黑木耳黑色素對缺鐵性貧血小鼠生理指標(biāo)及腸道菌群的影響

楚福英，王 淼，李元敬，諸 琳，雷 虹,*，馮 磊*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500，2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；3.華南師范大學(xué)材料與新能源學(xué)院，廣東 汕尾 516600；4.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院科研處，黑龍江 哈爾濱 150081）

機體鐵元素攝入量不足或流失過多以及其他造血營養(yǎng)物質(zhì)的代謝不平衡是導(dǎo)致缺鐵性貧血（irondeficiency anemia，IDA）的主要原因[1-2]。IDA是世界上最常見的營養(yǎng)缺乏癥，它會影響人體的多個器官臟器，如肝臟、脾臟、結(jié)腸等，損害人體生理功能，嚴重影響人們的健康[3-4]?？诜a鐵藥物是目前治療IDA的主要方法[5-6]。然而，大多數(shù)口服補鐵藥物副作用大，可能造成腸道損傷，進而影響胃腸道鐵元素的吸收[1,7]。因此，尋找更加安全有效的IDA治療新方法至關(guān)重要。

黑木耳（Auricularia auricula）是我國分布廣泛且具有獨特的營養(yǎng)價值和保健功能的食用菌[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為黑木耳具有養(yǎng)氣補血，治療氣血虧虛的功效，是優(yōu)質(zhì)的天然補血品，可以促進機體造血。黑木耳含有多種生物活性化合物，黑色素是其中的主要生物活性成分，其安全性高[9]，且具有防輻射、抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫力等作用[10-11]，在食品加工、化妝品開發(fā)、疾病的預(yù)防和治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。Wang Furong[13]和Lei[14]等的研究表明魷魚墨黑色素鐵可作為有效的潛在補鐵劑來治療IDA。

腸道菌群及其產(chǎn)物對宿主的生長發(fā)育不可或缺，并且可以對腸道健康產(chǎn)生多方面的影響[15-16]，因為腸道菌群不僅能夠調(diào)節(jié)胃腸道中的宿主生理過程，還可調(diào)節(jié)腸道外器官，如肝臟、大腦和免疫系統(tǒng)[17-19]。研究表明，IDA會使腸道菌群發(fā)生紊亂，并且低鐵條件被認為是導(dǎo)致微生物組成的重大變化的原因[20]。因此，對IDA動物腸道菌群的深入研究可能是治療IDA的關(guān)鍵。

本研究通過構(gòu)建IDA小鼠模型，對模型組小鼠進行黑木耳黑色素灌胃實驗，記錄各組小鼠的體質(zhì)量變化，采用血細胞自動分析儀分析小鼠的血常規(guī)指標(biāo)，通過高通量測序技術(shù)分析小鼠糞便微生物組成，探究黑木耳黑色素對IDA小鼠生理和腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

45 只SPF級24 日齡雄性昆明小鼠（體質(zhì)量（14.0±1.7）g）購買自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2019-001，實驗動物使用許可證號為：SYXK（黑）2018-003。

黑木耳（菌種保藏編號為CCTCC-HDXZ-1） 東寧黑木耳產(chǎn)業(yè)基地；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biologiclp粉碎機 飛利浦（珠海）有限公司；W201數(shù)控恒溫水浴鍋 上海申勝生物科技有限公司；LD15-2A高速離心機 北京醫(yī)用離新機廠；AB104-N分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101-3A電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市通利信達儀器廠；1800i血細胞自動分析儀 日本Sysmex XT公司；N50 NanoDrop超微量分光光度計 廣州市康玨貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳黑色素的制備

參考文獻[21]并稍作修改，從黑木耳中提取、純化黑色素。將烘干后的黑木耳經(jīng)粉碎機粉碎，過80 目篩。取25 g黑木耳粉末樣品，加入500 mL 3 mol/L鹽酸和1 L蒸餾水，70 ℃下水浴浸提1.0～1.5 h，在浸提液中加入質(zhì)量分數(shù)38.46% NaOH溶液直到有絮狀沉淀生成，充分溶解攪拌后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入12 mol/L鹽酸至有黑色絮狀物出現(xiàn)，4 000 r/min離心20 min，取沉淀，重復(fù)離心（4 000 r/min、20 min）2～3 次得到黑色素粗品。將黑色素粗品純化[21]后進行冷凍干燥，得到黑木耳黑色素樣品。

1.3.2 小鼠建模與分組

參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊》[22]中的方法，選取45 只24 日齡昆明種雄性小鼠，適應(yīng)性飼喂1 周后，隨機分為2 組：對照組（15 只小鼠）、模型組（30 只小鼠）。模型組小鼠飼喂低鐵飼料、飲用超純水進行造模，造模2 周后小鼠尾部采血，采用血細胞自動分析儀測定小鼠血液中的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）質(zhì)量濃度、紅細胞（red blood cell，RBC）計數(shù)、紅細胞比容（hematocrit，HCT）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV），實驗小鼠Hb質(zhì)量濃度不高于100 g/L即為造模成功。隨后將模型組小鼠隨機平均分為2 組：IDA組、IDA-M組（黑木耳黑色素治療組），每組15 只。IDA-M組灌胃200 mg/（kgmb·d）黑木耳黑色素，灌胃體積0.2 mL，IDA組灌胃0.2 mL超純水，兩組均采用低鐵飼料繼續(xù)喂養(yǎng)3 周，期間自由飲用超純水。造模和干預(yù)期間，對照組始終飼喂正常飼料并自由飲用去離子水。為避免外源鐵污染，實驗采用塑料籠體和非鐵質(zhì)籠蓋。自實驗開始，每周稱量小鼠體質(zhì)量。

1.3.3 樣本采集

最后1 次灌胃后，小鼠禁食不禁水24 h，收集0.5 g小鼠糞便立即裝入2 mL凍存管，-80 ℃保存，用于后續(xù)小鼠糞便微生物高通量測序分析。實驗結(jié)束時，采用眼球取血的方法收集小鼠血液，每只小鼠收集40 μL血液，加入360 μL肝素鈉生理鹽水溶液（50 μL肝素鈉注射液（2 mL 1.25萬單位）用生理鹽水定容至20 mL）用于血常規(guī)檢測。

1.3.4 血常規(guī)指標(biāo)的測定

采用血細胞自動分析儀檢測各組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)（Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)、白細胞（white blood cell，WBC）計數(shù)、血小板（platelet，PLT）計數(shù)、HCT、MCV）。

1.3.5 小鼠腸道菌群高通量測序

取0.2 g小鼠糞便樣本，使用小鼠糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，然后使用NanoDrop超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，將合格的DNA樣本保存于凍存管，經(jīng)液氮速凍后置于干冰中寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。采用Illumina Miseq PE250 /PE300進行16S rDNA測序，比較分析各組糞便菌群門和屬水平的組成，對小鼠腸道菌群進行Alpha多樣性指數(shù)分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組樣品重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行處理，采用Origin 2019軟件作圖，采用SPSS 23.0軟件進行t檢驗，比較組間顯著性差異，P＜0.05和P＜0.01分別代表差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 IDA小鼠模型的建立

飼喂2 周低鐵飼料進行IDA造模，造模結(jié)果如表1所示，血常規(guī)結(jié)果表明模型組小鼠的Hb質(zhì)量濃度降低至（94.30±3.84）g/L。同時，與對照組相比，模型組的RBC計數(shù)、HCT分別極顯著下降了39.1%、33.8%（P＜0.01），MCV顯著下降了9.8%（P＜0.05）。參照《常用醫(yī)藥研究動物模型》[23]中規(guī)定的IDA判斷依據(jù)：Hb質(zhì)量濃度不高于100 g/L、RBC計數(shù)下降和MCV減小，本研究模型組小鼠表現(xiàn)出了明顯的貧血癥狀，表明本實驗造模成功。

表1 缺鐵飲食造模結(jié)束時各組小鼠外周血液指標(biāo)結(jié)果Table 1 Routine peripheral blood indices of mice fed normal or lowiron diet for two weeks

2.2 黑木耳黑色素對IDA小鼠體質(zhì)量的影響

給小鼠飼喂低鐵飼料，飲用超純水2 周后，小鼠開始出現(xiàn)萎蔫不振、運動量減少、生長減緩等現(xiàn)象，灌胃黑木耳黑色素可顯著改善這一現(xiàn)象。如圖1所示，造模結(jié)束時模型組小鼠體質(zhì)量顯著低于對照組（P＜0.05）；黑色素干預(yù)結(jié)束時，IDA-M組的體質(zhì)量極顯著高于IDA組（P＜0.01），而與對照組無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，黑木耳黑色素可以使IDA小鼠體質(zhì)量恢復(fù)正常水平，推測黑木耳色素干預(yù)改善了小鼠的消化功能。

圖1 黑木耳黑色素對IDA小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of A.auricula melanin on body mass of IDA mice

2.3 黑木耳黑色素對IDA小鼠血液指標(biāo)的影響

IDA可以通過機體血象指標(biāo)的改變確定，其中主要以Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)最能反映機體是否處于IDA及其所處程度[24-25]；另外，MCV和HCT也是診斷貧血的重要指標(biāo)[26]；WBC計數(shù)可以反映機體的免疫功能[27]；PLT可以反映機體的凝血能力[28]，以上指標(biāo)均具有較高的臨床診斷評估價值。各組小鼠的血常規(guī)結(jié)果如圖2所示。灌胃黑木耳黑色素3 周后，IDA-M組小鼠的Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)、HCT、MCV相對于IDA組分別極顯著或顯著升高了93.06%（P＜0.01）、72.28%（P＜0.01）、65.39%（P＜0.01）、18.52%（P＜0.05），與對照組相應(yīng)指標(biāo)的水平相近，說明黑木耳黑色素可使IDA小鼠貧血指標(biāo)恢復(fù)正常，從而改善IDA；IDA-M組小鼠的WBC計數(shù)相對于IDA組顯著升高了68.83%（P＜0.01），說明黑木耳黑色素可使IDA小鼠WBC數(shù)目恢復(fù)至正常水平，提高IDA小鼠的免疫力，降低結(jié)腸炎癥發(fā)生的概率；IDA-M組小鼠的PLT計數(shù)相對于IDA組顯著降低了32.16%（P＜0.05），說明黑木耳黑色素可有效減少IDA小鼠PLT數(shù)目，從而降低血液凝固帶來的風(fēng)險。

圖2 黑木耳黑色素對IDA小鼠血液指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of A.auricula melanin on blood indices of IDA mice

2.4 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群多樣性的影響

宿主與腸道微生物之間存在動態(tài)平衡，結(jié)腸組織損傷所引起的屏障功能喪失往往伴隨著腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，課題組前期研究表明IDA小鼠存在腸道損傷[29]，而IDA對腸道菌群的影響鮮有研究。為進一步揭示腸道菌群與IDA的關(guān)系，本研究通過高通量測序分析腸道菌群多樣性的變化。如圖3所示，IDA組小鼠的Shannon、Chao1和Ace指數(shù)均極顯著低于對照組和IDA-M組（P＜0.01）；IDA-M組小鼠的上述指數(shù)均恢復(fù)至正常水平；此外，低鐵飲食可導(dǎo)致Simpson指數(shù)極顯著升高（P＜0.01），補充黑木耳黑色素極顯著緩解了IDA小鼠腸道菌群Simpson指數(shù)變化（P＜0.01）。表明IDA會導(dǎo)致小鼠腸道菌群多樣性降低，補充黑木耳黑色素可顯著改善并恢復(fù)IDA小鼠腸道菌群多樣性。

圖3 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響Fig.3 Effect of A.auricula melanin on alpha-diversity indices of intestinal flora in IDA mice

為進一步確認黑木耳黑色素改善IDA小鼠腸道菌群失衡的現(xiàn)象，利用PCA和Venn圖分析黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群的修復(fù)作用。如圖4A所示，PCA結(jié)果表明對照組和IDA-M組位置相近，與IDA組顯著分開，說明對照組和IDA-M組的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似度較高，且均與IDA組的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，表明黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)具有改善作用。Venn圖可以用來統(tǒng)計樣本中共有和獨有的分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）的數(shù)目，直觀展現(xiàn)出不同環(huán)境樣品中OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況[30]。由圖4B可知，3 組樣本的共有OTU數(shù)目有130 種，IDA組獨有OTU數(shù)目最少，僅174 種，灌胃黑木耳黑色素后獨有OTU數(shù)目提升至233 種。由此可見，黑木耳黑色素可以增加IDA小鼠腸道菌群的獨有OTU數(shù)目，增加腸道菌群多樣性。

圖4 各組小鼠腸道菌群PCA圖（A）和Venn圖（B）Fig.4 Principal component analysis (PCA) plot (A) and Venn diagram (B)of gut microbiome in mice from three groups

2.5 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群群落組成的影響

IDA是常見的鐵營養(yǎng)缺乏性疾病，是世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題之一。研究表明，嬰幼兒IDA與腸道菌群有關(guān)[20]，而且腸道菌群可通過代謝產(chǎn)物增加鐵蛋白的表達，以抑制宿主的腸道鐵吸收[31]，表明腸道菌群或可作為鐵失調(diào)的治療靶點。因此IDA的防治需要更加重視腸道菌群的作用。黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道菌群組成的影響如圖5、6所示。小鼠腸道菌群中門水平的優(yōu)勢菌門分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria），占小鼠腸道菌群的99%以上（圖5A）。當(dāng)補充黑木耳黑色素后，IDA-M組的Firmicutes和Verrucomicrobia相對豐度相對于IDA組分別明顯增加了29.72%和2 794.12%，Bacteroidetes和Proteobacteria分別明顯降低了20.80%和13.03%，與對照組相比已無明顯差異。Pereira等[32]研究也表明，Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria是補充納米鐵（III）或硫酸亞鐵前后IDA小鼠糞便微生物群中的主要菌群。Muleviciene等[20]發(fā)現(xiàn)IDA患者會腸道中Bacteroidetes和Proteobacteria富集，Verrucomicrobia相對豐度降低，與本研究結(jié)果一致。說明黑木耳黑色素可以緩解由IDA引起的主要優(yōu)勢菌門的變化，并使之恢復(fù)至正常水平。

圖5 各組小鼠糞便樣本中主要門和屬水平菌群組成Fig.5 Composition of intestinal flora in three groups of mice at the phyla and genus levels

屬水平上相對豐度前10 位菌屬為小鼠腸道微生物優(yōu)勢菌屬（圖5B）。由圖6可知，與對照組相比，IDA組小鼠腸道中的Akkermansia、Alistipes、未分類的屬、Falsiporphyromonas、Coprobacter相對豐度分別極顯著或高度顯著降低了97.43%（P＜0.001）、54.01%（P＜0.01）、59.13%（P＜0.01）、91.32%（P＜0.001）、98.26%（P＜0.01）；條件致病菌Parabacteroides相對豐度極顯著增加了433.12%（P＜0.01）。補充黑木耳黑色素后，與IDA組相比，IDA-M組小鼠腸道中的Akkermansia、Alistipes、未分類的屬、Falsiporphyromonas、Coprobacter相對豐度分別顯著增加了3 080.88%（P＜0.001）、216.61%（P＜0.001）、104.36%（P＜0.05）、521.21%（P＜0.05）、6 520.00%（P＜0.01）；Parabacteroides相對豐度極顯著降低了89.57%（P＜0.01）。最新的研究表明乳桿菌屬可感知腸道中的鐵水平，并抑制宿主的鐵吸收；而鐵失衡會導(dǎo)致腸道菌群的改變，進而改變微生物多樣性，增加病原體相對豐度并誘導(dǎo)腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展[31]。

圖6 黑木耳黑色素對IDA小鼠腸道屬水平差異微生物相對豐度的影響Fig.6 Effect of A.auricula melanin on relative abundance of differential intestinal microorganisms in IDA mice at the genus level

哺乳動物腸道中的Akkermansia屬微生物均為嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila），這是一種潛在益生菌[33-34]，其相對豐度與炎癥水平呈負相關(guān)[35-36]；課題組前期的研究也表明IDA可引起小鼠結(jié)腸炎癥損傷[29]，由此推測，與對照組小鼠相比，IDA小鼠Akkermansia muciniphila相對豐度顯著降低，而補充黑木耳黑色素后顯著提高了小鼠腸道Akkermansia muciniphila的相對豐度，表明Akkermansia muciniphila在黑木耳黑色素改善IDA過程中可能發(fā)揮重要作用，而這種作用可能與炎癥修復(fù)有關(guān)。

Alistipes是擬桿菌門的一種革蘭氏陰性細菌，主要存在于健康人的腸道中，可代謝產(chǎn)生琥珀酸、乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，Dostal等[37]研究表明鐵缺乏會導(dǎo)致有益菌Alistipes相對豐度減少，與本實驗結(jié)果相似。先前的研究表明短鏈脂肪酸具有抗炎作用，由此推測Alistipes相對豐度降低會促使短鏈脂肪酸含量減少，這也可能是鐵缺乏加劇腸道損傷的原因。相反補充黑木耳黑色素顯著增加了Alistipes相對豐度，表明其在黑木耳黑色素改善IDA過程中同樣具有重要作用。Alistipes是一種從臨床樣本中分離出來的相對較新的細菌屬，盡管Alistipes在健康表型中發(fā)揮作用，但需要注意的是，Alistipe可能引起焦慮、抑郁癥等疾病[38]。因此，需要進一步有針對性地研究該屬在疾病和健康中的作用。

本實驗結(jié)果表明IDA小鼠Falsiporphyromonas相對豐度高度顯著降低（P＜0.001），補充黑木耳黑色素改善貧血狀況后Falsiporphyromonas相對豐度顯著增加（P＜0.05）。目前關(guān)于Falsiporphyromonas的報道較少，有研究表明其與卟啉單胞菌屬基因序列相似度較高[39]，且均為紫單胞菌科微生物。卟啉單胞菌是一種絕對需鐵菌[40]，推測Falsiporphyromonas也具有相似的性質(zhì)，可以通過Falsiporphyromonas相對豐度水平推測宿主的貧血狀況。

Coprobacter菌屬可以降解膳食纖維，產(chǎn)生丙酸、丁酸等有益的短鏈脂肪酸[41]，本實驗結(jié)果表明補充黑木耳黑色素極顯著提高了Coprobacter的相對豐度。Parabacteroides是人體核心菌群之一，Noble等[42]研究表明高糖飲食會導(dǎo)致Parabacteroides水平升高，而Parabacteroides水平越高，記憶缺陷則越明顯。本實驗結(jié)果表明缺鐵會導(dǎo)致Parabacteroides水平升高，補充黑色素則會顯著逆轉(zhuǎn)Parabacteroides的相對豐度，表明該菌在黑色素改善IDA的過程中起到與黑色素相反的作用。然而，Wang Kai等[43]的研究揭示了腸道共生菌Parabacteroides distasonis在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面是一種潛在的新型抗代謝綜合征益生菌。因此,需要根據(jù)特定條件來判定Parabacteroides是否為致病菌。以上結(jié)果表明，補充黑木耳黑色素顯著提高有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度，表明腸道菌群在參與黑木耳黑色素改善貧血過程中具有重要作用，但其具體作用機制還有待進一步研究。

3 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明黑木耳黑色素可增加IDA小鼠體質(zhì)量，改善和恢復(fù)IDA小鼠貧血癥狀指標(biāo)Hb質(zhì)量濃度、RBC計數(shù)、HCT、MCV、WBC計數(shù)、PLT計數(shù)，增加有益菌Akkermansia、Alistipes等菌屬相對豐度，降低條件致病菌Proteobacteria的相對豐度?？傊?，黑木耳黑色素干預(yù)能夠恢復(fù)和改善IDA癥狀，腸道菌群可能在其中發(fā)揮重要作用，未來研究可以采用菌群剔除、糞菌移植并結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)，進一步分析腸道菌群在黑木耳黑色素治療IDA中發(fā)揮作用的機制。