張蜀艷，李奕霏，焦乾辰，李春梅，鄒立扣

1成都工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，成都 610051；2西安交通大學(xué)，西安 710048；3西北農(nóng)林科技大學(xué)，西安 712100；4四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 611130

臭牡丹（Clerodendrum bungei Steud.）為馬鞭草科大青屬的植物，外形酷似牡丹，有惡臭味，故名。喜陽光充足和濕潤環(huán)境，適應(yīng)性強(qiáng)，生長范圍廣?！侗静菥V目拾遺》［1］記載：“洗痔瘡治疔赤水元珠：蒼耳、臭牡丹各一大握，搗爛，新汲水調(diào)服，瀉下黑水即愈。 一切癰疽淳安陳老醫(yī)云：用臭牡丹枝葉搗爛，罨之立消?！碧崾境裟档た捎糜谥委煱b疽、痔瘡等，具有解痙鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗炎、抗?jié)儭⒖咕敖鉄岬榷喾N藥理作用［2］，民間采取水煮、酒精浸泡等方式后外敷用以治療皮膚潰爛。前期研究表明，臭牡丹提取物可提高小鼠免疫功能，對6種常見病菌（酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、白色念珠菌）有較明顯的滅活作用［2］，并可改善免疫低下小鼠的免疫功能［3-4］。

臭牡丹在中藥治療皮膚潰爛進(jìn)程中始終占有重要位置，且已有上千年歷史?，F(xiàn)代研究表明臭牡丹對潰瘍性痔瘡有較好的治療作用［4］，但其科學(xué)驗(yàn)證一直較為匱乏。為了弘揚(yáng)民族文化，促進(jìn)中藥的古法今用，本研究進(jìn)行了動(dòng)物藥理學(xué)和藥效學(xué)研究，驗(yàn)證臭牡丹的療效，以期為開發(fā)臭牡丹提取物凝膠劑用于潰瘍性痔瘡的補(bǔ)充治療和研究治療痔瘡的中藥新藥制劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［5-6］

成年SPF級KM小鼠共50 只（雌雄各半），8周齡，體重20～24g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK（川）2015-030， SYXK（川）2015-196。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號：202001001），按照3R原則給予試驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑

Nexera LC-40高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV1900紫外可見光檢測儀（日本島津公司）；微孔濾膜濾過器和針式過濾器（天津市精拓儀器科技有限公司）；AUV120型電子天平（日本島津公司）；PHS-3C臺(tái)式酸度計(jì)（山西信偉慧誠科技有限公司）；NDJ-1ZH8890型六速旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)（北京中慧天誠科技有限公司）；79HW-1型恒溫磁力攪拌器 （中國浙江樂成電器廠）；VGT17-PS-20T超聲波清洗器 （北京海富達(dá)科技有限公司）；DHG-9030/DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京海天友誠科技有限公司）；半透膜擴(kuò)散池（自制）；RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司）；ZLGJ-18壓蓋多岐管型凍干機(jī)（華辰儀器有限公司）；BKQ-Z301高壓蒸汽滅菌器（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；GZP-250B光照培養(yǎng)箱（紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司）；GDW/GDJS-100高低溫（交變）試驗(yàn)箱（上海蘇盈試驗(yàn)儀器有限公司）；TDL-5-A低速大容量離心機(jī)（愛來寶醫(yī)療科技有限公司）。

臭牡丹提取物對照品（本實(shí)驗(yàn)室提供）；馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏（中國馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42021920）；卡波姆940（武漢德晟生化科技有限公司，批號：1806005，99.9%醫(yī)藥級）；1, 2-丙二醇（河南欽榮化工產(chǎn)品有限公司，批號：1910003，純度99%）；無水甲醇（中國天津市首世化工有限公司，批號：1811006，純度100%）；氫氧化鈉（中國天津市首世化工有限公司，批號：1905002）；鹽酸（中國濟(jì)南春祿福商貿(mào)有限公司，批號：1705002）；冰醋酸（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號：1705004，純度99%）。

臭牡丹原植株采集地為四川省成都市，采集時(shí)間為2018年7～8月，由青山利康藥業(yè)有限公司執(zhí)業(yè)藥師劉小英鑒定為臭牡丹。

1.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝［7-8］

采集7～8月的新鮮臭牡丹植物全株（包括葉、莖、根），洗凈，加水10L，煎煮1h后過濾，再重復(fù)煎煮2次，合并3次藥液。采用75%乙醇沉淀，超真空蒸餾后再進(jìn)一步冷凍干燥得到凍干品，經(jīng)過Sevage法除蛋白、透析后得到相對分子質(zhì)量在8000u以上的物質(zhì)，即為主藥。稱取雙蒸水50g于燒杯中，加入適量卡波姆940，溶脹24h，加入10g主藥混勻，然后加入適量丙二醇、無水乙醇，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，補(bǔ)充雙蒸水至100g，裝罐滅菌處理后得到樣品，即為臭牡丹提取物凝膠劑（下文簡稱CBS）。其中，以卡波姆940、丙二醇、無水乙醇為因素，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化CBS的制備工藝，因素水平見表1。

空白基質(zhì)：稱取3份100g雙蒸水，分別加入1.2、1.5、1.8g卡波姆940，溶脹24h，得到不同濃度的空白基質(zhì)。

1.4 質(zhì)量評價(jià)［9］

外觀：黃褐色半固體，稠度適宜，涂展性好，質(zhì)地均勻細(xì)膩，吸收快。

pH：取CBS樣品溶解到適量雙蒸水中，pH為7.2。

強(qiáng)光照射試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)：取CBS樣品放置于光照培養(yǎng)箱中，以4500LX培養(yǎng)15天；另取CBS樣品10g，4000r/min離心45min。均無滲水分層現(xiàn)象。

高溫高濕耐寒試驗(yàn)：取適量CBS樣品于瓶內(nèi)密閉，置于藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，設(shè)置濕度為75%，溫度為55℃，放置24h；另取CBS樣品置于冰箱（0℃）中放置24h。均無分層和霉變現(xiàn)象。

1.5 動(dòng)物藥效學(xué)研究［10-11］

將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、基質(zhì)組、對照組與樣品組，每組各10只，且雌雄各半。除空白組外，其余4組均采用冰醋酸（acetic acid，HAC）建立潰瘍性痔瘡小鼠模型：在每只小鼠肛門內(nèi)推入HAC 0.2ml，首劑量為5%，保持1min后用棉簽沾出，連續(xù)給藥3天。

動(dòng)物模型建立后，各組給藥方案見表2。按表2劑量在小鼠肛門內(nèi)分別推入卡波姆940、馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏（MYL）、CBS，保持1min后用棉簽沾出，連續(xù)給藥7天后處死小鼠，在距肛門相同距離（1cm） 處取同一部位組織（2mm×10mm），采用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（4μm）后進(jìn)行HE染色，盲法閱片，觀察其組織學(xué)損傷程度及修復(fù)情況。

1.6 體外釋藥性研究［12-13］

1.6.1 色譜條件

SunFire C18色譜柱；流動(dòng)相為30%甲醇；流速為1ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為510nm；保留時(shí)間為30min；進(jìn)樣體積為10μl。

檢測波長的選擇。取臭牡丹提取物適量，加30%甲醇振搖溶解，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200～600nm波長全掃描，最大吸收波長為507nm及512nm，經(jīng)預(yù)試并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［8］，選擇510nm為檢測波長。

1.6.2 測定方法

用豬小腸作為半透膜制作成擴(kuò)散池模擬肛門環(huán)境，半透膜與供應(yīng)室之間放置高0.50cm、直徑3.6cm、內(nèi)圓面積為10.1736cm2的環(huán)形塑料圈，透析膜置于供應(yīng)室與接受室之間（相對分子質(zhì)量＜14000的物質(zhì)CBS可通過該膜微孔），進(jìn)行釋藥性測定。在37.5℃恒溫水浴中加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子勻速攪拌（30r/min），準(zhǔn)確稱量CBS 3.0g緊密填放于供應(yīng)室中，接受室中加入40ml 37.5℃的蒸餾水，分別于1、2、3、4、6 h取出接受池中溶液0.6ml（立即補(bǔ)充等體積37.5℃蒸餾水），并用30%的甲醇液稀釋至2ml，用0.45μm微孔濾膜濾過，作為待測液。另準(zhǔn)確稱取臭牡丹提取物對照品0.1g，用100ml 30%的甲醇溶液溶解定容，作為對照品溶液。分別取已稀釋的待測溶液和對照品溶液10μl，按“1.6.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，根據(jù)結(jié)果計(jì)算單位面積累積藥物釋放量。

采用隨行標(biāo)準(zhǔn)單點(diǎn)比較法計(jì)算供試品中臭牡丹提取物的含量，再按照下式計(jì)算出單位面積累積滲透量：

式中，Q為第n次取樣時(shí)的單位面積累積滲透量；V為接受池的體積；Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度（μg/ml）；Vi為第i個(gè)取樣溶液的體積（0.6ml）；Ci為第i（i≤n-1）個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度（μg/ml）；A為擴(kuò)散滲透面積（cm2）。以Q值為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其斜率即為透皮速率常數(shù) J [μg /（cm2·h ）]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法［14］

采用SPSS Statistics 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用±s表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選制備工藝

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3的極差分析結(jié)果可知，RB＞RA＞RC，提示3個(gè)因素對收得率的影響大小依次為：丙二醇（B）＞卡波姆940（A）＞無水乙醇（C）。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到最佳處方方案為B1A3C3，即各成份配比為丙二醇（0.0ml）、卡波姆 940（1.8g）、無水乙醇（10.0ml）時(shí)，該處方外觀性狀和黏度均符合標(biāo)準(zhǔn)，且成本較低，故選擇該處方做進(jìn)一步研究。

2.2 質(zhì)量評價(jià)

CBS的外觀為黃褐色半固體，稠度適宜，涂展性好，質(zhì)地均勻細(xì)膩，吸收快；pH為7.2，適合肛門特殊環(huán)境使用；經(jīng)強(qiáng)光照射試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)及高溫高濕耐寒試驗(yàn)，均無滲水分層現(xiàn)象和霉變現(xiàn)象。表明本處方物理化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定。

2.3 動(dòng)物藥效學(xué)研究［15-16］

動(dòng)物藥效學(xué)研究結(jié)果表明，基質(zhì)組和模型組有大量炎性滲出物，黏膜上形成較多的潰瘍灶，組織間隙明顯水腫，腺體結(jié)構(gòu)模糊；樣品組和對照組無滲出物，未見潰瘍和膿灶，黏膜、黏膜下層及肌漿層均完整，無明顯病變，結(jié)果見表4和圖1。

2.4 體外釋藥性研究［17-18］

按照“1.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。由于肛門處的體液環(huán)境中性略偏堿性，為了考察CBS的釋藥機(jī)制，僅選擇雙蒸水（pH = 7.0）為溶出介質(zhì)，盡量避免其他物質(zhì)的干擾，使結(jié)果更有準(zhǔn)確性。在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，測定在相同工藝條件下制備的3批CBS不同時(shí)間的累積藥物釋放量并探索其釋藥機(jī)制。結(jié)果顯示，3批CBS的釋藥動(dòng)力學(xué)過程符合Higuchi釋藥模型，提示其釋藥曲線呈線性關(guān)系，藥物釋放以擴(kuò)散方式為主，累積藥物釋放量結(jié)果見表5，累積釋藥曲線見圖2。

3 討論與結(jié)論

在前期研究基礎(chǔ)上，本研究確定卡波姆940為凝膠劑基質(zhì)；為減少對肛門皮膚的刺激、增加基質(zhì)黏合度，確定處方pH為7.2。保濕劑丙二醇對處方的影響較大，且肛門無保濕要求，結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果，故處方取消丙二醇。通過質(zhì)量評價(jià)、動(dòng)物藥效學(xué)和體外釋藥性研究確定處方具有較好的外觀和黏度、涂敷分散、皮膚耦合性好、藥物滯留時(shí)間長、藥效持久、耐熱耐寒、性質(zhì)穩(wěn)定、釋藥快且經(jīng)濟(jì)合理，儲(chǔ)藏要求可相對寬松。

研究結(jié)果顯示，模型組小鼠于模型建立3天后出現(xiàn)稀便及血便，并伴有明顯體重下降，表明潰瘍性痔瘡小鼠模型成功建立。對照組和樣品組連續(xù)治療7天，發(fā)現(xiàn)小鼠體重下降幅度逐漸減緩并轉(zhuǎn)而呈上升趨勢，且大便性狀好轉(zhuǎn)。組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，基質(zhì)組和模型組有大量炎性滲出物，黏膜上形成較多的潰瘍灶，組織間隙明顯水腫，腺體結(jié)構(gòu)模糊；樣品組和對照組無滲出物，未見潰瘍和膿灶，黏膜下層及肌漿層均完整，無明顯病變，提示CBS和MYL對小鼠的肛腸潰瘍具有一定的抗?jié)兒托迯?fù)作用，可有效促進(jìn)傷口的愈合、細(xì)胞的生長及受損細(xì)胞的修復(fù)，且二者對HAC誘導(dǎo)的小鼠潰瘍和膿灶有相似的療效?！侗静菥V目拾遺》記載臭牡丹可用于治療癰疽、痔瘡等；《福建藥物志》（第二卷·修訂本）［19］記載臭牡丹可“活血散瘀，拔毒消癰”。本研究驗(yàn)證了臭牡丹對于潰瘍性痔瘡有較好療效，但仍存在不足，主藥單體成份還需要進(jìn)一步提純分析，確定其分子結(jié)構(gòu)，為精確處方提供依據(jù)。

體外釋藥性研究考察發(fā)現(xiàn)，累積藥物釋放量與時(shí)間呈線性關(guān)系，表明該制劑有良好的釋藥能力，但總體來說藥物釋放的時(shí)間較長、釋放量不夠多。為避免刺激肛門、促進(jìn)藥物在弱堿性肛門環(huán)境中的釋放，建議在用NaOH調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)使 pH=7.2［20］。

綜上所述，在弱堿性條件下，CBS能快速到達(dá)痔瘡的病灶靶點(diǎn)，其療效與臨床常用、具有確切療效的MYL基本持平，建議后期對臭牡丹有效成份進(jìn)一步提純分析，優(yōu)化提純和分析方法，同時(shí)進(jìn)行毒理試驗(yàn)，為臭牡丹相關(guān)制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為古方今用提供思路。