基于核磁共振氫譜的葡萄酒真實性鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

趙玉立，王 麗，譚 丹，溫昊松，金 剛，李 響,*，張 昂,*

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.河北省葡萄酒質(zhì)量安全檢測重點(diǎn)實驗室，河北 秦皇島 066000；3.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島 066000；4.烏魯木齊海關(guān)進(jìn)出口食品安全處，新疆 烏魯木齊 830000）

葡萄酒是世界上廣泛消費(fèi)的酒精性飲品，具有較高的商業(yè)價值和保健用途[1]。國際葡萄與葡萄酒組織（International Organization of Vine and Wine，OIV）調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2020年中國葡萄酒消費(fèi)量達(dá)12.4億 L，位列世界第6，而人均消費(fèi)量卻低于世界平均水平，排名22，說明我國葡萄酒市場的發(fā)展?jié)摿薮?。近年來，國?nèi)消費(fèi)需求不斷上升，消費(fèi)者對葡萄酒質(zhì)量狀況的關(guān)注度也隨之提高，越來越傾向于購買具有真實性認(rèn)證的葡萄酒，葡萄酒的真實性鑒別也由此成為葡萄酒品質(zhì)和安全保證中必不可少的一個方面。隨著葡萄酒消費(fèi)量逐年增長，在利益驅(qū)使下，葡萄酒出現(xiàn)了不同形式的造假：1）非地理標(biāo)識保護(hù)葡萄酒假冒地理標(biāo)識保護(hù)葡萄酒，或假冒知名產(chǎn)地葡萄酒[2]；2）將其他品種葡萄酒冒充較好品種的葡萄酒[3]；3）將其他年份葡萄酒冒充年份較好的葡萄酒[4]等。這些行為不僅嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的身體健康與合法權(quán)益，還擾亂了葡萄酒行業(yè)秩序，成為葡萄酒行業(yè)發(fā)展的阻礙。

現(xiàn)今，在葡萄酒真實性鑒別領(lǐng)域國內(nèi)外已有多種檢測技術(shù)，包括氣相色譜（gas chromatography，GC）與質(zhì)譜（mass spectrum，MS）聯(lián)用[5-6]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[9-10]、近紅外線光譜（near infrared spectrum，NIRS）、中紅外線光譜（middle infrared spectrum，MIRS）[11-12]、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（isotope ratio mass spectrometry，IR-MS）[13-15]、核磁共振光譜（nuclear magnetic resonance，NMR）[16-17]等，以及以上不同方法的組合[18-19]。NMR即在靜磁場中，具有磁性的原子核存在不同能級，用特定頻率的電磁波照射樣品，當(dāng)電磁波能量等于能級差時，原子核吸收電磁能發(fā)生躍遷，產(chǎn)生共振吸收信號[20-22]。NMR技術(shù)通過對磁場強(qiáng)度、檢測條件（水和乙醇信號峰壓制）、數(shù)據(jù)預(yù)處理程序（歸一化、峰值對齊、縮放等）設(shè)置，可使其在確定分子結(jié)構(gòu)方面具有高重現(xiàn)性、高靈敏性、無損傷性和無偏向性等優(yōu)點(diǎn)[23]，成為鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)等的重要方法[24-26]。目前，為人們所利用的原子核主要有1H、11B、13C、17O、19F、31P等[27]。其中，1H存在于淀粉、蜂蜜、油、糖、葡萄酒等物質(zhì)中，因此，核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H-NMR）被應(yīng)用于白酒[28]、啤酒[29-31]、葡萄酒[32-33]的真假鑒別和溯源性分析及其他食品的成分分析、品質(zhì)檢測等中。但由于NMR儀價格昂貴，1H-NMR技術(shù)檢測費(fèi)用較高且受樣品pH值影響，未能在食品檢測中廣泛使用。

歐洲在葡萄酒的真實性鑒別方面全球領(lǐng)先，歐盟聯(lián)合研究中心從1991年開始收集分析記錄了上萬種葡萄酒信息，初步建立了獨(dú)一無二的歐盟葡萄酒數(shù)據(jù)庫。2002年歐盟又開始建立“第三國葡萄酒數(shù)據(jù)庫”，旨在建立一個全球性的葡萄酒信息數(shù)據(jù)庫，為各國葡萄酒真實性研究提供參考數(shù)據(jù)[34]。歐盟擁有較完善的葡萄酒保護(hù)體系，最大限度地保護(hù)了歐洲葡萄酒的真實性，維護(hù)了其葡萄酒行業(yè)的健康發(fā)展[35]。我國葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中列出了葡萄酒的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，GB/T 15037—2006《葡萄酒》中也列出了產(chǎn)地、品種及年份葡萄酒的要求，但均未提供相應(yīng)的真實性鑒別方法。與歐洲相比，我國葡萄酒真實性鑒別的信息還很薄弱，缺乏配套的葡萄酒真實性檢測方法和判別依據(jù)等關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，本文通過一維1H-NMR技術(shù)主要從產(chǎn)地葡萄酒、品種葡萄酒和年份葡萄酒3 個方面綜述1H-NMR技術(shù)在葡萄酒真實性鑒別領(lǐng)域的研究進(jìn)展與應(yīng)用現(xiàn)狀，并指出我國葡萄酒真實性鑒別未來研究的一些重點(diǎn)，以期為我國葡萄酒真實性鑒別方法的建立與完善提供參考，保護(hù)消費(fèi)者和葡萄酒生產(chǎn)者的合法權(quán)益。

1 1H-NMR技術(shù)在葡萄酒真實性鑒別中的應(yīng)用

1H-NMR技術(shù)通過自由感應(yīng)衰減信號進(jìn)行傅里葉變換，從時間信號轉(zhuǎn)換為頻率信號譜，進(jìn)而實現(xiàn)多成分物質(zhì)的全面分析。1H-NMR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物流體研究、組織代謝工程學(xué)研究[36]以及對食物來源和分類的確定[37]。例如，1H-NMR技術(shù)已能夠?qū)ζ咸押推咸丫圃诘乩韥碓?、葡萄品種、采摘年份等方面進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和分類[38]。葡萄酒具有很強(qiáng)的自然屬性，其品質(zhì)與種植地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、品種及采摘年份等有密切的關(guān)系，因此，標(biāo)有特定真實性信息的葡萄酒也成為高品質(zhì)葡萄酒風(fēng)格的象征[39]。關(guān)于葡萄酒真實性的潛在信息體現(xiàn)在1H-NMR的多個參數(shù)中，而不是體現(xiàn)在單一參數(shù)中，因此，每個1H-NMR可以被視為每個葡萄酒的獨(dú)特“指紋”，包含產(chǎn)地、品種和年份等所有信息。在葡萄酒化學(xué)領(lǐng)域，地理產(chǎn)地、葡萄品種和采摘年份可以通過1H-NMR技術(shù)利用有機(jī)酸、氨基酸、芳香物質(zhì)、酚類物質(zhì)及其他特征成分，結(jié)合多元統(tǒng)計分析來確定[40]。多元統(tǒng)計分析方法在大規(guī)模樣本集、數(shù)據(jù)集的實驗研究中有很高的分類、預(yù)測能力。目前，在各類具有識別、分類能力的多元統(tǒng)計分析方法中，應(yīng)用最廣泛的是主成分分析（principal component analysis，PCA）、判別分析（discriminant analysis，DA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）、方差分析（analysis of variance，ANOVA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、聚類分析（cluster analysis，CA）等[41]。PCA能對1H-NMR數(shù)據(jù)的多重變量進(jìn)行降維處理，提取幾個主要成分，代表檢測樣品中的主要信息；DA通過確定已知研究樣品用某種方法可以分類的情況下，確定新樣品的所屬類別；LDA在樣本鑒別中可實現(xiàn)樣本因變量組間差異的最大化、組內(nèi)樣品距離的最小化，提高模型的有效性和解析能力；ANOVA作用于兩個及兩個以上樣本平均數(shù)差別的顯著性檢驗，通過數(shù)據(jù)分析找出對樣本有顯著性影響的因素，進(jìn)一步確定不同類別樣品之間存在的顯著性差異；PLS-DA對不同樣本（如觀測樣本、對照樣本）分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并驗證訓(xùn)練集的鑒別可信度，減少變量間多重共線性產(chǎn)生的影響；CA根據(jù)樣本自身的屬性，用數(shù)學(xué)方法按照某種相似性或差異性指標(biāo)，定量確定樣本間的親疏關(guān)系，并按這種關(guān)系程度對樣本進(jìn)行聚類。

1.1 1H-NMR技術(shù)在產(chǎn)地葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究

在葡萄酒的發(fā)展進(jìn)程中，產(chǎn)地逐漸作為葡萄酒真實性的一種特征標(biāo)志，在一定程度上決定了葡萄酒的價值。葡萄酒的化學(xué)成分與其產(chǎn)地的土壤特征和環(huán)境條件密切相關(guān)[42]，因此，通過分析葡萄酒中化學(xué)成分的差異，可以溯源葡萄酒的產(chǎn)地。Kosir等[43]利用1H-NMR技術(shù)測定了樣品中氨基酸、甘油和丁二醇等成分，實現(xiàn)了斯洛文尼亞沿海和大陸地區(qū)葡萄酒的分離。胡博然等[44]采用1H-NMR技術(shù)分析了我國沙城和賀蘭山東麓的葡萄酒，有效地識別了兩個產(chǎn)區(qū)的葡萄酒。1H-NMR技術(shù)在產(chǎn)地葡萄酒鑒別中的應(yīng)用情況如表1所示。

表1 1H-NMR技術(shù)在產(chǎn)地葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究Table 1 Application of 1H-NMR spectroscopy in the identification of the geographical origin of wine

續(xù)表1

由表1可以看出，選取的葡萄酒樣品因地理產(chǎn)地不同導(dǎo)致其個別化學(xué)成分有一定差別，在不同產(chǎn)地的土壤和氣候等條件下釀造生產(chǎn)的葡萄酒也具有不同的品質(zhì)和價值。Viggiani等[45]對比了意大利巴斯利卡塔和坎佩尼亞地區(qū)艾格尼科葡萄酒的1H-NMR數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)兩地樣品的主要成分（琥珀酸、2,3-丁二醇和脯氨酸）含量存在明顯差異。Caruso等[46]通過1H-NMR技術(shù)研究了40 種意大利卡拉布里亞和坎佩尼亞的白格來克葡萄酒，采用傳統(tǒng)的核磁共振積分方法通過與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)信號進(jìn)行比較，定量測定葡萄酒的成分，發(fā)現(xiàn)坎佩尼亞地區(qū)葡萄酒的總酸度（包括檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和乳酸）較高，卡拉布里亞地區(qū)葡萄酒的葡萄糖含量較高，通過對比葡萄酒總酸度和葡萄糖含量的差異區(qū)分了兩地的葡萄酒。

由于葡萄酒所含化學(xué)成分較多，1H-NMR也較為復(fù)雜，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法從復(fù)雜數(shù)據(jù)中最大限度地提取有用信息，從而使高維數(shù)據(jù)的分類效果可視化，對不同產(chǎn)地葡萄酒起到更好的鑒別效果。Son等[47]采用1H-NMR技術(shù)鑒別了澳大利亞、法國和加利福尼亞地區(qū)的赤霞珠葡萄酒，PCA和PLS-DA結(jié)果顯示該方法可以區(qū)分樣品產(chǎn)地的主要化學(xué)成分為2,3-丁二醇、乳酸、乙酸、脯氨酸、琥珀酸、丙氨酸、蘋果酸、甘油、酒石酸、2-苯乙醇、葡萄糖和酚類，且加利福尼亞葡萄酒的脯氨酸含量高于澳大利亞和法國葡萄酒的脯氨酸含量。樊雙喜等[48]利用非目標(biāo)1H-NMR指紋圖譜技術(shù)鑒別中國葡萄酒原產(chǎn)地，研究顯示PCA和LDA模型實現(xiàn)了沙城、昌黎和昌吉三大特色產(chǎn)地葡萄酒的區(qū)分，進(jìn)一步表明1H-NMR指紋圖譜技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法是一項非常有效的鑒別產(chǎn)地葡萄酒真實性的手段。采用1H-NMR技術(shù)不僅能鑒別產(chǎn)地相差較遠(yuǎn)的葡萄酒，對特征成分進(jìn)行定量定性分析，還能準(zhǔn)確區(qū)分同一產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同小產(chǎn)地的葡萄酒。Brescia等[49]用1H-NMR技術(shù)測定了意大利阿普利亞不同小產(chǎn)區(qū)的葡萄酒，通過定量瓜氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等，結(jié)合PCA和DA建立判別模型，將阿普利亞北部、中部和南部3 個小產(chǎn)區(qū)的葡萄酒進(jìn)行了區(qū)分，且模型驗證顯示對訓(xùn)練集樣品的判別率為97%，對測試集中未知樣品的判別率為100%。Godelmann等[50]使用1H-NMR技術(shù)分析了德國5 個不同產(chǎn)地葡萄酒中的甲醇、甘油、有機(jī)酸、氨基酸等16 種有機(jī)物，可通過PCA和LDA模型明顯區(qū)分巴登、萊茵法爾茨、萊茵黑森、符騰堡、摩澤爾5 個地區(qū)的葡萄酒，數(shù)據(jù)顯示模型對符騰堡產(chǎn)區(qū)葡萄酒的判別準(zhǔn)確率為59%，其余4 個產(chǎn)區(qū)葡萄酒的判別準(zhǔn)確率均大于90%。Mazzei等[51]采用脈沖技術(shù)對葡萄酒樣品中水和乙醇的信號進(jìn)行多重抑制，除去了沒有意義的重疊峰，提供了高度可重復(fù)的1H-NMR精度，通過6 種特征成分（α-羥基異丁酸酯、乳酸、琥珀酸、甘油、α-果糖和β-D-葡萄糖醛酸）快速有效地區(qū)分了意大利坎佩尼亞地區(qū)3 個不同葡萄園的葡萄酒，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析證實了葡萄酒之間的差異與產(chǎn)地的微氣候、土壤中的碳酸鹽、黏土和有機(jī)質(zhì)含量有關(guān)。在Eva等[52]研究中，為了提高化學(xué)測量性能，分析了不同類型的分子官能團(tuán)，對1H-NMR的3 個主要光譜區(qū)域：1）芳香族區(qū)（＞5.5×10-3mol/L）；2）碳水化合物區(qū)（5.5×10-3～3.0×10-3mol/L）；3）有機(jī)酸區(qū)（＜3.0×10-3mol/L）分別進(jìn)行了PCA，研究表明異戊烷醇和異丁醇這兩個關(guān)鍵化合物能區(qū)分拉里奧哈3 個子區(qū)域的葡萄酒。Papotti等[53]將每個樣品1∶10用水稀釋后凍干過夜，以減少殘留的水和乙醇信號，然后使用1H-NMR技術(shù)結(jié)合PLS-DA發(fā)現(xiàn)2,3-丁二醇、乳酸、α-羥基異丁酸酯、琥珀酸和蘋果酸以及蘇氨酸可作為葡萄酒真實性的檢測指標(biāo)，并成功表征了索巴拉藍(lán)布魯斯科、圣克羅切藍(lán)布魯斯科薩拉米諾和卡斯泰爾韋藍(lán)布魯斯科格斯帕羅薩3 個地方葡萄酒的真實性，建立了葡萄酒真實性鑒別的有效模型。

1H-NMR技術(shù)和其他檢測技術(shù)相結(jié)合可以更好地示蹤葡萄酒原產(chǎn)地。Monakhova等[54]利用1H-NMR結(jié)合SNIFNMR技術(shù)對葡萄酒進(jìn)行產(chǎn)地溯源，產(chǎn)地鑒別準(zhǔn)確率可達(dá)80%以上。Brescia等[55]利用1H-NMR結(jié)合ICP-OES技術(shù)對葡萄酒樣品進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示對斯洛文尼亞和阿普利亞產(chǎn)區(qū)的33 個葡萄酒樣地理來源的鑒別準(zhǔn)確率為97%。此外，在葡萄酒產(chǎn)地鑒別研究中，韓靜雯等[56]采用超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜對葡萄酒樣品進(jìn)行產(chǎn)地溯源分析，數(shù)據(jù)顯示對葡萄酒產(chǎn)地溯源準(zhǔn)確率達(dá)到了85.1%。逯海等[57]采用熱電離同位素質(zhì)譜法分析了葡萄酒中鍶同位素，使產(chǎn)地的總體正確判別率達(dá)到91%以上。李彩虹等[58]利用ICP-MS測定了葡萄酒中的礦物元素含量，經(jīng)Fisher判別分析，回代檢驗和交叉檢驗的整體正確判別率分別為100.0%和98.4%。1H-NMR技術(shù)和其他檢測技術(shù)相結(jié)合鑒別葡萄酒原產(chǎn)地優(yōu)于使用單一1H-NMR技術(shù)，略次于質(zhì)譜等其他方法，但1H-NMR技術(shù)對樣品中所有的物質(zhì)靈敏度一樣，而質(zhì)譜有離子化程度和基質(zhì)干擾等問題，且1H-NMR技術(shù)可以提供比較豐富全面的樣品結(jié)構(gòu)信息，是其他方法不能比擬的優(yōu)勢。

1.2 1H-NMR技術(shù)在品種葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究

在某一地理范圍內(nèi)，葡萄的品種對葡萄酒的品質(zhì)起著關(guān)鍵作用。在傳統(tǒng)歐洲產(chǎn)區(qū)，如勃艮第產(chǎn)區(qū)，主要采用100%的單一葡萄品種釀酒，以特定的風(fēng)味為標(biāo)志吸引其愛好者。同時，有些產(chǎn)區(qū)為使葡萄酒香氣更加豐富，常使用多品種混合調(diào)配來達(dá)到最佳的口感，如教皇新堡產(chǎn)區(qū)。相反，各新興產(chǎn)區(qū)由于葡萄種植和葡萄酒生產(chǎn)歷史較短暫，對市場反應(yīng)敏感，葡萄品種被視為生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄酒的重要基礎(chǔ)，因此，保證品種葡萄酒的真實性也格外重要。近年來，1H-NMR技術(shù)已被用于品種葡萄酒的鑒別，本文總結(jié)了部分關(guān)于品種葡萄酒真實性鑒別的報道，如表2所示。在相同的地理范圍內(nèi)，不同品種的葡萄對葡萄酒的品質(zhì)具有一定的影響，釀制的葡萄酒也具有獨(dú)特的風(fēng)味[59-61]。

表2 1H-NMR技術(shù)在品種葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究Table 2 Application of 1H-NMR spectroscopy in the identification of the variety of wine

續(xù)表2

Ali等[62]將1H-NMR技術(shù)與二維核磁共振技術(shù)相結(jié)合鑒別了雷司令和米勒葡萄酒，數(shù)據(jù)顯示雷司令葡萄酒中的兒茶素、咖啡酸、纈氨酸、脯氨酸、2,3-丁二醇、蘋果酸和檸檬酸含量較高，而米勒葡萄酒中的槲皮素、白藜蘆醇、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、蘇氨酸、琥珀酸、沒食子酸、乙酸和乳酸含量較高。在Godelmann等[50]的葡萄酒研究中，利用1H-NMR技術(shù)，通過莽草酸、咖啡酸、2,3-丁二醇、甘油和乙醇對品種葡萄酒進(jìn)行了鑒別分類，總體鑒別準(zhǔn)確率為71%，分析顯示黑比諾和白比諾/灰比諾葡萄酒的莽草酸含量較低，此外，在該研究中發(fā)現(xiàn)咖啡酸的含量主要和葡萄酒釀造技術(shù)有關(guān)，與葡萄品種無關(guān)。發(fā)酵產(chǎn)物乙醇和發(fā)酵副產(chǎn)物甘油在不同品種的葡萄酒中存在的范圍相似，不能作為葡萄品種的鑒別因素。Pereira等[63]利用1H-NMR技術(shù)對成熟釀酒葡萄的果皮和漿果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)可溶性糖、氨基酸和有機(jī)酸含量在同一產(chǎn)地不同品種葡萄樣品中存在差異，進(jìn)而會導(dǎo)致釀造的葡萄酒也存在口感、風(fēng)味的差異。

在利用化學(xué)成分鑒別品種葡萄酒真實性的研究中，樣品數(shù)據(jù)信息龐大，很難直觀地對結(jié)果進(jìn)行分類，但采取1H-NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法能實現(xiàn)對葡萄酒復(fù)雜化學(xué)成分的全面分析與整合，進(jìn)而實現(xiàn)品種葡萄酒真實性的準(zhǔn)確鑒別研究。Son等[47]采用1H-NMR技術(shù)研究了不同品種的葡萄酒，通過PCA和PLS-DA，顯著區(qū)分了澳大利亞赤霞珠和設(shè)拉子葡萄酒。在Fan Shuangxi等[64]的研究中，分析了3 種紅葡萄酒（赤霞珠、玫瑰蜜、蛇龍珠）和3 種白葡萄酒（白玉霓、龍眼、霞多麗）。采用PCA和LDA方法結(jié)合對葡萄酒進(jìn)行了建模分析，通過內(nèi)部一次性交叉驗證實驗和外部重復(fù)雙隨機(jī)交叉驗證實驗，證實了3 種紅葡萄酒的平均正確分類率分別為82%和83%，3 種白葡萄酒分別為94%和90%，驗證了PCA/LDA模型的有效性。Son等[65]將葡萄酒的1H-NMR譜圖簡化為1×10-6mol/L的光譜區(qū)域，并除去了水、乙醇、3-(三甲基硅烷基)-1-丙磺酸鈉鹽對應(yīng)的光譜區(qū)，通過光譜面積歸一化結(jié)合PCA和PLS-DA法成功鑒別了韓國產(chǎn)4 種葡萄酒，分析表明，巨峰葡萄酒的甘油、2,3-丁二醇、琥珀酸和乙醇含量較高，貝利A麝香葡萄酒的檸檬酸含量較高，早期坎貝爾葡萄酒的丙氨酸濃度較高，而Meoru葡萄酒的脯氨酸、蘋果酸和膽堿含量較高。

另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)設(shè)拉子葡萄酒中含量最高的是龍膽酸（質(zhì)量濃度（27.87±0.10）mg/L）和沒食子酸（質(zhì)量濃度（20.34±0.37）mg/L），含量最低的是原兒茶酸（質(zhì)量濃度（1.04±0.02）mg/L）和綠原酸（質(zhì)量濃度（1.49±0.02）mg/L）；而赤霞珠和蛇龍珠葡萄酒中含量最高的是ρ-羥基苯甲酸（質(zhì)量濃度（30.29±0.33）、（18.75±0.17）mg/L）和沒食子酸（質(zhì)量濃度（18.72±0.02）、（13.33±0.20）mg/L），含量最低的是原兒茶酸（質(zhì)量濃度（0.83±0.01）、（0.76±0.04）mg/L）和阿魏酸（質(zhì)量濃度（1.27±0.05）、（1.06±0.04）mg/L）[66]。

1.3 1H-NMR技術(shù)在年份葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究

葡萄的品質(zhì)是葡萄酒質(zhì)量的重要決定因素，而葡萄的品質(zhì)受外界氣象因子（溫度、光照和水分等）影響，氣象因子每年會有不規(guī)律的變化，導(dǎo)致每年葡萄的品質(zhì)不同，不同年份葡萄釀制的葡萄酒品質(zhì)和特征也不同，最終引起葡萄酒的差異[67]。

不同年份的葡萄酒在實驗分析時所檢測到的化學(xué)成分具有不同程度的差異，通過化學(xué)成分的差異可以將不同年份的葡萄酒進(jìn)行區(qū)分。Godelmann等[50]用1H-NMR測定了318 份2008年葡萄酒樣品和265 份2009年葡萄酒樣品，通過分析樣品中有機(jī)酸、氨基酸、糖類、酚類等得出2008年和2009年的年份正確鑒別率為97%和96%。Ali等[62]將1H-NMR技術(shù)應(yīng)用于葡萄酒的測定，研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸、苯丙氨酸、檸檬酸、蘋果酸和較高含量的酚類化合物主要出現(xiàn)在2006年的葡萄酒中，而纈氨酸、脯氨酸、丙氨酸和琥珀酸等有機(jī)酸主要出現(xiàn)在2007年的葡萄酒中。Laghi等[68]研究了意大利2010—2012年的葡萄酒，分析1H-NMR圖譜發(fā)現(xiàn)不同年份葡萄酒中天冬氨酸、脯氨酸和纈氨酸、2-甲基丁醇和苯乙醇、反式咖啡酸含量有差異。在葡萄酒的多種成分中，酚類是葡萄酒的骨架物質(zhì)，影響葡萄酒的色澤、口感和香氣，不同年份的葡萄因氣候、環(huán)境等影響酚類含量不同，因此，根據(jù)葡萄酒中酚類含量的差別可以區(qū)分同一品種不同年份的葡萄酒并為年份葡萄酒的鑒別工作提供一個方向。Anastasiadi等[69]對希臘2005年和2006年的葡萄酒進(jìn)行研究，采用吸附樹脂XAD-4從樣品中提取酚類化合物，通過1H-NMR技術(shù)分析顯示2005年葡萄酒的酚類濃度較低，分析可能是在2005年收獲葡萄時的強(qiáng)降雨使葡萄含水量偏高進(jìn)而導(dǎo)致葡萄中酚類濃度偏低。

葡萄酒成分復(fù)雜，僅使用單一檢測技術(shù)很難實現(xiàn)對其年份真實性的準(zhǔn)確鑒別，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法對其進(jìn)行分析能夠達(dá)到更好的鑒別。Lee等[70]采用1H-NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，研究了葡萄收獲年份對葡萄酒的影響，PCA結(jié)果顯示，來自同一葡萄園相同酵母株釀造的不同年份的Meoru葡萄酒中2,3-丁二醇、乳酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、膽堿和多酚含量有明顯的差別，研究發(fā)現(xiàn)，2006年葡萄酒中脯氨酸、乳酸和多酚的含量明顯多于2007年的葡萄酒。Pereira等[71]利用1H-NMR技術(shù)結(jié)合歷年氣象數(shù)據(jù)探究了不同采摘時間對葡萄中所含化合物的影響，通過PLS分析區(qū)分了2002年、2003年和2004年的葡萄酒，研究表明，與2003年和2004年相比，2002年葡萄酒中有機(jī)酸和蔗糖的含量較高，葡萄糖、果糖和氨基酸的含量較低。Consonni等[72]對阿馬羅尼葡萄酒進(jìn)行了1H-NMR檢測，結(jié)合多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)了不同年份葡萄酒中的化學(xué)成分含量存在差異，年份較久的樣本中乳酸含量相對偏高，多酚含量較低。

1H-NMR技術(shù)在年份葡萄酒鑒別中的應(yīng)用匯總?cè)绫?所示。

表3 1H-NMR技術(shù)在年份葡萄酒鑒別中的應(yīng)用研究Table 3 Application of 1H-NMR spectroscopy in the identification of the vintage of wine

1.4 1H-NMR技術(shù)在葡萄酒中葡萄糖和乙醇鑒別中的應(yīng)用研究

生產(chǎn)商通過添加果葡糖漿、甘油等來增加干浸物含量，同時加入酒精、色素、酸度調(diào)節(jié)劑和單寧等添加劑進(jìn)行勾兌，生產(chǎn)出理化指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)要求的葡萄酒，達(dá)到以次充好、以假亂真的目的，損害了消費(fèi)者利益。葡萄酒的生產(chǎn)和貿(mào)易需要較高成本，這使其容易被摻假從而降低成本，進(jìn)而獲得更高的利潤[73]。例如，在發(fā)酵前或發(fā)酵過程中未經(jīng)授權(quán)添加糖或濃縮葡萄汁，以增加天然乙醇含量，提升葡萄酒的價值，從而達(dá)到更高的市場價格[74]。Imparato等[75]開發(fā)了一種使用1H-NMR技術(shù)分析程序來鑒定摻雜葡萄糖漿紅酒的方法。

葡萄酒生產(chǎn)釀造過程涉及到不同的酚類化合物（如沒食子酸、花青素、兒茶素、山柰酚、咖啡酸、白藜蘆醇等）。其中，花青素與葡萄酒生產(chǎn)釀造關(guān)系尤為緊密，它是產(chǎn)生紅酒顏色的主要物質(zhì)。在意大利的釀酒工藝中，通常將葡萄酒與富含花青素的葡萄酒混合來增加其色澤，但在一些國家，這被認(rèn)作是一種葡萄酒造假行為。Ferrari等[76]采用1H-NMR技術(shù)來區(qū)分摻入黑米中提取的花青素和葡萄自身花青素的葡萄酒，該研究結(jié)合Wilma-D算法模型得到了大于95%的分類效率，證實了1H-NMR技術(shù)加上多元統(tǒng)計分析方法能夠高效識別出摻假花青素的葡萄酒，研究人員還發(fā)現(xiàn)在花青素的光譜化學(xué)位移處，摻入不同來源花青素樣品的光譜存在一些差異。

綜上，在利用1H-NMR技術(shù)鑒別葡萄酒真實性的研究中，氨基酸（蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸）、有機(jī)酸（乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸）、醇類（甘油、2,3-丁二醇）、糖類（葡萄糖、蔗糖、果糖）、酚類（沒食子酸）和膽堿是產(chǎn)地、品種和年份葡萄酒真實性鑒別所共有的特征成分。其中存在的主要差別如表4所示：1）氨基酸類中瓜氨酸、賴氨酸、γ-氨基丁酸是產(chǎn)地葡萄酒特有的鑒別成分，天冬氨酸和酪氨酸是年份葡萄酒特有的鑒別成分；2）有機(jī)酸類中產(chǎn)地葡萄酒鑒別特征成分為β-D-葡萄糖醛酸、丙二酸和延胡索酸，品種葡萄酒鑒別特征成分為莽草酸，年份葡萄酒鑒別特征成分不含乙酸；3）醇類中丁二醇、異戊醇、異丁醇是產(chǎn)地葡萄酒鑒別成分所獨(dú)有的，2-苯乙醇、甲醇、乙醇和甘油在年份葡萄酒鑒別成分中未被發(fā)現(xiàn)；4）糖類中海藻糖和半乳糖是年份葡萄酒鑒別的特征成分；5）酚類中產(chǎn)地葡萄酒鑒別一般用花青素含量的差異進(jìn)行分類，品種葡萄酒鑒別成分多為兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山柰酚和白藜蘆醇，年份葡萄酒中的特征成分為多酚、丁香酸、反式咖啡酸、對羥基肉桂酸、反式白藜蘆醇和阿魏酸。此外，產(chǎn)地葡萄酒鑒別成分中提到了酯類的作用，品種和年份葡萄酒中未提及。

表4 產(chǎn)地、品種和年份葡萄酒鑒別成分對比Table 4 Comparison of wine components used for identification of the geographical origin, variety and vintage of wine

2 結(jié) 語

1H-NMR技術(shù)在葡萄酒鑒別應(yīng)用中具有無偏向性、無損傷性和非選擇性；無需對樣品進(jìn)行預(yù)處理和預(yù)篩選，避免微量成分的丟失；可設(shè)計編輯多種檢測程序，實驗方法靈活多樣；能提供豐富的樣品結(jié)構(gòu)信息等獨(dú)特的優(yōu)勢。利用1H-NMR技術(shù)分析葡萄酒的化學(xué)成分，可作為鑒別產(chǎn)地、品種和年份葡萄酒真實性的有效工具，再結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法可以使葡萄酒真實性鑒別達(dá)到更高的準(zhǔn)確率，提高葡萄酒真實性鑒別的可靠性。但是也要清醒地認(rèn)識到針對1H-NMR技術(shù)的葡萄酒真實性研究還處于初始階段，目前還存在以下情況：1）葡萄酒樣品數(shù)量少且不完整，導(dǎo)致大部分葡萄酒中可以鑒別的化合物不明確，未來還需搜集大量樣品建立一個包含不同產(chǎn)地、種類、年份和品牌葡萄酒參數(shù)的完整1H-NMR數(shù)據(jù)庫；2）1H-NMR技術(shù)前處理方式單一，應(yīng)研發(fā)創(chuàng)新多樣前處理方式，對樣品中各類化合物和未知成分進(jìn)行分類處理檢測分析；3）數(shù)據(jù)分析方法存在一定局限性。改進(jìn)多元統(tǒng)計分析方法或與其他分析化學(xué)手段結(jié)合，使樣品分析鑒別更加精準(zhǔn)。隨著全球葡萄酒貿(mào)易的迅速發(fā)展以及研究范圍的擴(kuò)大，葡萄酒市場前景更加廣闊，建立客觀標(biāo)準(zhǔn)化的葡萄酒真實性鑒別體系，為我國葡萄酒市場提供安全的保障。