γ-聚谷氨酸在冷凍食品中的應(yīng)用及其抗凍機(jī)理的研究進(jìn)展

王 慧，何宜能，張偉杰，沈黃晨，李申瑩，孫弋歌，雷 鵬，徐 虹*，王 瑞*

（南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

低溫冷鏈技術(shù)是一種廣泛采用的長(zhǎng)期貯存食物方法，其通過(guò)接近或低于冰點(diǎn)的溫度處理食品，來(lái)延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[1]。然而，食品在冷凍貯存過(guò)程中通常會(huì)發(fā)生品質(zhì)的劣變，主要分為物理變化（汁液流失、干耗、質(zhì)構(gòu)破壞、比熱容、熱導(dǎo)率等）和化學(xué)變化（蛋白質(zhì)變性和聚集、脂質(zhì)氧化、內(nèi)源酶活化、風(fēng)味變差、色澤變化等），其中制約產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素是冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的形成[2]。為了解決此類問(wèn)題，各種抗凍技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，添加抗凍劑作為其中的一種方法，為龐大的食品工業(yè)領(lǐng)域中抗凍技術(shù)的探索提供了更加開闊的思路[3-5]。

傳統(tǒng)的商業(yè)抗凍劑多為糖類、多聚磷酸鹽類、醇類及其復(fù)配物[6-8]。蔗糖等高甜度、高熱量的糖類抗凍劑不利于肥胖癥患者及糖尿病人的食用，制約了其使用范圍；復(fù)合磷酸鹽的添加受到了嚴(yán)格限制，添加量偏高不僅會(huì)有苦澀味，也會(huì)影響人體對(duì)鈣質(zhì)的吸收，甚至?xí)又馗哐獕杭奥阅I病者的癥狀[7]；糖醇類和多聚磷酸鹽類抗凍劑雖然可以使冰晶細(xì)小化，但是不能有效控制溫度反復(fù)波動(dòng)過(guò)程中重結(jié)晶的形成，從而對(duì)食品質(zhì)地和空間結(jié)構(gòu)造成破壞[9]。近年來(lái)，隨著消費(fèi)結(jié)構(gòu)的升級(jí)和健康飲食理念的推廣，“減糖、減鹽、減油”的理念逐漸深入人心，消費(fèi)者對(duì)于“健康食品”的需求不斷增加。為了實(shí)現(xiàn)食品產(chǎn)業(yè)逐步提升到食品可持續(xù)供給與營(yíng)養(yǎng)健康保障的更高層次，研發(fā)綠色、健康、環(huán)保的抗凍劑具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和現(xiàn)實(shí)意義。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）又稱納豆菌膠、多聚谷氨酸，最早在納豆（日本傳統(tǒng)食品）中發(fā)現(xiàn)[10]，具有優(yōu)異的益生功能和食品安全性，同時(shí)在日本和韓國(guó)等國(guó)家被列入食品添加劑目錄[11]，在促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、減鹽、抗凍等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，基于產(chǎn)品在食品安全和營(yíng)養(yǎng)健康領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用潛力，γ-PGA原料近年來(lái)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，目前主要通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，該方法具有生產(chǎn)過(guò)程可控、產(chǎn)品分子質(zhì)量多元化和生物安全性高等優(yōu)勢(shì)[12-13]。作為一種新型的抗凍劑，γ-PGA最大的特點(diǎn)是通過(guò)氫鍵與水分子連接，吸附在冰層表面，限制了凍藏過(guò)程水分子的流動(dòng)，抑制了冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的形成。另外γ-PGA還具有益生功能，對(duì)人體具有保健作用：如促進(jìn)Ca2+的吸收，有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[14]；促進(jìn)小腸對(duì)生理活性物質(zhì)（如維生素、多酚或類胡蘿卜素）的攝取[15]；刺激體內(nèi)針對(duì)病毒抗原的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)人體免疫功能[16]；還能發(fā)揮降低膽固醇、降血糖、降血脂等功效[17-20]，這些有益功能促進(jìn)了γ-PGA在食品功能因子領(lǐng)域的應(yīng)用，為推動(dòng)以生物技術(shù)和生命科學(xué)為先導(dǎo)的健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了研究熱點(diǎn)。本文綜述γ-PGA的應(yīng)用現(xiàn)狀，總結(jié)其抗凍機(jī)制，旨在為γ-PGA作為一種新型抗凍劑在食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 γ-PGA的結(jié)構(gòu)和組成

γ-PGA（圖1）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸組成的多聚酰胺，通過(guò)γ-酰胺鍵連接而成[21-24]，是一種陰離子型多肽聚合物。γ-PGA分子鏈上含有大量的羧基，可在分子內(nèi)部或分子之間形成氫鍵，這些氫鍵的形成不僅提高了γ-PGA的水溶性和保水性[10]，還能夠有效束縛凍藏過(guò)程中水分的流動(dòng)，阻止凍結(jié)過(guò)程中冰晶的生長(zhǎng)以及在融化過(guò)程中重結(jié)晶的形成[25]。此外，γ-PGA具有獨(dú)特二級(jí)結(jié)構(gòu)包括β-折疊（50.3%）、β-轉(zhuǎn)角（0.5%）、α-螺旋（18.5%）和無(wú)規(guī)卷曲（30.7%），其豐富的α-螺旋和β-折疊也是水分子結(jié)合和抑制冰晶形成的主要原因[26-28]。最后，作為食品功能原料，其降解產(chǎn)物為氨基酸，有效保障了生物安全性[29]。

圖1 γ-PGA結(jié)構(gòu)式（n＞100）Fig.1 Structural formula of γ-PGA (n ＞ 100)

γ-PGA的抗凍功能與其分子質(zhì)量密切相關(guān)[30]，其分子質(zhì)量主要分布在10～2 000 kDa之間。Mitsuiki[31]、Shih[32]等應(yīng)用差示掃描量熱技術(shù)測(cè)定了不同分子質(zhì)量γ-PGA的抗凍活性，發(fā)現(xiàn)隨分子質(zhì)量的增加其抗凍活性呈下降趨勢(shì)，且分子質(zhì)量低于20 kDaγ-PGA的抗凍活性明顯高于公認(rèn)的抗凍劑葡萄糖，在對(duì)深度冷凍敏感的酶或培養(yǎng)物的冷凍保藏中具有一定的應(yīng)用前景[30-33]。高分子質(zhì)量的γ-PGA具有較高的黏度，并且分子質(zhì)量越大，黏性越高，持水性越強(qiáng)，將其添加到果汁和冰激凌等產(chǎn)品中還能夠起到增稠劑和穩(wěn)定劑的作用[34]，從而提高混合料液的黏度，增強(qiáng)產(chǎn)品的抗融性和保存的穩(wěn)定性[35]。結(jié)合γ-PGA分子質(zhì)量多元化所帶來(lái)理化性質(zhì)的差異，眾多學(xué)者將其應(yīng)用在不同領(lǐng)域，表1歸納了不同分子質(zhì)量的γ-PGA及其衍生物的生理功能和應(yīng)用，為新型食品冷凍工藝的發(fā)展提供了新的應(yīng)用前景，盡管如此，目前關(guān)于γ-PGA分子質(zhì)量與抗凍功效關(guān)聯(lián)的深層機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

表1 γ-PGA及其衍生物的應(yīng)用前景Table 1 Potential applications of γ-PGA and its derivatives

抗凍活性取決于對(duì)水分子、糖類和無(wú)機(jī)鹽的固定活性[40-42]。γ-PGA聚合物鏈之間的氫鍵能夠固定水、糖和無(wú)機(jī)鹽等分子，使現(xiàn)有的分子相互作用（二硫鍵、氫鍵、疏水相互作用、離子相互作用）以及物理效應(yīng)（例如吸附、空間位阻和水分遷移）復(fù)雜化，從而影響食品的質(zhì)構(gòu)、凝膠性和延伸性等[43-44]。另外，γ-PGA不僅能以水不溶性游離酸的形式存在，也可以通過(guò)與多種金屬離子結(jié)合以可完全水溶的γ-PGA鹽形式存在，這些γ-PGA鹽也具有抗冷凍能力，其抗凍活性取決于γ-PGA鹽中的陽(yáng)離子，按Mg2+＞Ca2+＞Na+＞K+遞減。Maeda[45]、Berthold[46]等發(fā)現(xiàn)γ-PGA鹽高抗凍活性主要是由帶電反離子通過(guò)庫(kù)侖力來(lái)影響水的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；Shih等[32]也基于差示掃描量熱和核磁共振技術(shù)得出了γ-PGA鹽防凍活性是由于鹽對(duì)水分子的高固定活性引起的，這種性質(zhì)對(duì)食物還具有一定的低溫保護(hù)作用[42]。除此之外，γ-PGA鹽無(wú)味且易溶于水形成有黏彈性的弱凝膠，可以在食品、菌種以及酶的保存中得到廣泛應(yīng)用[47]。

2 γ-PGA抗凍機(jī)制

食品在冷凍過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是晶體的形成，也是影響食品品質(zhì)的關(guān)鍵因素。晶體的形成過(guò)程可以分為兩個(gè)不同的階段：結(jié)晶和再結(jié)晶[48]。結(jié)晶也分為兩個(gè)關(guān)鍵步驟：成核和晶粒的生長(zhǎng)。結(jié)晶是由成核引起的，成核即水分子結(jié)合成穩(wěn)定的晶核形成有序的冰顆粒。晶核一旦形成，在結(jié)晶驅(qū)動(dòng)力的作用下，促使晶核吸附周圍的水分子形成冰晶并快速生長(zhǎng)[49]。冰晶的形態(tài)對(duì)溫度和過(guò)飽和度十分敏感，小冰晶具有更大的比表面積和更高的自由能，受熱動(dòng)力學(xué)效應(yīng)影響，組織內(nèi)水分子由小冰晶變成大冰晶，冰晶數(shù)量減少，表面能降低，從而發(fā)生重結(jié)晶。重結(jié)晶包括小冰晶的融化、大冰晶的生長(zhǎng)和冰晶的融化[50]。冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的形成都會(huì)通過(guò)機(jī)械應(yīng)力對(duì)組織和細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致食品品質(zhì)的下降。

通過(guò)對(duì)大量γ-PGA抗凍作用的研究總結(jié)，針對(duì)γ-PGA的性質(zhì)（吸水性、保水性、抗氧化性、交聯(lián)性等），可以將其歸納為對(duì)食品內(nèi)部水分、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等主要組分的影響。γ-PGA的抗凍機(jī)理可總結(jié)如下。

2.1 “吸水-保水”抑制水分遷移

基于對(duì)γ-PGA的吸水性和保水性的研究，鞠蕾[51]、劉婷[52]等通過(guò)吸水試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)γ-PGA在蒸餾水和生理鹽水中的吸水倍數(shù)可達(dá)約200 g/g，比目前常用的保水劑PAM的吸水能力強(qiáng)1.7 倍，是一種天然的“保濕霜”，它的吸濕性和保濕效果與透明質(zhì)酸相當(dāng)[53]，且γ-PGA的濃度越高，結(jié)構(gòu)越緊致，其保水性和吸水性就越強(qiáng)。這一性質(zhì)可歸因于分子鏈中游離的羧基，它可以通過(guò)氫鍵與水分子發(fā)生緊密結(jié)合，這種締合作用抑制了水分的遷移。

食品中的水分由自由水、結(jié)合水和弱結(jié)合水組成[54]，水的狀態(tài)影響了冰晶的生長(zhǎng)/再生和凍融循環(huán)的結(jié)晶/再結(jié)晶過(guò)程。根據(jù)凍結(jié)期間的行為，食品中的水分分為可冷凍水和不可冷凍水，可冷凍水形成冰晶，進(jìn)而影響冷凍食品的物理化學(xué)性質(zhì)[55]。γ-PGA能促進(jìn)食品中自由水向結(jié)合水和弱結(jié)合水的轉(zhuǎn)化，抑制水分的遷移并緩解冰晶的形成。根據(jù)γ-PGA與冰晶結(jié)合模型推測(cè)γ-PGA與水分子的作用機(jī)制，如圖2所示。帶有羧基的γ-PGA分子通過(guò)氫鍵與水分子連接，吸附到冰層表面形成一層薄膜，使水分子運(yùn)動(dòng)受阻并避免了在低溫下的重新定向，這種較大的“束縛力”不僅使冰晶間的結(jié)合更加緊密，還使冰晶更細(xì)小、更均勻。

圖2 γ-PGA與冰晶結(jié)合模型圖Fig.2 Model diagram of γ-PGA combined with ice crystal

謝新華等[55]通過(guò)應(yīng)用低場(chǎng)核磁共振和X-射線衍射技術(shù)分析了加入γ-PGA后小麥淀粉中水分的狀態(tài)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：γ-PGA有效減弱了弱結(jié)合水向自由水的轉(zhuǎn)化，水分結(jié)合更加緊密，從而抑制了水分遷移，延緩了冰晶的形成；同時(shí)，γ-PGA降低了小麥淀粉凝膠的結(jié)晶度，抑制了凍融循環(huán)導(dǎo)致淀粉凝膠的重結(jié)晶現(xiàn)象。這一結(jié)果證實(shí)了γ-PGA的抗凍作用是通過(guò)與水分子以氫鍵結(jié)合來(lái)抑制水分的遷移，從而控制冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的形成。

2.2 “交聯(lián)-修飾”調(diào)控冰晶

交聯(lián)是大分子物質(zhì)以共價(jià)鍵連接成網(wǎng)狀或體型高分子的過(guò)程，能夠增加聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量和穩(wěn)定性，使之形成一個(gè)完整的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[56]，起到提高體系凝膠特性和保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。γ-PGA的交聯(lián)作用主要指分子鏈上的-NH2和-COOH能夠自身或與其他高分子以氫鍵或靜電相互作用進(jìn)行交聯(lián)，形成一種三維網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)聚合物——水凝膠。交聯(lián)后的γ-PGA是一種高吸水性聚合物[57]，具有高水平的水化性和柔韌性，可以起到保護(hù)蛋白質(zhì)的作用。

冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)冷凍變性，使原來(lái)穩(wěn)定、緊密的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能和理化性質(zhì)的改變。如圖3所示，在凍結(jié)時(shí)，冰晶的形成引起結(jié)合水和蛋白質(zhì)分子的結(jié)合狀態(tài)被破壞，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的共價(jià)鍵以及非共價(jià)鍵斷裂，而重新形成的新鍵也已不在之前的位點(diǎn)；另一方面，在重結(jié)晶作用下，蛋白質(zhì)分子因機(jī)械力而發(fā)生解聚，從有序空間結(jié)構(gòu)向無(wú)序空間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力降低并引發(fā)部分弱結(jié)合水向自由水轉(zhuǎn)化[58]。此外，蛋白內(nèi)部氨基酸殘基之間氫鍵被破壞，引起疏水基團(tuán)暴露并引發(fā)蛋白質(zhì)分子間和其他分子內(nèi)部的重新交聯(lián)。所以如何調(diào)控冰晶的生長(zhǎng)及抑制重結(jié)晶的形成對(duì)穩(wěn)定冷凍食品品質(zhì)至關(guān)重要。

圖3 蛋白質(zhì)冷凍凝聚變性模型Fig.3 Protein coagulation and denaturation model during frozen storage

γ-PGA對(duì)于冰晶的調(diào)控可歸納為以下幾個(gè)方面：1）γ-PGA吸收水分形成一種膠體溶液，具有一定的黏性和較強(qiáng)的介穩(wěn)性，通過(guò)氫鍵作用和靜電相互作用吸附在冰晶表面形成一層薄膜，從而鎖住水分[59]，提高食品中混合物料的黏性[60]并增強(qiáng)產(chǎn)品的抗融性和保存穩(wěn)定性[61]。2）γ-PGA凝膠具有優(yōu)異的吸水能力，比葡萄糖的水合作用還要強(qiáng)，可以引入更多的親水性物質(zhì)[62]。γ-PGA自身或與其他高分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖等）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使自由水轉(zhuǎn)化成結(jié)合水，游離的水分子被γ-PGA氫鍵超分子網(wǎng)絡(luò)緊密結(jié)合，阻止系統(tǒng)的水分子成核，即使形成了一些小冰核，也可以避免過(guò)冷水加入冰核形成大冰晶。3）如圖4所示，交聯(lián)能夠顯著改變?chǔ)?PGA分子結(jié)構(gòu)，使其具備高吸水性，形成為一種“多袋狀”水凝膠，這種高親和力使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，在冷凍過(guò)程中自身也可能發(fā)生分子聚集，引起食品質(zhì)構(gòu)特性的增強(qiáng)[63-64]。

圖4 γ-PGA“多袋狀”水凝膠模型Fig.4 “Multi-baggy” hydrogel model of γ-PGA

2.3 “靜電-吸附”穩(wěn)定體系

對(duì)于高蛋白冷凍食品，蛋白質(zhì)的氧化、變性對(duì)品質(zhì)有較大的影響，維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象穩(wěn)定的作用力有多種，主要包括氫鍵、共價(jià)鍵、范德華力、靜電作用力、范德華力、疏水作用力等[65]。這些作用力對(duì)于γ-PGA保護(hù)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、維持體系的穩(wěn)定具有重要作用，可以歸納為以下兩個(gè)方面：1）γ-PGA可充當(dāng)氫鍵的供體和受體，與蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)形成帶電膠團(tuán)并吸附在大分子表面形成雙層電子層，既存在靜電引力，又存在靜電斥力，與膠團(tuán)范德華力共同作用以維持體系的穩(wěn)定[66]。γ-PGA在一定范圍內(nèi)隨濃度的升高，靜電相互作用增加，疏水相互作用減弱，表現(xiàn)出較強(qiáng)的氫鍵，引起凝膠強(qiáng)度的升高和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[64]。2）γ-PGA系統(tǒng)是一種“氫鍵超分子液體網(wǎng)絡(luò)”，能夠改變體系中水的結(jié)構(gòu)，間接引起基團(tuán)周圍氫鍵結(jié)構(gòu)的變化。時(shí)曉劍等[33]對(duì)γ-聚谷氨酸鈉抗凍活性的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的闡述（圖5）：每個(gè)水分子與周圍4 個(gè)水分子通過(guò)氫鍵連接形成四面體結(jié)構(gòu)，在凍結(jié)過(guò)程中，水分子四面體可形成冰晶。γ-聚谷氨酸鈉在水溶液中發(fā)生電離，生成了-COO-和Na+，其靜電力作用破壞了水的正四面體結(jié)構(gòu)并束縛了一部分水分子，被束縛的水分子在-COO-和Na+周圍形成水化層，水化層內(nèi)部為不可凍結(jié)水，水化層外部為可凍結(jié)水。相對(duì)于葡萄糖和谷氨酸，γ-聚谷氨酸鈉的解離度較大，Na+對(duì)水分子的束縛能力較強(qiáng)，故Na+形成的水化層中不可凍結(jié)水含量較多[42]。

2.4 “清除自由基-螯合金屬離子”提高抗氧化能力

蛋白質(zhì)是多種冷凍食品主要組成成分，蛋白質(zhì)的狀態(tài)決定了食品的品質(zhì)，當(dāng)受到含有氮氧化學(xué)元素的活性誘導(dǎo)物質(zhì)（化學(xué)自由基和非自由基基團(tuán)）的誘導(dǎo)時(shí)，會(huì)發(fā)生理化性質(zhì)的變化（圖6A）。這類誘導(dǎo)劑通過(guò)共價(jià)鍵的修飾會(huì)造成氨基酸側(cè)鏈改變、巰基化合物含量增加、蛋白質(zhì)降解以及溶解度降低等變化。如圖6B所示，自由基和蛋白質(zhì)側(cè)鏈反應(yīng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)自由基，之后和氧分子反應(yīng)形成過(guò)氧化自由基。后者進(jìn)一步攻擊蛋白質(zhì)中的氨基或亞氨基，形成羰基衍生物，此外，巰基的氧化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部或蛋白質(zhì)之間二硫鍵交聯(lián)的形成，使得蛋白質(zhì)功能活性降低[67-69]。

圖6 蛋白質(zhì)氧化過(guò)程中理化性質(zhì)的變化（A）和自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化途徑（B）Fig.6 Changes in physicochemical properties during protein oxidation (A)and free radical-induced protein oxidation pathway (B)

凍融過(guò)程類似于脫氧和復(fù)氧過(guò)程。凍融過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子使蛋白質(zhì)的金屬離子釋放或還原，導(dǎo)致原有的氧化還原平衡被打破[70-71]。基于對(duì)γ-PGA抗氧化性質(zhì)的研究，γ-PGA主要通過(guò)清除自由基、螯合金屬離子的方式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾[72]。γ-PGA還能夠抑制脂質(zhì)氧化和透明質(zhì)酸的活性，減少細(xì)胞中氧自由基、氮自由基含量的增加[73]。Lee等[74-75]通過(guò)對(duì)γ-PGA抗氧化能力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，1 mg/mLγ-PGA（分子質(zhì)量400 kDa）對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率可分別達(dá)85.2%、94.1%、76.64%，對(duì)脂質(zhì)氧化抑制活性高達(dá)96.0%。可以作為輔助抗氧化劑添加到高蛋白冷凍食品中應(yīng)用。

γ-PGA可以阻止凍融和加熱處理誘導(dǎo)的胞外蛋白變性，提高酶蛋白的穩(wěn)定性和活性[65]。Jia Chunli等[76]分析了γ-PGA對(duì)于酵母細(xì)胞抗氧化能力的影響得出：1）γ-PGA作為一種良好的螯合劑，通過(guò)結(jié)合多種金屬離子來(lái)阻止金屬離子催化自由基，從而誘導(dǎo)酵母細(xì)胞抵御氧化；2）γ-PGA影響多種氧化還原酶來(lái)參與細(xì)胞抗氧化過(guò)程，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶[77]；3）γ-PGA可以阻止凍融和加熱處理誘導(dǎo)的胞外蛋白變性，降低酵母細(xì)胞釋放谷胱甘肽的濃度，提高了酶蛋白的穩(wěn)定性和活性[78]。γ-PGA和細(xì)胞表面相互作用的理論模型如圖7所示。

圖7 γ-PGA和細(xì)胞表面相互作用的理論模型Fig.7 Theoretical model of γ-PGA interaction with cell surface

3 γ-PGA作為抗凍劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用

隨著應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，γ-PGA在各類產(chǎn)品中不斷展現(xiàn)出保水、增稠、抗氧化等性能，總結(jié)γ-PGA在各類產(chǎn)品中表現(xiàn)出的不同作用效果及機(jī)制（表2），有利于促進(jìn)其在食品工業(yè)的發(fā)展?jié)摿?。作為一種新型抗凍劑，γ-PGA可以抑制水分遷移、修飾冰晶、提高抗氧化能力，γ-PGA另一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)是具有類似于微膠囊的包覆風(fēng)味物質(zhì)的性質(zhì)。

表2 γ-PGA及其衍生物在食品工業(yè)中的應(yīng)用Table 2 Applications of γ-PGA and its derivatives in food industry

3.1 在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用

冷凍面團(tuán)技術(shù)已被廣泛產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，水是冷凍面團(tuán)的主要成分，其行為和狀態(tài)顯著影響冷凍面團(tuán)的質(zhì)量。在面團(tuán)的冷凍過(guò)程中，溫度的波動(dòng)促進(jìn)了冰晶的生長(zhǎng)，水分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用被破壞，結(jié)合水從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)，從而導(dǎo)致面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的劣化。酵母細(xì)胞的活性或產(chǎn)氣力是影響冷凍面制品品質(zhì)的另一個(gè)關(guān)鍵因素，酵母活性較低在冷凍面團(tuán)的后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，既不能產(chǎn)生足夠的氣體，也沒(méi)有保持面筋蛋白的持氣能力，這將導(dǎo)致烘焙產(chǎn)品的扁平形狀、體積小和質(zhì)地緊實(shí)。因此工業(yè)化生產(chǎn)中非常重視持水性和酵母細(xì)胞的活性，這些指標(biāo)的優(yōu)化有助于提高面團(tuán)得率、節(jié)約成本[79]。近年來(lái)，γ-PGA對(duì)冷凍面制品的研究屢見報(bào)道，其中，王家寶[80]、宋佳薇[81]、謝新華[55]等將γ-PGA成功應(yīng)用到全麥冷凍面團(tuán)、面條、小麥淀粉凝膠中，如圖8所示，添加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）γ-PGA后，恒溫凍藏組和凍融循環(huán)組的比容均明顯增大，可能是因?yàn)棣?PGA提高了酵母存活率，增大了產(chǎn)氣量，使得面團(tuán)醒發(fā)高度上升，比容增大。此外，γ-PGA還能使凍藏期間面筋蛋白中弱結(jié)合水向自由水的轉(zhuǎn)化量減少，限制了水分的流動(dòng)，同時(shí)抑制了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量下降和無(wú)規(guī)卷曲含量增加，提高了熱力學(xué)的穩(wěn)定性。

圖8 γ-PGA對(duì)面包比容的影響[80]Fig.8 Effect of γ-PGA on the specific volume of bread[80]

3.2 在細(xì)胞凍存中的應(yīng)用

細(xì)胞在冷凍過(guò)程中的結(jié)構(gòu)、存活率、以及代謝活力對(duì)工業(yè)應(yīng)用和學(xué)術(shù)探究帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，保存細(xì)胞的技術(shù)大多采用低溫保存和冷凍干燥技術(shù)[83]，傳統(tǒng)的細(xì)胞冷凍液通常采用有機(jī)溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和培養(yǎng)基按照一定的比例混合，但是DMSO具有一定的毒性[84]，F(xiàn)BS有較高的病毒、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險(xiǎn)，這種不利因素對(duì)細(xì)胞的損傷是不可逆轉(zhuǎn)的。在目前的研究中學(xué)者們?cè)噲D挖掘其他可替代的物質(zhì)，盡可能地避免對(duì)DMSO和血清的使用，如甘油[85]、糖類（葡聚糖[83]、海藻糖[86]、海藻酸鈉[87]）、蛋白類等[88-89]。對(duì)于γ-PGA在細(xì)胞冷凍保護(hù)方面的研究還需進(jìn)一步深入的探索。

Jia Chunli等[76]發(fā)現(xiàn)γ-PGA顯著提高了酵母細(xì)胞的存活率，增強(qiáng)了冷凍耐受性。另外，陳煥蕓等[89]研究了γ-PGA對(duì)于細(xì)胞凍存的影響，發(fā)現(xiàn)添加γ-PGA的細(xì)胞在凍存1 周后，仍可保持良好的細(xì)胞形態(tài)與完整的細(xì)胞骨架。根據(jù)已有的研究推測(cè)γ-PGA保護(hù)細(xì)胞主要集中在兩方面：1）分子側(cè)鏈上存在可電離的-NH2和-COOH等官能團(tuán)，能被細(xì)胞表面的配體識(shí)別，有利于細(xì)胞的黏附[90]。在凍存細(xì)胞表面，γ-PGA會(huì)形成類似薄膜的結(jié)構(gòu)來(lái)保護(hù)細(xì)胞，提高細(xì)胞的復(fù)蘇率，這種獨(dú)特的保護(hù)方式更有利于細(xì)胞規(guī)?；闹苽洹?）游離的γ-PGA可以作為細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存，增強(qiáng)了生物膜形成，保護(hù)細(xì)胞免受高濃度鹽的吞噬攻擊，維持細(xì)胞膜的完整性。

冷凍干燥技術(shù)是益生菌保藏時(shí)最常用的方法，但過(guò)低的溫度（-40～-20 ℃）往往對(duì)益生菌的結(jié)構(gòu)和活力造成損傷[91]。Bhat等[92]將γ-PGA應(yīng)用在冷凍干燥過(guò)程中維持益生菌的活力，如圖9所示，γ-PGA在短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）冷凍干燥過(guò)程（-40 ℃、500 Pa、48 h）中表現(xiàn)出與蔗糖相當(dāng)?shù)牡蜏乇Ｗo(hù)活性，并且質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的γ-PGA對(duì)副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）的保護(hù)作用明顯優(yōu)于相同添加量的蔗糖。

圖9 γ-PGA和蔗糖對(duì)冷凍干燥過(guò)程中益生菌活力的影響[92]Fig.9 Effect of γ-PGA and sucrose on probiotic activity during freeze drying[92]

3.3 在冷凍肉制品中的應(yīng)用

肉糜制品蛋白質(zhì)含量豐富、口感鮮嫩不油膩，深受消費(fèi)者喜愛，是食品加工業(yè)一個(gè)重要的發(fā)展方向。肉糜凝膠的形成過(guò)程實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)變性展開和聚集成大分子凝膠體的過(guò)程[93-94]。然而，反復(fù)的凍融循環(huán)會(huì)破壞體系的穩(wěn)定，直接影響了肉糜制品的組織特性、凝膠強(qiáng)度和持水性。

趙巖巖等[82]應(yīng)用質(zhì)構(gòu)儀和流變儀分析了γ-PGA對(duì)魚糜凝膠制品的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性均顯著增加；添加不同比例γ-PGA處理組的G＇均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，G＇可以作為反映肉糜凝膠強(qiáng)度的一個(gè)重要指標(biāo)，G＇越高表明凝膠強(qiáng)度越好。此外，白登榮等[59]通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了γ-PGA在不同體系條件下對(duì)肌原纖維蛋白功能特性的影響，與未添加γ-PGA的蛋白樣品相比，加入γ-PGA后的蛋白樣品其肌球蛋白重鏈條帶和肌動(dòng)蛋白條帶都明顯減弱，表明γ-PGA與肌原纖維蛋白完成了交聯(lián)，使體系中的負(fù)電荷增加，靜電斥力也隨之增加，蛋白質(zhì)分子間隙增大，提高了凝膠強(qiáng)度和保水性。

4 結(jié) 語(yǔ)

γ-PGA作為一種新型綠色可食用的抗凍劑，具有保水、增稠、交聯(lián)、抗氧化等良好性能，能夠有效抑制水分遷移，起到冰晶修飾和穩(wěn)定體系的作用，因此在食品工業(yè)領(lǐng)域具有很大的發(fā)展?jié)摿?。目前，學(xué)者們已證實(shí)了其優(yōu)異的抗凍性和食品安全性，但是關(guān)于γ-PGA抗凍機(jī)理以及與其不同分子質(zhì)量之間的深層機(jī)制尚不明確，這些領(lǐng)域仍需要人們深入的研究?？梢灶A(yù)見，γ-PGA抗凍潛力的挖掘?qū)ν苿?dòng)新產(chǎn)品研發(fā)、相關(guān)產(chǎn)業(yè)和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步具有重大意義。