lncRNA在奶牛臨床常見疾病中的研究方向，以期為奶牛相關(guān)疾病的防治提供新思路。

1 lncRNA概述

哺乳動物基因組中很大一部分都被轉(zhuǎn)錄成mRNA，然而只有約1.5%的轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白，其余轉(zhuǎn)錄本均為ncRNA[5]。lncRNA曾經(jīng)被認(rèn)為是DNA轉(zhuǎn)錄異常產(chǎn)生的“垃圾RNA”，盡管缺乏編碼能力，但lncRNA與mRNA仍有許多共同的特征，包括：(1)具有組蛋白標(biāo)記的活性啟動子；(2)有5′-帽子和Poly-A尾巴；(3)多外顯子轉(zhuǎn)錄本的剪接[6]。與mRNA相比，許多l(xiāng)ncRNA的表達(dá)相對較低，進(jìn)化上的保守性較差，并且具有高度的細(xì)胞類型或組織特異性[7]。近年來，隨著新一代測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，大量研究表明,lncRNA可通過不同機(jī)制調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)、免疫細(xì)胞的分化和發(fā)育、炎癥性疾病和自身免疫性疾病等許多免疫過程[8]。lnc641可通過抑制JAK-STAT1途徑來促進(jìn)偽狂犬病毒的復(fù)制[9]。linc-satb1可通過上調(diào)免疫應(yīng)答基因和細(xì)胞免疫來破壞馬立克氏病毒感染的細(xì)胞[10]。檢測不同細(xì)胞或疾病狀態(tài)下的lncRNA表達(dá)量有助于理解其功能、揭示其作用機(jī)理，并可作為疾病診斷的潛在標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。

2 lncRNA與奶牛臨床常見疾病

2.1 奶牛乳腺炎 奶牛乳腺炎是臨床上奶牛常見疾病之一[11]，常常引起奶牛的產(chǎn)奶量降低，乳營養(yǎng)成分降低。盡管乳腺炎可治愈，但治愈后的奶牛產(chǎn)奶恢復(fù)緩慢，飼養(yǎng)成本增加，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。乳腺炎的病理機(jī)制至今尚未完全明確[12]，細(xì)菌感染、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、遺傳因素等均可引起奶牛乳腺炎，臨床上一般把大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為奶牛乳腺炎的重點(diǎn)防控病原菌[11]。奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上一般應(yīng)用廣譜抗生素進(jìn)行治療，但極易造成細(xì)菌耐藥，不利于奶牛業(yè)的發(fā)展[13]。

奶牛乳腺炎的基本癥狀是患畜局部炎癥，主要表現(xiàn)為乳汁異常，乳房不同程度的充血、增大、發(fā)硬、溫?zé)岷吞弁础４罅垦芯勘砻?，lncRNA可在炎癥中發(fā)揮重要作用，如lncRNA-NEAT1是炎癥體激活的常見介質(zhì)，可激活小鼠體內(nèi)NLRP3、NLRC4和AIM2等炎性小體，增強(qiáng)它們的組裝和隨后的Caspase-1前加工，并進(jìn)一步通過級聯(lián)效應(yīng)促進(jìn)小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)[14]；lnc-IL7R可減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，敲除lnc-IL7R會增加IL-6和IL-8等炎性因子的釋放[15]。與人和小鼠相比，奶牛相關(guān)的lncRNA研究還處于初始階段，因此在基因水平上揭示奶牛乳腺炎復(fù)雜的致病機(jī)理的報(bào)道應(yīng)運(yùn)而生。

H19是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)lncRNA，全長2.3 kb[16]。研究發(fā)現(xiàn)，H19在胃癌、乳腺癌、口腔癌和膽管癌等多種腫瘤中都發(fā)揮重要作用，涉及PI3K/Akt、Wnt/β-catenin、NF-κB、JAK/STAT等多條經(jīng)典致癌信號通路[17]。H19除了參與各種癌癥的病理過程，其作為一種正向炎癥調(diào)節(jié)因子，在NF-κB、p38/MAPK/mTOR、Toll樣受體和TNF-α等典型炎癥通路基因網(wǎng)絡(luò)具有重要的調(diào)節(jié)作用[18]。因此猜測H19在牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中也起到一定作用。將H19轉(zhuǎn)入牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)H19通過促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-6、CXCL2和CCL-5的表達(dá)，激活了NF-κB信號通路，從而影響LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[19]。除了H19，XIST也是調(diào)節(jié)奶牛乳腺炎的重要分子。XIST是由雌性哺乳動物中失活的X染色體轉(zhuǎn)錄而來的一個(gè)長度為17 kb的lncRNA，其與H19的作用機(jī)理相似，不僅在人類的多種癌癥中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并且與哺乳動物多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。馬夢汝[12]研究發(fā)現(xiàn)，XIST可與NF-κB/NLRP3信號通路相互作用，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

LncRNA在大動物方面的研究處于碎片化狀態(tài)，缺乏系統(tǒng)的研究，相關(guān)數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA的注釋不夠全面，普遍缺乏系統(tǒng)和統(tǒng)一注釋。西北農(nóng)林科技大學(xué)高明清研究團(tuán)隊(duì)通過高通量測序等探究奶牛乳腺炎方面未注釋的lncRNA，使用熱滅活的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌處理MAC-T建立乳腺炎細(xì)胞模型，并通過高通量測序分析獲得了正常細(xì)胞和乳腺炎模型細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜，鑒定出53個(gè)顯著差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的lncRNA，命名為lncRNA-TUB，并展開了一系列的研究；lncRNA-TUB參與了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和遷移，β-酪蛋白分泌，炎性應(yīng)答以及上皮細(xì)胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化等一系列生理病理過程，其可能作為免疫反應(yīng)中炎癥因子之間的重要元件發(fā)揮作用[11]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，新鑒定的lncRNA，即LRRC75A-AS 1可影響緊密連接蛋白(Claudin-1、Occludin和ZO-1)的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性及細(xì)菌侵襲和粘附能力，并通過NF-κB通路激活炎癥應(yīng)答[13]。與之相似，Mi等[20]通過高通量測序和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)PRANCR和TNK2-AS1這2個(gè)lncRNA廣泛參與金黃色葡萄球菌攻擊誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Tucker等[21]鑒定出NONBTAT027932.1和XR_003029725.1與奶牛乳腺炎免疫反應(yīng)相關(guān)的多個(gè)候選基因相關(guān)聯(lián)。PRANCR、TNK2-AS1、NONBTAT027932.1和XR_003029725.1可作為奶牛乳腺炎的疾病標(biāo)志物和治療干預(yù)位點(diǎn)，有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

綜上所述，lncRNA可以在基因水平揭示奶牛乳腺炎復(fù)雜的致病機(jī)制，為奶牛乳腺炎臨床早期預(yù)測提供潛在的標(biāo)志物和治療的有效靶點(diǎn)。

2.2 奶牛熱應(yīng)激 熱應(yīng)激會導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降和臨床疾病高發(fā)。以往對于奶牛熱應(yīng)激的研究多集中于微RNA(microRNA,miRNA)，如在熱應(yīng)激荷斯坦奶牛體內(nèi)高表達(dá)的bta-miR-19a、bta-miR-19b和bta-miR-1246等可以作為診斷奶牛熱應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志物[22]。Li等[23]通過RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激狀態(tài)下差異表達(dá)的miRNA與Wnt、TGF-β、MAPK、Notch和JAK-STAT等信號通路的調(diào)控有關(guān)。隨著高通量測序技術(shù)的推廣和研究的深入，研究視線開始聚焦于lncRNA。Li等[24]率先通過RNA-seq技術(shù)檢測并分析了熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激奶牛乳腺中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)lncRNA TCONS_00023306、lncRNA TCONS_00005946和lncRNA TCONS_00102876等可能作為miRNA的初級轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮作用，并提出了lncRNA和miRNA之間可能存在的深層次聯(lián)系，為進(jìn)一步研究lncRNA在奶牛中的作用機(jī)制提供了新思路。楊影[25]在LPS誘導(dǎo)的乳腺炎模型中應(yīng)用RNA-seq篩選并鑒定得到34個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，經(jīng)GO富集分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的lncRNA涉及核苷酸切除修復(fù)、NF-κB信號通路、細(xì)胞粘附和免疫應(yīng)答等多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程；在后續(xù)的lncRNA功能研究中發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA TCONS_00014079表達(dá)后能夠顯著降低TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)，提示lncRNA TCONS_00014079參與了炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。

綜上所述，lncRNA在奶牛熱應(yīng)激中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并參與了免疫反應(yīng)應(yīng)答，為熱應(yīng)激導(dǎo)致的乳房炎的診斷和防治提供了新思路。

2.3 奶牛子宮內(nèi)膜炎 奶牛子宮內(nèi)膜炎也是奶牛臨床常見疾病之一，會導(dǎo)致奶牛的屢配不孕、流產(chǎn)、胎間距上升和產(chǎn)奶量下降，致使奶牛的淘汰率上升，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對子宮內(nèi)膜炎的臨床診斷主要依賴于產(chǎn)后陰道黏液檢查，一旦檢測指標(biāo)異常便代表奶牛已發(fā)病。因此，將目光聚焦于高通量測序，篩選相關(guān)生物標(biāo)志有助于疾病的監(jiān)測、早期診斷和治療。以往對于奶牛子宮內(nèi)膜炎的研究大多聚焦在miRNA和差異基因，如Oladejo 等[26]發(fā)現(xiàn)miR-24-3p可通過靶向降低LGALS9基因的表達(dá)抑制促炎TLR4/NF-κB信號通路，從而調(diào)節(jié)奶牛的子宮內(nèi)膜炎。隨后他又發(fā)現(xiàn)miR-24-3p也可以通過靶向降低TRAF6基因來抑制NF-κB/MAPK信號通路，減輕奶牛子宮內(nèi)膜的炎癥[27]。miR-24-3p可能是子宮內(nèi)膜炎的重要治療靶點(diǎn)。Jiang等[28]通過miRNA芯片分析和相關(guān)試驗(yàn)得出，上調(diào)差異表達(dá)的miR-92b可通過激活PI3K/AKT/β-catenin途徑抑制促炎TLR4/NF-κB信號通路，這項(xiàng)研究為奶牛子宮內(nèi)膜炎提供了一種新的干預(yù)療法。Jiang等[29]還發(fā)現(xiàn)miR-30a可通過抑制MyD88/NOX2/ROS激活的NF-κB途徑發(fā)揮治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用。

隨著研究的深入，lncRNA在奶牛子宮內(nèi)膜炎中的作用逐漸突顯出來。李亞娟[30]對發(fā)病或未發(fā)病的奶牛子宮病料進(jìn)行高通量測序，揭示了奶牛子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜，共檢測到6 201個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，對其進(jìn)行功能富集發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的lncRNA參與先天性免疫調(diào)節(jié)、細(xì)菌粘附等生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)節(jié)，KEGG分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的lncRNA參與cAMP信號通路、PPAR信號通路等。而Sheybani等[31]應(yīng)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(WGCNA)方法對奶牛子宮內(nèi)膜炎中的mRNA、lncRNA和miRNA的互作進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)整合。這種方法以網(wǎng)絡(luò)中高度連接的基因(Hub)為中心，有利于剔除冗余數(shù)據(jù)，更精確鎖定后續(xù)研究目標(biāo)。如BTA-miR-449a和BTA-miR-449b這2個(gè)miRNA靶向Hub-Hub lncRNA ENSBTAG00000049936,已有研究證明miR-449a和miR-449b-3p在炎癥中起一定的調(diào)節(jié)作用[32,33]。因此，lncRNA ENSBTAG00000049936可能是導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎進(jìn)展的潛在基因，可被視為奶牛子宮內(nèi)膜炎的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，ncRNA在奶牛子宮內(nèi)膜炎領(lǐng)域的研究以miRNA為主，lncRNA的研究相對較少。針對奶牛乳腺炎相關(guān)的lncRNA進(jìn)行研究既可以填補(bǔ)該領(lǐng)域的研究空缺，又有助于進(jìn)一步闡明奶牛子宮內(nèi)膜炎的潛在機(jī)制，是有價(jià)值的研究路線。

2.4 奶牛副結(jié)核 奶牛副結(jié)核(Johne's disease,JD)是由禽副結(jié)核分枝桿菌亞種(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis,MAP)引起的反芻動物的一種慢性肉芽腫性腸道感染副結(jié)核病，是一種慢性消耗性疾病，會導(dǎo)致病牛體重減輕、腹瀉和產(chǎn)奶量逐漸下降，最終導(dǎo)致死亡。JD是一種多因素感染病，病牛在達(dá)到臨床階段之前不會出現(xiàn)任何癥狀，只有在臨床階段才能檢測到這種感染[34]，并且其病原學(xué)和潛在的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此，識別與這種感染相關(guān)的關(guān)鍵基因和途徑可能是預(yù)防臨床感染發(fā)病的有效途徑。

Gupta等[35]分析了來自MAP感染和未感染的原代牛巨噬細(xì)胞的高通量RNA-Seq數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在JD感染中差異表達(dá)的lncRNA可以調(diào)控TNIP3、TNFAIP3和NF-κB2等基因的表達(dá)，影響TNF、NF-κB和TLR等與免疫反應(yīng)相關(guān)的信號通路；在JD感染組中隨機(jī)選擇3個(gè)lncRNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法分析其表達(dá)，結(jié)果顯示，XLOC_000633表達(dá)極顯著上調(diào)，XLOC_030080和XLOC_029370表達(dá)顯著上調(diào)，表明這3個(gè)lncRNA可以作為檢測受感染動物的潛在生物標(biāo)志物，但還有待于進(jìn)一步研究。以往對JD的研究一般使用體外感染的奶牛巨噬細(xì)胞鑒定lncRNA，但外源血清會影響巨噬細(xì)胞的極化，導(dǎo)致測序結(jié)果不準(zhǔn)確，故Marete等[36]應(yīng)用RNA-seq技術(shù)檢測自然狀態(tài)下JD陽性奶牛巨噬細(xì)胞中的lncRNA，發(fā)現(xiàn)了605個(gè)差異表達(dá)的新lncRNA，其可以調(diào)控包括CCDC174、ERI1、FZD1、TWSG1、ZBTB38、ZNF814和ZSCAN4共7個(gè)基因的表達(dá)，影響奶牛自身的免疫調(diào)節(jié)和MAP的感染。Heidari等[37]從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載JD相關(guān)數(shù)據(jù)，使用WGCNA方法構(gòu)建了完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以更全面地了解MAP感染的分子機(jī)制，該研究鑒定了hub和hub-hub基因以及未保存的模塊中的TF和lncRNA后，構(gòu)建了lncRNA-mRNA-TF整合網(wǎng)絡(luò)，鑒定出47個(gè)新的lncRNA，其中有21個(gè)與免疫系統(tǒng)和MAP感染相關(guān)；其中被鑒定為hub-hub基因的lncRNA ENSBTAG00000052980、lncRNA ENSBTAG00000049459、lncRNA ENSBTAG00000049459、lncRNA ENSBTAG00000053153和lncRNA ENSBTAG00000050877可能成為診斷MAP感染的生物標(biāo)志物。

3 展望

近年來隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，lncRNA已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。哺乳動物的lncRNA除了與機(jī)體的炎癥和獲得性免疫有關(guān)外，還參與病毒感染后的天然免疫調(diào)節(jié)。與人和鼠的基因組相比，家畜的lncRNA的基因組注釋仍然非常稀少，隨著研究的不斷深入，會有更多新的lncRNA轉(zhuǎn)錄本，但lncRNA調(diào)控的復(fù)雜性以及研究的相對困難性，導(dǎo)致對lncRNA生物學(xué)功能的認(rèn)識和研究不夠深入全面，尤其是在奶牛臨床疾病方面，大多數(shù)的研究僅停留在尋找具有特殊作用的lncRNA或作為某種疾病的潛在標(biāo)志物，尚缺乏系統(tǒng)全面的研究。近年出現(xiàn)了一種基于WGCNA網(wǎng)絡(luò)的互作網(wǎng)絡(luò)整合方法。盡管WGCNA網(wǎng)絡(luò)對mRNA、lncRNA和miRNA的互作整合有助于理解疾病發(fā)生中的功能網(wǎng)絡(luò)通路，但這種研究方法只考慮了高度關(guān)聯(lián)的基因(中樞和中樞-中樞)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵部分，缺乏實(shí)際試驗(yàn)的驗(yàn)證。相信隨著新一代測序技術(shù)的不斷發(fā)展和相關(guān)研究的不斷深入，可以在這2種類型的研究方法中找到一個(gè)平衡點(diǎn)，在精準(zhǔn)把控疾病的生物學(xué)標(biāo)志基礎(chǔ)上，全面深入理解奶牛臨床常見疾病的病原學(xué)和潛在的分子機(jī)制，為我國畜牧獸醫(yī)事業(yè)的發(fā)展提供保障。